Name: assessing therapeutic angiogenesis in a murine model of hindlimb ischemia
Uploaded: 2019-06-08T13:00:00
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Nous remercions José Rino et Tânia Carvalho, respectivement responsables de l'installation de bioimagerie et d'histologie et de pathologie comparée de l'Instituto de Medicina Molecular Joo Lobo Antunes, respectivement. Nous remercions également Vyacheslav Sushchyk du Département d'Anatomie de la Nova Medical School/Faculdade de Ciências Médicas, Universidade Nova de Lisboa.
Référence de financement : projet financé par UID/IC/0306/2016 Fundaçao para a Ciência e a Tecnologia. Paula de Oliveira est soutenue par une bourse (SFRH/BD/80483/2011) de Fundaçao para a Ciência e Tecnologia.

Toutes les procédures relatives aux animaux sont conformes à la directive 2010/63/UE et ont été approuvées par l'Organe institutionnel de protection des animaux et autorisées par la DGAV, l'autorité compétente portugaise en matière de protection des animaux (numéro de licence 023861/2013)
CAUTION: Plusieurs des produits chimiques utilisés dans les protocoles sont toxiques et nocifs. Veuillez utiliser toutes les pratiques de sécurité appropriées et l'équipement de protection indi...

<ol>
	<li>Becker, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+I:+Definitions,+epidemiology,+clinical+presentation+and+prognosis.">Chapter I: Definitions, epidemiology, clinical presentation and prognosis.</a> European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 42 Suppl 2, S4-S12 (2011).</li><li>Fowkes, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+artery+disease:+epidemiology+and+global+perspectives.">Peripheral artery disease: epidemiology and global perspectives.</a> Nature Reviews Cardiology. 14 (3), 156-170 (2017).</li><li>Abu Dabrh, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+natural+history+of+untreated+severe+or+critical+limb+ischemia.">The natural history of untreated severe or critical limb ischemia.</a> Journal of Vascular Surgery. 62 (6), 1642-1651 (2015).</li><li>Lejay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+murine+model+of+sustainable+and+durable+chronic+critical+limb+ischemia+fairly+mimicking+human+pathology.">A new murine model of sustainable and durable chronic critical limb ischemia fairly mimicking human pathology.</a> European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 49 (2), 205-212 (2015).</li><li>Sprengers, R. W., Lips, D. J., Moll, F. L., Verhaar, M. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variations+in+surgical+procedures+for+hind+limb+ischaemia+mouse+models+result+in+differences+in+collateral+formation.">Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation.</a> European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).</li><li>Brevetti, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise-induced+hyperemia+unmasks+regional+blood+flow+deficit+in+experimental+hindlimb+ischemia.">Exercise-induced hyperemia unmasks regional blood flow deficit in experimental hindlimb ischemia.</a> Journal of Surgical Research. 98 (1), 21-26 (2001).</li><li>Ministro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-dose+ionizing+radiation+induces+therapeutic+neovascularization+in+a+pre-clinical+model+of+hindlimb+ischemia.">Low-dose ionizing radiation induces therapeutic neovascularization in a pre-clinical model of hindlimb ischemia.</a> Cardiovascular Research. 113 (7), 783-794 (2017).</li><li>Pereira, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+angiogenesis+induced+by+human+umbilical+cord+tissue-derived+mesenchymal+stromal+cells+in+a+murine+model+of+hindlimb+ischemia.">Therapeutic angiogenesis induced by human umbilical cord tissue-derived mesenchymal stromal cells in a murine model of hindlimb ischemia.</a> Stem Cell Research Therapy. 7 (1), 145 (2016).</li><li>Azaripour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+clearing+techniques+for+3D+imaging+of+tissues+with+special+reference+to+connective+tissue.">A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue.</a> Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).</li></ol>

Modèles Murine de CLI ont principalement consisté en ligature de l'artère fémorale juste distal à l'origine de la femoris profunda 4,6,6,7,8,9. Cela a montré de laisser la plupart de la circulation collatérale intacte, ce qui restaure le flux sanguin vers le membre dans les 7 jours 9. L'enlèvem...

La maladie artérielle périphérique (PAD) affecte principalement les membres inférieurs. La DAP est causée par l'athérosclérose, une obstruction artérielle qui peut causer une restriction grave du flux sanguin dans les membres inférieurs1. La claudication intermittente est la première manifestation de PAD et se réfère à la douleur musculaire lors de la marche. CLI est le stade le plus grave de PAD, étant diagnostiqué chez les patients qui montrent des douleurs de repos ischémiques, des ulcères ou de la gangrène2. Les patients atteints d'ICL ont un risque élevé d'amputation, surtout s'ils ne sont pas traités3. La revascularisation des membres inférieurs (soit par chirurgie ouverte, soit par une procédure endovasculaire) est actuellement le seul moyen d'obtenir le sauvetage des membres. Cependant, environ 30% des patients de CLI ne sont pas adaptés à ces procédures, pour des raisons qui incluent l'emplacement des lésions, le modèle de l'occlusion artérielle et la comorbidité étendue4,5. Par conséquent, de nouvelles thérapies sont nécessaires pour ces patients autrement intraitables, avec la promotion de l'angiogenèse étant la stratégie sous l'enquête plus intense.
Avant d'effectuer des essais chez l'homme, l'efficacité et l'innocuité de nouvelles thérapies in vivo doivent être prises en compte dans les modèles animaux. Plusieurs modèles ont été développés pour l'étude de CLI, principalement en induisant l'ischémie postérieure (HLI) chez les souris6,7,8,9,10. Cependant, ces modèles diffèrent dans plusieurs aspects, y compris la nature des artères qui sont ligated et / ou excisée et si les veines et les nerfs environnants sont disséqués ainsi6,7,8, 9,10. Pris ensemble, ces aspects affecteront la sévérité de la lésion ischémique-reperfusion chez chaque animal, ce qui rend les résultats difficiles à comparer. Par conséquent, il est essentiel de développer un protocole efficace dans lequel la procédure d'induire l'ischémie et l'évaluation de différentes cibles devraient être normalisées pour évaluer si une thérapie angiogénique donnée sera efficace. Un protocole expérimental conçu pour couvrir tous ces aspects fournirait une compréhension complète des mécanismes par lesquels les thérapies angiogéniques exercent leurs effets et une mesure de leur efficacité à chacun de leurs résultats. Deux ouvrages distincts récemment publiés par notre équipe sont un bon exemple11,12, dans lequel différentes approches pour induire l'angiogenèse thérapeutique ont été évaluées en utilisant le même protocole qui sera décrit avec plus de détails dans ce protocole.
L'objectif global de ce protocole est de décrire un modèle expérimental reproductible qui peut imiter les effets de CLI et jeter les bases expérimentales pour une évaluation complète des effets fonctionnels, histologiques et moléculaires de l'angiogénique putatif Agents.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:840px;" width="839">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:251px;">7500 Fast Real-Time PCR</td>
			<td style="width:235px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:223px;">Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Acetone</td>
			<td>Merk</td>
			<td>1000141000</td>
			<td>Reagent; Caution - highly flammable</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Adenosine</td>
			<td>Valdepharm</td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Atipamezole</td>
			<td>OrionPharma</td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Barium sulphate (Micropaque)</td>
			<td>Guebert</td>
			<td>8671404 (ref. Infarmed)</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Buprenorphine</td>
			<td>RichterPharma</td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Carl Zeiss Opmi-1 FC Surgical Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">cDNA RT2 PreAMP cDNA Synthesis kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td style="width:132px;">7335730</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Cryostat Leica CM</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>3050S</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">DAB peroxidase substrate kit</td>
			<td>DAKO;Vector Laboratories</td>
			<td>K3468</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">hydrogen peroxidase</td>
			<td>Merk</td>
			<td>1072090250</td>
			<td>Reagent; Caution - nocif</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">hydrophobic pen</td>
			<td>Dako</td>
			<td>411121</td>
			<td>Reagent; Caution - toxic</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Ketamidor</td>
			<td style="width:235px;">Richterpharma</td>
			<td>CN:580393,7 630/01/12 Dfvf</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Laser Doppler perfusion imager moorLDI2-HIR</td>
			<td style="width:235px;">MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, UK</td>
			<td>5710</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Leica DM2500 upright brightfield microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Medetor</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>037/01/07RFVPT</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>UN1230</td>
			<td>Reagent; Caution - toxic and highly flammable</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Papaverine</td>
			<td>Labesfal</td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Pentano Isso</td>
			<td>Merk</td>
			<td>1060561000</td>
			<td>Reagent; Caution - highly flammable</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Power SYBR&#174; Green</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td style="width:132px;">4309155</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Purified rat anti-mouse CD31</td>
			<td>Pharmingen</td>
			<td>550274</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">RNeasy Micro kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Surgic-Pro 6.0</td>
			<td>Medtronic (Coviden)</td>
			<td>VP733X</td>
			<td>Suture</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:251px;">VECTASTAIN ABC HRP Kit (Peroxidase, Rat IgG)</td>
			<td>Vectastain ABC kit; Vector Laboratories</td>
			<td>PK-4004</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Vicryl5.0/ Vicryl 6.0</td>
			<td>Medtronic (Covidien)</td>
			<td>UL202/ UL101</td>
			<td>Suture</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Zeiss PALM MicroBeam Laser Microdissection System</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy, Germany</td>
			<td>1023290916</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Stereotaxic microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Digital camera</td>
			<td>Linux</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing therapeutic angiogenesis in a murine model of hindlimb ischemia

L'ischémie critique des membres (ICL) est une affection grave qui entraîne un risque élevé d'amputation des membres inférieurs. En dépit de la revascularisation étant la thérapie d'or-standard, un nombre considérable de patients de CLI ne sont pas adaptés pour la revascularisation chirurgicale ou endovasculaire. Les thérapies angiogéniques émergent comme option pour ces patients mais sont actuellement encore à l'étude. Avant l'application chez l'homme, ces thérapies doivent être testées dans des modèles animaux et ses mécanismes doivent être clairement compris. Un modèle animal de l'ischémie postérieure (HLI) a été développé par la ligature et l'excision des artères et veines iliaques et fémorales externes distales chez les souris. Un panel complet d'essais a été assemblé pour évaluer les effets de l'ischémie et des thérapies angiogéniques putatives aux niveaux fonctionnel, histologique et moléculaire. Laser Doppler a été utilisé pour la mesure du débit et l'évaluation fonctionnelle de la perfusion. La réponse de tissu a été évaluée par l'analyse de la densité capillaire après coloration avec l'anticorps anti-CD31 sur des sections histologiques du muscle gastrocnemius et par la mesure de la densité collatérale de navire après diaphonization. L'expression des gènes angiogéniques a été quantifiée par RT-PCR ciblant des facteurs angiogéniques choisis exclusivement dans les cellules endothéliales (EC) après microdissection de capture de laser des muscles gastrocnemius de souris. Ces méthodes étaient sensibles en identifiant les différences entre les membres ischémiques et non ischémiques et entre les membres traités et non traités. Ce protocole fournit un modèle reproductible de CLI et un cadre pour tester les thérapies angiogéniques.

Utilisant le protocole décrit, les cellules souches mésenchymales de cordon ombilical et le rayonnement ionisant de bas-dose (LDIR) ont été examinés en tant que thérapies angiogéniques putatives 11,12. Des lectures de perfusion de Doppler de laser ont été obtenues avant l'induction d'ischémie et aux points de temps pré-spécifiés s'étendant immédiatement après l'induction d'ischémie à 45 jours post-ischémie. Les lectures de perfusion de tissu pa...

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Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia

Ici, un modèle expérimental critique d'ischémie de membre postérieur est présenté suivi d'une batterie de tests fonctionnels, histologiques et moléculaires pour évaluer l'efficacité des thérapies angiogéniques.

Évaluation de l'angiogenèse thérapeutique dans un modèle murine de l'ischémie hindlimb

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard ...

L’objectif global de cette expérience, notre modèle d’ischémie postérieur est d’éclairer l’expérience une base pour une évaluation complète des effets fonctionnels, histologiques et moléculaires des agents angiogéniques putatifs. Ce protocole permet d’obtenir une norme pour l’essai de thérapies angiogéniques possibles dans un modèle de petit animal avec le potentiel d’applications futures dans le contexte clinique. Comme la revascularisation n’est pas appropriée dans vingt à trente pour cent des patients critiques ischémie angiogenèse thérapeutique a émergé comme une nouvelle stratégie pour améliorer la profusion de sang au site ischémique.Ce protocole expérimental pourrait fournir une compréhension complète des mécanismes par lesquels les thérapies angiogéniques exercent leurs effets dans la mesure de leur efficacité à chacun de leurs résultats. Après avoir confirmé un manque de réponse au pincement des orteils chez une souris noire de six femelles C57 de 22 semaines, rasez les cheveux de l’arrière-plan droit et fixez l’animal dans la position dorsale à cubitus sur un coussin chauffant. Placez l’animal sous un microscope disséquant.Et utilisez une lame de scalpel chirurgicale numéro onze pour faire une incision cutanée d’un centimètre sur la cuisse de l’arrière droit. Blunt disséquer la graisse sous-cutanée pour exposer le faisceau neurovasculaire. Et utilisez des forceps pointus, des ciseaux à ressort et un porte-aiguilles ophtalmique pour ouvrir la gaine iléofémorale membranaire pour exposer les vaisseaux iliaques et fœmoraux externes distals.Après avoir disséqué et séparé l’artère et la veine du nerf, utilisez sept sutures de polypropylène nonabsorbable o pour ligate l’artère et la veine fœmorales distales et l’artère et la veine iliaques externes distales. L’identification de l’artère iliaque externe distale et la ligature et l’excision de l’artère et des veines iliaques et fémorales externes distales sont critiques pour le succès de la procédure. Utilisez les ciseaux à ressort pour transecter le segment de l’artère iliofemorale et les veines entre les nœuds distal et proximal.Et fermez l’incision avec une suture absorbable. Ensuite, inter-péritonéally fournir une solution antisedative dans l’animal et retourner la souris dans sa cage d’origine avec surveillance jusqu’à la récupération complète. Pour récolter les muscles gastrocnemius, retirez la peau des deux limites postérieures.Et utilisez l’écouvillon de coton pour séparer la peau des muscles. Tenant le tendon d’Achille, utilisez les ciseaux à ressort pour séparer le muscle du tibia et du péroné jusqu’à l’articulation du genou. Et séparer les biceps femoris du muscle gastrocnemius.Utilisez les ciseaux à ressort pour couper les insertions du muscle gastrocnemius au niveau des articulations du genou. Et utilisez 10% trigasanth pour positionner les muscles récoltés dans une orientation transversale sur un petit disque de liège. Ensuite, casser congeler les spécimens dans l’isopentane refroidi à l’azote liquide pour moins 80 degrés Celsius de stockage.Pour la capture au laser de microdissection capillaire, après avoir obtenu 12 sections de micromètres des spécimens musculaires, fixer les tissus aux toboggans en 50 millilitres d’acétone pur refroidi pendant cinq minutes à moins vingt degrés Celsius. Après séchage à l’air et encercler chaque spécimen avec un stylo hydrophobe. Et réhydrater les échantillons avec deux chlorure de sodium molaire dans PBS à quatre degrés Celsius.À la fin de la réhydratation, étiquetez les échantillons avec l’anticorps primaire approprié d’intérêt à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Suivi de deux lavages de trois minutes dans deux chlorures de sodium molaire frais en PBS par lavage. Après le deuxième lavage, étiquetez les sections avec un anticorps secondaire approprié pendant trente minutes à quatre degrés Celsius suivi de deux lavages dans le chlorure de sodium dans PBS comme démontré.Ensuite, étiquetez les échantillons avec avidin conjugué complexe de peroxydase pendant trente minutes à quatre degrés Celsius. Suivi d’un lavage et de cinq minutes d’étiquetage avec substrat de peroxydée DAB. À la fin de l’incubation, déshydrater les tissus dans la glace séquentielle froide 90% éthanol et 100% emersions d’éthanol.Ensuite, utilisez un système de microdissection ultérieure, équipé d’un laser à l’état solide de 355 nanomètres pour disséquer 10 000 capillaires par souris et catapulter les capillaires disséqués dans un bouchon adhésif à tube de microfuge. Comme illustré, une perte complète de perfusion de limite postérieur est observée immédiatement après l’induction d’ischémie d’arrière-point. L’évaluation quantitative du flux sanguin, exprimée en tant que rapport de l’ISC au membre de NISC, a démontré la perfusion significativement améliorée de sang de membre chez les souris exposées au stimulus pro-angiogenic aux jours 15 et 45 post-HLI.La quantification des capillaires positifs CD31 dans les sections histologiques des sections de tissu musculaire gastrocnemius montre que la densité capillaire est plus grande dans le membre ischémique par rapport au membre non ischémique. Comme prévu. Mais cet effet est encore amplifié après traitement avec l’agent pro-angiogénique.La densité collatérale du vaisseau augmente également constamment dans le membre ischémique et cette augmentation est significativement plus élevée après exposition avec le stimulus pro-angiogénique. L’analyse inverse de réaction en chaîne de polymésase de transcriptase de l’expression pro-angiogenic de gène dans les cellules endothéliales positives de CD31 démontre une variation claire dans l’expression de gène entre les souris exposées ou non à l’agent pro-angiogenic. Il est important d’utiliser une aiguille ophtalmique plus ancienne pour ouvrir la gaine iliofemorale membranaire pour éviter la déchirure de l’artère et de la veine pendant la dissection du vaisseau.Le vaisseau réagit à l’ischémie postérieure dans les mesures de perfusion basées sur le doppler laser et la quantification histologique de la densité capillaire du vaisseau nous permet d’évaluer l’angiogenèse.

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