Name: assessing therapeutic angiogenesis in a murine model of hindlimb ischemia
Uploaded: 2019-06-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia at JoVE.com

אנו מודים לחוסה רינו ולטיאניה קרבלהו, ראשי המכון הביודמיה והמעבדה לפתולוגיה של היסטולוגיה והשוואתי של המכון המולקולרי לובו אנטז, בהתאמה. אנחנו גם מודים ויאצ Sushchyk מהמחלקה לאנטומיה של בית הספר לרפואה של נובה/Faculdade דה Ciências מדיאס, אוניברסידייד נובה דה ליסבון.
התייחסות מימון: פרויקט ממומן על ידי UID/IC/0306/2016 הדיווה הטובה ביותר. פאולה דה אוליביירה נתמכת על ידי מלגת (SFRH/BD/80483/2011) מתוך הדיווה הישנה של האגודה.

כל הליכים בעלי חיים הם בהתאם הוראה 2010/63/האיחוד האירופי אושרה על ידי גוף בעלי חיים מוסדיים רווחה ומורשה על ידי DGAV הרשות המוסמכת פורטוגזית להגנת בעלי חיים (רישיון מספר 023861/2013)
התראה: חלק מהכימיקלים המשמשים בפרוטוקולים רעילים ומזיקים. אנא השתמש בכל נוהלי הבטיחות המתאימים וציוד...

<ol>
	<li>Becker, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+I:+Definitions,+epidemiology,+clinical+presentation+and+prognosis.">Chapter I: Definitions, epidemiology, clinical presentation and prognosis.</a> European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 42 Suppl 2, S4-S12 (2011).</li><li>Fowkes, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+artery+disease:+epidemiology+and+global+perspectives.">Peripheral artery disease: epidemiology and global perspectives.</a> Nature Reviews Cardiology. 14 (3), 156-170 (2017).</li><li>Abu Dabrh, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+natural+history+of+untreated+severe+or+critical+limb+ischemia.">The natural history of untreated severe or critical limb ischemia.</a> Journal of Vascular Surgery. 62 (6), 1642-1651 (2015).</li><li>Lejay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+murine+model+of+sustainable+and+durable+chronic+critical+limb+ischemia+fairly+mimicking+human+pathology.">A new murine model of sustainable and durable chronic critical limb ischemia fairly mimicking human pathology.</a> European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 49 (2), 205-212 (2015).</li><li>Sprengers, R. W., Lips, D. J., Moll, F. L., Verhaar, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progenitor+cell+therapy+in+patients+with+critical+limb+ischemia+without+surgical+options.">Progenitor cell therapy in patients with critical limb ischemia without surgical options.</a> Annals of Surgery. 247 (3), 411-420 (2008).</li><li>Lotfi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+more+relevant+hind+limb+model+of+muscle+ischaemia.">Towards a more relevant hind limb model of muscle ischaemia.</a> Atherosclerosis. 227 (1), 1-8 (2013).</li><li>Masaki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+gene+therapy+for+experimental+critical+limb+ischemia:+acceleration+of+limb+loss+by+overexpression+of+vascular+endothelial+growth+factor+165+but+not+of+fibroblast+growth+factor-2.">Angiogenic gene therapy for experimental critical limb ischemia: acceleration of limb loss by overexpression of vascular endothelial growth factor 165 but not of fibroblast growth factor-2.</a> Circulation Research. 90 (9), 966-973 (2002).</li><li>Limbourg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+postnatal+arteriogenesis+and+angiogenesis+in+a+mouse+model+of+hind-limb+ischemia.">Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia.</a> Nature Protocols. 4 (12), 1737-1746 (2009).</li><li>Hellingman, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variations+in+surgical+procedures+for+hind+limb+ischaemia+mouse+models+result+in+differences+in+collateral+formation.">Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation.</a> European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).</li><li>Brevetti, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise-induced+hyperemia+unmasks+regional+blood+flow+deficit+in+experimental+hindlimb+ischemia.">Exercise-induced hyperemia unmasks regional blood flow deficit in experimental hindlimb ischemia.</a> Journal of Surgical Research. 98 (1), 21-26 (2001).</li><li>Ministro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-dose+ionizing+radiation+induces+therapeutic+neovascularization+in+a+pre-clinical+model+of+hindlimb+ischemia.">Low-dose ionizing radiation induces therapeutic neovascularization in a pre-clinical model of hindlimb ischemia.</a> Cardiovascular Research. 113 (7), 783-794 (2017).</li><li>Pereira, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+angiogenesis+induced+by+human+umbilical+cord+tissue-derived+mesenchymal+stromal+cells+in+a+murine+model+of+hindlimb+ischemia.">Therapeutic angiogenesis induced by human umbilical cord tissue-derived mesenchymal stromal cells in a murine model of hindlimb ischemia.</a> Stem Cell Research Therapy. 7 (1), 145 (2016).</li><li>Azaripour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+clearing+techniques+for+3D+imaging+of+tissues+with+special+reference+to+connective+tissue.">A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue.</a> Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).</li></ol>

מודלים murine של CLI היו בעיקר באמצעות הארכה של עורק הירך בדיוק המרוחק למקור של הראש העמוק מוריס 4,5,6,7,8,9. זה הראה להשאיר את רוב המחזור הנלווה ללא פגע, אשר מחזיר את זרימת הדם אל האיבר בתוך 7...

מחלת עורקים היקפית (PAD) משפיעה בעיקר על הגפיים התחתונות. PAD נגרמת על ידי טרשת עורקים, חסם עורק שיכול לגרום להגבלה חמורה לזרימת הדם בגפיים התחתונות1. התפטרות לסירוגין הוא הביטוי הראשון של PAD ומתייחס כאב שרירים בעת הליכה. CLI הוא השלב החמור ביותר של PAD, להיות מאובחנים בחולים כי להראות כאבים מנוחה איסכמי, כיבים או נמק2. חולים עם CLI יש סיכון גבוה של קטיעה, במיוחד אם לא מטופל3. הגפיים התחתונות revascularization (או על ידי ניתוח פתוח או הליך אנדוכלי) היא כרגע הדרך היחידה להשיג הצלה איבר. עם זאת, בסביבות 30% מהחולים CLI אינם מתאימים הליכים אלה, מסיבות הכוללות את המיקום של נגעים, התבנית של סגר עורקים והיקף תחלואה נרחבת4,5. לכן, טיפולים חדשים נחוצים עבור אלה חולים שאינם ניתן לטיפול במקרים אחרים, עם קידום האנגיוגנזה להיות האסטרטגיה תחת חקירה אינטנסיבית יותר.
לפני בדיקה בבני אדם, את היעילות והבטיחות של טיפולים חדשים בvivo יש לשקול בדגמי חיות. מספר דגמים פותחו למחקר של CLI, בעיקר על ידי גרימת איסכמיה הגפיים האחרונות (hli) בעכברים6,7,8,9,10. עם זאת, מודלים אלה נבדלים במספר היבטים, כולל טבעו של העורקים המגורטים ו/או מרוטרים והאם הורידים והעצבים שמסביב מושלכות גם כן6,7,8, 9,10. יחד, היבטים אלה ישפיעו על חומרת הפציעה של איסכמיה-reperfusion בכל חיה, מה שהופך את התוצאות קשה להשוואה. לכן, זה קריטי לפתח פרוטוקול אפקטיבי שבו ההליך לגרום איסכמיה והערכה של מטרות שונות צריך להיות מתוקננת כדי להעריך אם טיפול אנגיוגנטי מסוים יהיה יעיל. פרוטוקול ניסיוני שנועד לכסות את כל ההיבטים הללו יספק הבנה מקיפה של המנגנונים שבהם טיפולים אנגיוגנטיים מפעילים את השפעתם ומידת יעילותם בכל אחת מהתוצאות. שתי יצירות נפרדות שפורסמו לאחרונה על ידי הצוות שלנו הם דוגמה טובה11,12, שבו גישות שונות כדי לגרום לאנגיוגנזה הטיפולית העריכו באמצעות אותו פרוטוקול אשר יתואר עם פרטים נוספים ב פרוטוקול.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לתאר מודל ניסיוני הניתן לחיקוי שיכול לחקות את ההשפעות של CLI ולהטיל את הבסיס הניסיוני להערכה מקיפה של ההשפעות תפקודית, היסטולוגית ומולקולרית של אנגיוגנטי. סוכנים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:840px;" width="839">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:251px;">7500 Fast Real-Time PCR</td>
			<td style="width:235px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:223px;">Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Acetone</td>
			<td>Merk</td>
			<td>1000141000</td>
			<td>Reagent; Caution - highly flammable</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Adenosine</td>
			<td>Valdepharm</td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Atipamezole</td>
			<td>OrionPharma</td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Barium sulphate (Micropaque)</td>
			<td>Guebert</td>
			<td>8671404 (ref. Infarmed)</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Buprenorphine</td>
			<td>RichterPharma</td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Carl Zeiss Opmi-1 FC Surgical Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">cDNA RT2 PreAMP cDNA Synthesis kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td style="width:132px;">7335730</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Cryostat Leica CM</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>3050S</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">DAB peroxidase substrate kit</td>
			<td>DAKO;Vector Laboratories</td>
			<td>K3468</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">hydrogen peroxidase</td>
			<td>Merk</td>
			<td>1072090250</td>
			<td>Reagent; Caution - nocif</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">hydrophobic pen</td>
			<td>Dako</td>
			<td>411121</td>
			<td>Reagent; Caution - toxic</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Ketamidor</td>
			<td style="width:235px;">Richterpharma</td>
			<td>CN:580393,7 630/01/12 Dfvf</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Laser Doppler perfusion imager moorLDI2-HIR</td>
			<td style="width:235px;">MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, UK</td>
			<td>5710</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Leica DM2500 upright brightfield microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Medetor</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>037/01/07RFVPT</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>UN1230</td>
			<td>Reagent; Caution - toxic and highly flammable</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Papaverine</td>
			<td>Labesfal</td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Pentano Isso</td>
			<td>Merk</td>
			<td>1060561000</td>
			<td>Reagent; Caution - highly flammable</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Power SYBR&#174; Green</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td style="width:132px;">4309155</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Purified rat anti-mouse CD31</td>
			<td>Pharmingen</td>
			<td>550274</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">RNeasy Micro kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Surgic-Pro 6.0</td>
			<td>Medtronic (Coviden)</td>
			<td>VP733X</td>
			<td>Suture</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:251px;">VECTASTAIN ABC HRP Kit (Peroxidase, Rat IgG)</td>
			<td>Vectastain ABC kit; Vector Laboratories</td>
			<td>PK-4004</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Vicryl5.0/ Vicryl 6.0</td>
			<td>Medtronic (Covidien)</td>
			<td>UL202/ UL101</td>
			<td>Suture</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Zeiss PALM MicroBeam Laser Microdissection System</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy, Germany</td>
			<td>1023290916</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Stereotaxic microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Digital camera</td>
			<td>Linux</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing therapeutic angiogenesis in a murine model of hindlimb ischemia

איסכמיה גפה קריטית (CLI) היא מצב חמור הכרוך בסיכון גבוה לקטיעה בגפיים התחתונות. למרות revascularization להיות טיפול בתקן זהב, מספר ניכר של מטופלים CLI אינם מתאימים או ניתוחי וכירורגי או אנדוסקולריזציה. טיפולים מגנטיים מתפתחים כאופציה למטופלים אלה, אך כיום הם עדיין תחת חקירה. לפני היישום בבני אדם, הטיפולים האלה חייבים להיבדק במודלים של בעלי חיים והמנגנון שלו חייב להיות מובן בבירור. מודל בעל חיים של איסכמיה הגוף (HLI) פותחה על ידי החיבור וכריתה של עורקי הירך החיצוניים ואת הוורידים ורידים בעכברים. פאנל מקיף של מבחנים התאספו כדי להעריך את ההשפעות של הטיפול באיסכמיה ובטיפולים אנגיוגנטיים בתוך הפונקציונליות, היסטולוגית ורמות מולקולריות. לייזר דופלר שימש למדידת הזרימה והערכה פונקציונלית של perfusion. תגובת רקמות הוערך על ידי ניתוח של צפיפות נימי לאחר הצביעת עם הנוגדן anti-CD31 על סעיפים היסטולוגית של שריר השריר, ועל ידי מדידה של צפיפות כלי הקיבול הנלווה לאחר דיאפחונזציה. ביטוי של הגנים של אנגיוגנטית היה ככמת על ידי RT-PCR מיקוד גורמים מבוססי אנגיוגנטיים שנבחרו באופן בלעדי בתאי האנדותל (ECs) לאחר לכידת לייזר הניתוח של שרירי השרירים של העכבר. שיטות אלו היו רגישות בזיהוי הבדלים בין האיברים האיסכמי והלא-איסכמי ובין הגפיים הבלתי מטופלות. פרוטוקול זה מספק מודל מחודש של CLI ומסגרת לבדיקת טיפולים אנגיוגנטיים.

באמצעות הפרוטוקול המתואר, בתאי גזע הטבור מסנצ'יאל וקרינה מייננת במינון נמוך (ldir) נבדקו כטיפולים אנגיוגנטיים של החבל 11,12. לייזר דופלר זלוף קריאות הושגו לפני האינדוקציה איסכמיה ו ב מראש מוגדר נקודות זמן החל מיד לאחר אינדוקציה איסכמיה כדי 45 ימים post-איסכמיה. קרי...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia at JoVE.com

Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia

כאן, המודל הניסיוני הטיפולי איסכמיה מוצג ואחריו סוללה של פונקציונלי, בדיקות היסטולוגית ומולקולרית כדי להעריך את האפקטיביות של טיפולים אנגיוגנטית.

הערכת אנגיוגנזה תרפויטי במודל של מורטין של איסכמיה החוצה

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard ...

המטרה הכוללת של ניסוי זה, מודל ה ischemia hindlimb שלנו היא להדליק את הניסוי בסיס להערכה מקיפה של ההשפעות התפקודיות, ההיסטולוגיות והמולקולריות של סוכנים אנגיוגניים putative. פרוטוקול זה שדות תקן לבדיקת טיפולים אנגיוגניים אפשריים במודל בעלי חיים קטנים עם פוטנציאל ליישומים עתידיים בהקשר הקליני. כמו revascularization אינו מתאים עשרים עד שלושים אחוזים של חולי איסכמיה קריטיים אנגיוגנזה טיפולית התפתחה כאסטרטגיה חדשנית לשיפור שפע הדם באתר איסכמי.פרוטוקול ניסיוני זה יכול לספק הבנה מקיפה של המנגנונים שבהם טיפולים אנגיוגניים להפעיל את השפעתם במידה של יעילותם בכל אחת מתוצאותיהם. לאחר שאישר חוסר תגובה לצביטת בוהן בעכבר שחור בן 22 שבועות C57 שש נקבה, לגלח את השיער מן hindlimb הימני ולהבטיח את החיה בדור כדי עמדת cubitus על כרית מחוממת. מניחים את החיה תחת מיקרוסקופ לנתח.ולהשתמש בלהב אזמל כירורגי מספר 11 כדי להפוך חתך עור סנטימטר אחד מעל הירך של hindlimb הימני. קהה לנתח את השומן התת עורי לחשוף את הצרור הנוירו-וסקולרי. ולהשתמש במטליות מחודדות, מספריים אביביים, ומחזיק מחט עיניים כדי לפתוח את נדן האילופרמורל הממברני כדי לחשוף את האיליאק החיצוני הדיסטלי וכלי הירך.לאחר ניתוח והפרדת העורק והווריד מהעצב, השתמשו בשבעה תפרי פוליפרופילן O שאינם ניתנים לניתוק כדי ללקט את עורק העובר והווריד הדיסטלי ואת עורק האיליאק החיצוני והווריד. זיהוי עורק האליגה החיצוני הדיסטלי והליגה והניתוס של האליג החיצוני הדיסטלי ועורק הירך והוורידים הם קריטיים להצלחת ההליך. השתמש במספריים האביב כדי לשנות את החלק של העורק iliofemoral וורידים בין הקשרים דיסטלי proximal.ולסגור את החתך עם תפר נספג. לאחר מכן, בין-צפי לספק פתרון antisedative לתוך החיה ולהחזיר את העכבר לכלוב הבית שלה עם ניטור עד החלמה מלאה. כדי לקצור את שרירי gastrocnemius, להסיר את העור משני hindlimbs.ולהשתמש ספוגית כותנה כדי להפריד את העור מן השרירים. מחזיק את גיד אכילס, להשתמש במספריים באביב כדי להפריד את השריר מן השוקה ואת השוקית עד מפרק הברך. ולהפריד את שרירי הירך מהשריר gastrocnemius.השתמש מספריים האביב לחתוך את ההכנסות של שריר gastrocnemius ברמת מפרק הברך. ולהשתמש 10% trigasanth למקם את השרירים שנקטפו בכיוון רוחבי על דיסק פקק קטן. לאחר מכן, הצמד להקפיא את הדגימות בחנקן נוזלי מקורר isopentane עבור מינוס 80 מעלות צלזיוס אחסון.עבור לכידת לייזר microdissection נימי, לאחר קבלת 12 חלקים מיקרומטר של דגימות השריר, לתקן את הרקמות לשקופיות ב 50 מיליליטר של אצטון טהור מקורר במשך חמש דקות במינוס עשרים מעלות צלזיוס. לאחר ייבוש האוויר ומקיף כל דגימה בעט הידרופובי. ולייבש מחדש את הדגימות עם שני נתרן כלורי טוחן ב- PBS בארבע מעלות צלזיוס.בסוף ההידרציה מחדש, סמן את הדגימות בנוגדן העיקרי המתאים לעניין בארבע מעלות צלזיוס במהלך הלילה. ואחריו שתי שלוש דקות שוטף טרי שני נתרן כלורי טוחן ב PBS לכל לשטוף. לאחר הכביסה השנייה, סמן את החלקים בנוגדן משני מתאים במשך שלושים דקות בארבע מעלות צלזיוס ואחריו שתי שטיפות בנתרן כלורי ב- PBS כפי שהוכח.לאחר מכן, סמן את הדגימות עם מתחם פרוקסידזה אצמוי אבידין במשך שלושים דקות בארבע מעלות צלזיוס. ואחריו שטיפה וחמש דקות של תיוג עם מצע peroxidase DAB. בסוף הדגירה, לייבש את הרקמות בקרח רציף קר 90% אתנול ו 100% אמרסי אתנול.לאחר מכן, השתמש במערכת microdissection מאוחר יותר, מצויד פולס למצב מוצק 355 לייזר ננומטר לנתח 10, 000 נימים לכל עכבר להזניק את נימי לנתח לתוך כובע דבק צינור microfuge. כפי שמודגם, אובדן מוחלט של תדלוק hindlimb נצפתה מיד לאחר אינדוקציה איסקימיה hindlimb. הערכה כמותית של זרימת הדם, שבאה לידי ביטוי כיחס בין ISC לאיבר NISC, הוכיחה חליטת דם גפיים משופרת באופן משמעותי בעכברים שנחשפו לגירוי הפרו-אנגיגני בימים 15 ו -45 לאחר HLI.כימות נימים חיוביים CD31 בחלקים היסטולוגיים של חלקי רקמת שריר gastrocnemius מראה כי צפיפות נימי גדול יותר באיבר איסכמי לעומת האיבר הלא איסכמי. כצפוי. אבל אפקט זה מוגבר עוד יותר לאחר הטיפול עם הסוכן pro-angiogenic.צפיפות כלי המשנה גם עולה באופן עקבי באיבר האיסכמי ועלייה זו גבוהה משמעותית לאחר החשיפה לגירוי הפרו-אנגיוגניים. ניתוח תגובת שרשרת פולימראז תעתיק הפוך של ביטוי גנים פרו-אנגיוגניים בתאי אנדותל חיוביים CD31 מדגים וריאציה ברורה בביטוי גנים בין עכברים שנחשפו או לא לסוכן הפרו-אנגיוגני. חשוב להשתמש במחט עיניים מבוגרת יותר כדי לפתוח את נדן iliofemoral קרום, כדי למנוע קריעת העורק והווריד במהלך ניתוח הכלי.הכלי מגיב איסכמיה hindlimb בהערכה בקלות על ידי מדידות זלוש מבוסס דופלר לייזר ואת כימות היסטולוגי של צפיפות כלי נימי מאפשר לנו להעריך את אנגיוגנזה.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

במודל עכבר של Assay את הקרנית Pocket לחקר אנגיוגנזה

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are ...

Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

הערכת שינויים teratogenic במודל דג הזברה של חשיפה אלכוהול עוברית

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

A Murine Closed-chest Model of Myocardial Ischemia and Reperfusion

דגם Murine סגור החזה של איסכמיה של שריר הלב reperfusion

Surgical trauma by thoracotomy in open-chest models of coronary ligation induces an immune response which modifies different mechanisms involved in ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

רשתית דגם ניתוק במכרסמים על ידי הזרקת subretinal של נתרן Hyaluronate

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Reproducable Paraplegia by Thoracic Aortic Occlusion in a Murine Model of Spinal Cord Ischemia-reperfusion

פרפלגיה Reproducable ידי בית חזה אבי העורקים ספיגה במודל Murine של חוט השדרה איסכמיה reperfusion

Background
Lower extremity paralysis continues to complicate aortic interventions. The lack of understanding of the underlying pathology has hindered ...

A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery

דגם של שריר הלב איסכמיה reperfusion הפגיעה Murine באמצעות קשירת של העורק השמאלי קדמי יורד

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms ...

Murine Model of Intestinal Ischemia-reperfusion Injury

דגם Murine של פגיעת המעיים איסכמיה reperfusion

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, ...

Methods for Acute and Subacute Murine Hindlimb Ischemia

שיטות חריפה subacute Murine Hindlimb איסכמיה

Peripheral artery disease (PAD) is a leading cause of cardiovascular morbidity and mortality in developed countries, and animal models that reliably ...

A Chronic Cardiac Ischemia Model in Swine Using an Ameroid Constrictor

מודל איסכמיה לב כרונית של החזירים באמצעות μ Ameroid

Cardiovascular disease remains the number one cause of mortality in the United States. There are numerous approaches to treating these diseases, but ...