Name: assessing therapeutic angiogenesis in a murine model of hindlimb ischemia
Uploaded: 2019-06-08T13:00:00
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Ringraziamo José Rino e Taria Carvalho, capi della struttura di bioimaging e Del Laboratorio di Patologia Materica e Patologia Comparata dell'Instituto de Medicina Molecular Joo Lobo Antunes, rispettivamente. Ringraziamo anche Vyacheslav Sushchyk del Dipartimento di Anatomia della Nova Medical School/Faculdade de Cioncias Médicas, Universidade Nova de Lisboa.
Finanziamento di riferimento: progetto finanziato da UID/IC/0306/2016 Fundao para a Ciància e a. Paula de Oliveira è sostenuta da una borsa di studio (SFRH/BD/80483/2011) di Fundao para a Ciància e Tecnologia.

Tutte le procedure sugli animali sono conformi alla direttiva 2010/63/EU e sono state approvate dall'Institutional Animal Welfare Body e autorizzate dalla DGAV, l'autorità competente portoghese per la protezione degli animali (numero di licenza 023861/2013)
AVVISO: Molte delle sostanze chimiche utilizzate nei protocolli sono tossiche e nocive. Si prega di utilizzare tutte le pratiche di sicurezza appropriate e attrezzature protettive personali (guanti, camice da laboratorio, pantaloni a figur...

<ol>
	<li>Becker, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+I:+Definitions,+epidemiology,+clinical+presentation+and+prognosis.">Chapter I: Definitions, epidemiology, clinical presentation and prognosis.</a> European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 42 Suppl 2, S4-S12 (2011).</li><li>Fowkes, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+artery+disease:+epidemiology+and+global+perspectives.">Peripheral artery disease: epidemiology and global perspectives.</a> Nature Reviews Cardiology. 14 (3), 156-170 (2017).</li><li>Abu Dabrh, A. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise-induced+hyperemia+unmasks+regional+blood+flow+deficit+in+experimental+hindlimb+ischemia.">Exercise-induced hyperemia unmasks regional blood flow deficit in experimental hindlimb ischemia.</a> Journal of Surgical Research. 98 (1), 21-26 (2001).</li><li>Ministro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-dose+ionizing+radiation+induces+therapeutic+neovascularization+in+a+pre-clinical+model+of+hindlimb+ischemia.">Low-dose ionizing radiation induces therapeutic neovascularization in a pre-clinical model of hindlimb ischemia.</a> Cardiovascular Research. 113 (7), 783-794 (2017).</li><li>Pereira, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+angiogenesis+induced+by+human+umbilical+cord+tissue-derived+mesenchymal+stromal+cells+in+a+murine+model+of+hindlimb+ischemia.">Therapeutic angiogenesis induced by human umbilical cord tissue-derived mesenchymal stromal cells in a murine model of hindlimb ischemia.</a> Stem Cell Research Therapy. 7 (1), 145 (2016).</li><li>Azaripour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+clearing+techniques+for+3D+imaging+of+tissues+with+special+reference+to+connective+tissue.">A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue.</a> Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).</li></ol>

I modelli Murine di CLI sono per lo più costituiti in legatura dell'arteria femorale appena distale all'origine della profunda femoris 4,5,6,7,8,9. Questo ha dimostrato di lasciare intatta la maggior parte della circolazione collaterale, che ripristina il flusso sanguigno all'arto entro 7 giorni 9. La...

La malattia arteriosa periferica (PAD) colpisce prevalentemente gli arti inferiori. La TORca è causata dall'aterosclerosi, un'ostruzione arteriosa che può causare gravi restrizioni al flusso sanguigno negli arti inferiori1. La claudicazione intermittente è la prima manifestazione del PAD e si riferisce al dolore muscolare quando si cammina. La CLI è lo stadio più grave del PAD, diagnosticata in pazienti che mostrano dolore ischemico di riposo, ulcere o cancrena2. I pazienti con CLI hanno un alto rischio di amputazione, soprattutto se non trattati3. La risanamento degli arti inferiori (sia per chirurgia aperta che per una procedura endovascolare) è attualmente l'unico modo per ottenere il recupero degli arti. Tuttavia, circa il 30% dei pazienti CLI non è adatto a queste procedure, per motivi che includono la localizzazione delle lesioni, il modello di occlusione arteriosa e l'ampia comorbilità4,5. Pertanto, sono necessarie nuove terapie per questi pazienti altrimenti non trattabili, con la promozione dell'angiogenesi è la strategia in un'indagine più intensa.
Prima di effettuare test nell'uomo, l'efficacia e la sicurezza delle nuove terapie in vivo devono essere considerate nei modelli animali. Diversi modelli sono stati sviluppati per lo studio di CLI, principalmente inducendo l'ischemia dell'arto posteriore (HLI) nei topi6,7,8,9,10. Tuttavia, questi modelli differiscono in diversi aspetti, tra cui la natura delle arterie che vengono legate e/o eccitate e se le vene e i nervi circostanti sono sezionati come pure6,7,8, 9,10. Nel loro insieme, questi aspetti influenzeranno la gravità della lesione ischemiera-reperfusione in ogni animale, rendendo i risultati difficili da confrontare. Pertanto, è fondamentale sviluppare un protocollo efficace in cui la procedura per indurre l'ischemia e la valutazione dei diversi obiettivi dovrebbe essere standardizzata per valutare se una determinata terapia angiogenica sarà efficace. Un protocollo sperimentale progettato per coprire tutti questi aspetti fornirebbe una comprensione completa dei meccanismi con cui le terapie angiogeniche esercitano i loro effetti e una misura della loro efficacia a ciascuno dei loro risultati. Due opere distinte recentemente pubblicate dal nostro team sono un buon esempio11,12, in cui diversi approcci per indurre l'angiogenesi terapeutica sono stati valutati utilizzando lo stesso protocollo che sarà descritto con più dettagli in questo protocollo.
L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di descrivere un modello sperimentale riproducibile in grado di imitare gli effetti della CLI e gettare le basi sperimentali per una valutazione completa degli effetti funzionali, istologici e molecolari della putagenia angiogenica Agenti.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:840px;" width="839">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:251px;">7500 Fast Real-Time PCR</td>
			<td style="width:235px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:223px;">Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Acetone</td>
			<td>Merk</td>
			<td>1000141000</td>
			<td>Reagent; Caution - highly flammable</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Adenosine</td>
			<td>Valdepharm</td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Atipamezole</td>
			<td>OrionPharma</td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Barium sulphate (Micropaque)</td>
			<td>Guebert</td>
			<td>8671404 (ref. Infarmed)</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Buprenorphine</td>
			<td>RichterPharma</td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Carl Zeiss Opmi-1 FC Surgical Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">cDNA RT2 PreAMP cDNA Synthesis kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td style="width:132px;">7335730</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Cryostat Leica CM</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>3050S</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">DAB peroxidase substrate kit</td>
			<td>DAKO;Vector Laboratories</td>
			<td>K3468</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">hydrogen peroxidase</td>
			<td>Merk</td>
			<td>1072090250</td>
			<td>Reagent; Caution - nocif</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">hydrophobic pen</td>
			<td>Dako</td>
			<td>411121</td>
			<td>Reagent; Caution - toxic</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Ketamidor</td>
			<td style="width:235px;">Richterpharma</td>
			<td>CN:580393,7 630/01/12 Dfvf</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Laser Doppler perfusion imager moorLDI2-HIR</td>
			<td style="width:235px;">MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, UK</td>
			<td>5710</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Leica DM2500 upright brightfield microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Medetor</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>037/01/07RFVPT</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>UN1230</td>
			<td>Reagent; Caution - toxic and highly flammable</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Papaverine</td>
			<td>Labesfal</td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Pentano Isso</td>
			<td>Merk</td>
			<td>1060561000</td>
			<td>Reagent; Caution - highly flammable</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Power SYBR&#174; Green</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td style="width:132px;">4309155</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Purified rat anti-mouse CD31</td>
			<td>Pharmingen</td>
			<td>550274</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">RNeasy Micro kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Surgic-Pro 6.0</td>
			<td>Medtronic (Coviden)</td>
			<td>VP733X</td>
			<td>Suture</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:251px;">VECTASTAIN ABC HRP Kit (Peroxidase, Rat IgG)</td>
			<td>Vectastain ABC kit; Vector Laboratories</td>
			<td>PK-4004</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Vicryl5.0/ Vicryl 6.0</td>
			<td>Medtronic (Covidien)</td>
			<td>UL202/ UL101</td>
			<td>Suture</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Zeiss PALM MicroBeam Laser Microdissection System</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy, Germany</td>
			<td>1023290916</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Stereotaxic microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Digital camera</td>
			<td>Linux</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing therapeutic angiogenesis in a murine model of hindlimb ischemia

L'ischemia degli arti critici (CLI) è una condizione grave che comporta un alto rischio di amputazione degli arti inferiori. Nonostante la risvascolarizzazione sia la terapia gold-standard, un numero considerevole di pazienti CLI non è adatto per la vascolarizzazione chirurgica o endovascolare. Le terapie angiogeniche stanno emergendo come opzione per questi pazienti, ma sono attualmente ancora in fase di studio. Prima dell'applicazione nell'uomo, tali terapie devono essere testate in modelli animali e i suoi meccanismi devono essere chiaramente compresi. Un modello animale di ischemia dell'animale (HLI) è stato sviluppato dalla legatura e dall'escissione delle arterie e delle vene esterne distale nei topi. È stato assemblato un gruppo completo di test per valutare gli effetti dell'ischemia e delle terapie angiogeniche putative a livello funzionale, istologico e molecolare. Laser Doppler è stato utilizzato per la misurazione del flusso e la valutazione funzionale della perfusione. La risposta dei tessuti è stata valutata dall'analisi della densità capillare dopo la colorazione con l'anticorpo anti-CD31 sulle sezioni istologiche del muscolo gastrocnemio e dalla misurazione della densità dei vasi collaterali dopo la diafonizzazione. L'espressione di geni angiogenici è stata quantificata da RT-PCR mirando a fattori angiogenici selezionati esclusivamente nelle cellule endoteliali (EC) dopo la microdissezione di cattura laser dai muscoli gastrocnemius dei topi. Questi metodi erano sensibili nell'identificare le differenze tra gli arti ischemici e non ischemici e tra gli arti trattati e non trattati. Questo protocollo fornisce un modello riproducibile di CLI e un quadro per testare le terapie angiogeniche.

Utilizzando il protocollo descritto, le cellule staminali mesenchymal del cordone ombelicale e le radiazioni ionizzanti a basse dosi (LDIR) sono state testate come terapie angiogeniche putative 11,12. Le letture della perfusione di Laser Doppler sono state ottenute prima dell'induzione dell'ischemia e a tempi pre-specificati che vanno da subito dopo l'induzione dell'ischemia a 45 giorni dopo l'ischemia. Le letture perfusione di tessuti di Doppler laser sono state...

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Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia

Qui viene presentato un modello sperimentale critico di ischemia dell'arto posteriore seguito da una batteria di test funzionali, istologici e molecolari per valutare l'efficacia delle terapie angiogeniche.

Valutazione dell'angiogenesi terapeutica in un modello Murine di Ischemia hindlimb

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard ...

L'obiettivo generale di questo esperimento, il nostro modello di ischemia hindlimb è quello di illuminare l'esperimento come base per una valutazione completa degli effetti funzionali, istologici e molecolari degli agenti angiogenici putativi. Questo protocollo eroga uno standard per il test di possibili terapie angiogeniche in un piccolo modello animale con il potenziale per applicazioni future nel contesto clinico. Poiché la rivascolarizzazione non è adatta nel venti-trenta per cento dei pazienti critici con ischemia, l'angiogenesi terapeutica è emersa come una nuova strategia per migliorare la profusione di sangue nel sito ischemico.Questo protocollo sperimentale potrebbe fornire una comprensione completa dei meccanismi attraverso i quali le terapie angiogeniche esercitano i loro effetti nella misura della loro efficacia in ciascuno dei loro risultati. Dopo aver confermato la mancanza di risposta al dito del piede in un topo femmina C57 nero di 22 settimane, radersi i capelli dall'arto posteriore destro e fissare l'animale nella posizione dorsale a cubito su un cuscinetto riscaldato. Posizionare l'animale al microscopio di sezionamento.E usa una lama chirurgica bisturi numero undici per fare un'incisione cutanea di un centimetro sulla coscia dell'arto posteriore destro. Sezionare contundente il grasso sottocutaneo per esporre il fascio neurovascolare. E usa pinzi appuntiti, forbici a molla e un portaaghi oftalmici per aprire la fodera ileofemorale membraneale per esporre i vasi iliac e femoral esterni distale.Dopo aver sezionato e separato l'arteria e la vena dal nervo, utilizzare sette suture di polipropilene non assorbibili per legare l'arteria e la vena femorale distale e l'arteria iliaca esterna distale e la vena. L'identificazione dell'arteria iliaca esterna distale e la legatura e l'escissione dell'arteria iliaca esterna distale e femorale e delle vene sono fondamentali per il successo della procedura. Usa le forbici a molla per trasliare il segmento dell'arteria iliofemorale e le vene tra i nodi distale e prossimale.E chiudere l'incisione con una sutura assorbibile. Quindi, fornire inter-peritonealmente soluzione antisedativa nell'animale e riportare il topo nella sua gabbia di casa con monitoraggio fino al pieno recupero. Per raccogliere i muscoli gastroclio, rimuovere la pelle da entrambi gli arti posteriori.E usa il batuffolo di cotone per separare la pelle dai muscoli. Tenendo il tendine d'Achille, utilizzare le forbici a molla per separare il muscolo dalla tibia e dalla perone fino all'articolazione del ginocchio. E separare il bicipite femoris dal muscolo gastrocnemio.Utilizzare le forbici a molla per tagliare gli inserimenti del muscolo gastrocnemio a livello dell'articolazione del ginocchio. E usa il 10%trigasanth per posizionare i muscoli raccolti con un orientamento trasversale su un piccolo disco di sughero. Quindi, snap congelare i campioni in azoto liquido raffreddato isopentane per meno 80 gradi Celsius stoccaggio.Per la cattura laser a microdisezione capillare, dopo aver ottenuto sezioni di 12 micrometri dei campioni muscolari, fissare i tessuti alle diapositive in 50 millilitri di acetone puro raffreddato per cinque minuti a meno venti gradi Celsius. Dopo l'essiccazione dell'aria e cerchiare ogni esemplare con una penna idrofobica. E reidratare i campioni con due cloruri di sodio molare in PBS a quattro gradi Celsius.Al termine della reidratazione, etichettare i campioni con l'anticorpo primario appropriato di interesse a quattro gradi Celsius durante la notte. Seguito da due lavaggi di tre minuti in cloruro di sodio molare fresco in PBS per lavaggio. Dopo il secondo lavaggio, etichettare le sezioni con un anticorpo secondario appropriato per trenta minuti a quattro gradi Celsius seguito da due lavaggi in cloruro di sodio in PBS come dimostrato.Successivamente, etichettare i campioni con complesso di perossidasi coniugato avidina per trenta minuti a quattro gradi celsius. Seguito da un lavaggio e cinque minuti di etichettatura con substrato di perossidasi DAB. Al termine dell'incubazione, disidratare i tessuti in ghiaccio freddo sequenziale al 90% di etanolo e al 100% di emersioni di etanolo.Quindi, utilizzare un successivo sistema di microdisezione, dotato di un laser a stato solido da 355 nanometri per sezionare 10.000 capillari per topo e catapultare i capillari della seziona in un cappuccio adesivo a tubo di microfugo. Come illustrato, una completa perdita di perfusione dell'arto posteriore si osserva immediatamente dopo l'induzione dell'ischemia dell'arto posteriore. La valutazione quantitativa del flusso sanguigno, espressa come rapporto tra isc e arto NISC, ha dimostrato una perfusione di sangue degli arti significativamente migliorata nei topi esposti allo stimolo pro-angiogenico ai giorni 15 e 45 post-HLI.La quantificazione dei capillari positivi cd31 nelle sezioni istologiche delle sezioni del tessuto muscolare gastrocnomio mostra che la densità capillare è maggiore nell'arto ischemico rispetto all'arto non ischemico. Come previsto. Ma questo effetto viene ulteriormente amplificato dopo il trattamento con l'agente pro-angiogenico.Anche la densità collaterale del vaso aumenta costantemente nell'arto ischemico e questo aumento è significativamente più elevato dopo l'esposizione con lo stimolo pro-angiogenico. L'analisi inversa della reazione a catena della transcriptasi polimerasi dell'espressione genica pro-angiogenica nelle cellule endoteliali positive del CD31 dimostra una chiara variazione nell'espressione genica tra topi esposti o meno all'agente pro-angiogenico. È importante utilizzare un ago oftalmico più vecchio per aprire la fodera iliofemorale membraneale per evitare lo strappi dell'arteria e della vena durante la dissezione del vaso.Il vaso risponde all'ischemia hindlimb nelle misurazioni perfusioni basate su doppler laser e la quantificazione istologica della densità capillare del vaso ci consente di valutare l'angiogenesi.

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