Name: assessing therapeutic angiogenesis in a murine model of hindlimb ischemia
Uploaded: 2019-06-08T13:00:00
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ホセ・リノとタニア・カルヴァーリョ、バイオイメージング施設とインスティトゥート・デ・メディチナ分子ジョアン・ロボ・アントゥンズの比較病理学研究所の責任者に感謝します。我々はまた、ノヴァ医科大学/ファカルダーデ・デ・シエンシアス・メディカス、ユニバーシダーデ・ノヴァ・デ・リスボアの解剖学科のヴィャチェスラフ・シュシチクに感謝します。
資金調達参照:UID/IC/0306/2016 Fundaçãoパラシエンシアeテノロジアによって資金提供されたプロジェクト。ポーラ・デ・オリベイラは、フンダサン・パラ・ア・シエンシア・エ・テクノロジアのフェローシップ(SFRH/BD/80483/2011)によってサポートされています。

すべての動物の手順は、指令2010/63/EUに準拠しており、機関動物福祉機関によって承認され、DGAV、動物保護のためのポルトガルの管轄当局(ライセンス番号023861/2013)によってライセンスされています
注意:プロトコルで使用される化学物質のいくつかは有毒で有害です。適切な安全対策や身の保護具(手袋、ラボコート、フルレングスパンツ、クローズドトーシューズ)をご?...

<ol>
	<li>Becker, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+I:+Definitions,+epidemiology,+clinical+presentation+and+prognosis.">Chapter I: Definitions, epidemiology, clinical presentation and prognosis.</a> European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 42 Suppl 2, S4-S12 (2011).</li><li>Fowkes, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+artery+disease:+epidemiology+and+global+perspectives.">Peripheral artery disease: epidemiology and global perspectives.</a> Nature Reviews Cardiology. 14 (3), 156-170 (2017).</li><li>Abu Dabrh, A. 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CLIのマウスモデルは、主にプロファンダフェモリス4、5、6、7、8、9の起源に遠位の大腿動脈のライゲーションで構成されている。これは、7日以内に四肢への血流を回復させる担保循環のほとんどをそのまま残すことを示しています 9. <sup class="x...

末梢動脈疾患(PAD)は主に下肢に影響を与える。PADは、アテローム性動脈硬化によって引き起こされ、下肢1の血流に厳しい制限を引き起こす可能性のある動脈閉塞である。断続的な閉塞はPADの最初の症状であり、歩行時の筋肉痛を指す。CLIはPADの最も重篤な段階であり、虚血性休息痛、潰瘍または壊疽2を示す患者で診断される。CLI患者は切断のリスクが高く、特に未治療の場合は3.下肢血管再建(開開手術または血管内処置のいずれか)は、現在、四肢の救済を達成する唯一の方法です。しかしながら、CLI患者の約30%は、病変の位置、動脈閉塞および広範な併存のパターンを含む理由から、これらの処置には適していない4、5。したがって、これらのそうでなければ治療不可能な患者に対しては新しい治療法が必要であり、血管新生の促進はより厳しい調査の下で戦略である。
ヒトでの試験の前に、生体内の新しい治療法の有効性と安全性を動物モデルで考慮する必要があります。いくつかのモデルは、主にマウス6、7、8、9、10の後肢虚血(HLI)を誘導することによって、CLIの研究のために開発された。しかし、これらのモデルは、ライゲーションおよび/または切除された動脈の性質、周囲の静脈および神経も解剖されるかどうかを含むいくつかの側面で異なる6、7、8、 9,10.これらの態様を組み合わせると、各動物の虚血再灌流損傷の重症度に影響を与え、結果の比較が困難になります。したがって、虚血を誘発する手順と異なる標的の評価を標準化し、所定の血管新生療法が有効であるかどうかを評価する効果的なプロトコルを開発することが重要である。これらすべての側面をカバーするように設計された実験プロトコルは、血管新生療法がそれらの効果を発揮するメカニズムと、それぞれの結果における有効性の尺度を包括的に理解することを提供するであろう。私たちのチームが最近発表した2つの異なる作品は、治療血管新生を誘導する異なるアプローチが、この中でより詳細に説明される同じプロトコルを使用して評価された良い例11、12です。プロトコル。
このプロトコルの全体的な目標は、CLIの効果を模倣し、プタジアル血管新生の機能的、刺激的および分子的効果の包括的な評価のための実験基盤を築くことができる再現可能な実験モデルを記述することですエージェント。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:840px;" width="839">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:251px;">7500 Fast Real-Time PCR</td>
			<td style="width:235px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:223px;">Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Acetone</td>
			<td>Merk</td>
			<td>1000141000</td>
			<td>Reagent; Caution - highly flammable</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Adenosine</td>
			<td>Valdepharm</td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Atipamezole</td>
			<td>OrionPharma</td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Barium sulphate (Micropaque)</td>
			<td>Guebert</td>
			<td>8671404 (ref. Infarmed)</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Buprenorphine</td>
			<td>RichterPharma</td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Carl Zeiss Opmi-1 FC Surgical Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">cDNA RT2 PreAMP cDNA Synthesis kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td style="width:132px;">7335730</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Cryostat Leica CM</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>3050S</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">DAB peroxidase substrate kit</td>
			<td>DAKO;Vector Laboratories</td>
			<td>K3468</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">hydrogen peroxidase</td>
			<td>Merk</td>
			<td>1072090250</td>
			<td>Reagent; Caution - nocif</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">hydrophobic pen</td>
			<td>Dako</td>
			<td>411121</td>
			<td>Reagent; Caution - toxic</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Ketamidor</td>
			<td style="width:235px;">Richterpharma</td>
			<td>CN:580393,7 630/01/12 Dfvf</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Laser Doppler perfusion imager moorLDI2-HIR</td>
			<td style="width:235px;">MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, UK</td>
			<td>5710</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Leica DM2500 upright brightfield microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Medetor</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>037/01/07RFVPT</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>UN1230</td>
			<td>Reagent; Caution - toxic and highly flammable</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Papaverine</td>
			<td>Labesfal</td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Pentano Isso</td>
			<td>Merk</td>
			<td>1060561000</td>
			<td>Reagent; Caution - highly flammable</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Power SYBR&#174; Green</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td style="width:132px;">4309155</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Purified rat anti-mouse CD31</td>
			<td>Pharmingen</td>
			<td>550274</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">RNeasy Micro kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Surgic-Pro 6.0</td>
			<td>Medtronic (Coviden)</td>
			<td>VP733X</td>
			<td>Suture</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:251px;">VECTASTAIN ABC HRP Kit (Peroxidase, Rat IgG)</td>
			<td>Vectastain ABC kit; Vector Laboratories</td>
			<td>PK-4004</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Vicryl5.0/ Vicryl 6.0</td>
			<td>Medtronic (Covidien)</td>
			<td>UL202/ UL101</td>
			<td>Suture</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Zeiss PALM MicroBeam Laser Microdissection System</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy, Germany</td>
			<td>1023290916</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Stereotaxic microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Digital camera</td>
			<td>Linux</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing therapeutic angiogenesis in a murine model of hindlimb ischemia

臨界四肢虚血(CLI)は、下肢切断のリスクが高い重篤な状態である。再血管化はゴールドスタンダード療法であるにもかかわらず、かなりの数のCLI患者は外科的または血管内血管血管の再形成に適していない。血管新生療法は、これらの患者のためのオプションとして出現していますが、現在調査中です。ヒトに適用する前に、これらの治療法は動物モデルでテストされなければならず、そのメカニズムを明確に理解する必要があります。後肢虚血(HLI)の動物モデルは、マウスにおける遠位外腸骨および大腿動脈および静脈のライゲーションおよび切除によって開発された。虚血および造語血管新生療法の効果を機能的、血管学的および分子レベルで評価するために、包括的なテストパネルが組み立てられました。レーザードップラーは、灌流の流量測定および機能評価に使用されました。組織応答は、胃腸筋の組織学的セクション上の抗CD31抗体で染色した後の毛細血管密度の分析とダイアフォニング後の担保血管密度の測定によって評価された。血管新生遺伝子の発現は、マウスの胃腸筋からのレーザー捕捉微分解後に内皮細胞(IC)において排他的に選択された血管新生因子を標的とするRT-PCRにより定量した。これらの方法は、虚血性四肢と非虚血性四肢と治療されていない四肢の間の違いを同定する際に敏感であった。このプロトコルは、CLIの再現可能なモデルと血管新生療法をテストするためのフレームワークを提供します。

記載されたプロトコルを用いて、臍帯間葉系幹細胞および低用量電分放射線(LDIR)は、栄養性血管新生療法11,12として試験した。レーザードップラー灌流の読み取り値は、虚血誘導の前および虚血誘発直後から虚血後45日までの事前に指定された時点で得られた。レーザードップラーによる組織灌流測定値は色分けされた画像として記録され、灌流は?...

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Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia

ここで、重要な後肢虚血実験モデルを提示し、その後に血管新生療法の有効性を評価する機能的、血管学的および分子試験の電池が続く。

ヒンドリム虚血のマウスモデルにおける治療血管新生の評価

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard ...

この実験の全体的な目標は、私たちの後肢虚血モデルは、推定血管新生剤の機能的、組織学的および分子的効果の包括的な評価のための基礎を実験に照らすることです。このプロトコルは、臨床文脈における将来の応用の可能性を持つ小さな動物モデルにおける可能な血管新生療法の試験のための標準をフィールド化する。血管新生は、重要虚血患者の20~30%では血管形成が適さないため、虚血部位における血液拡散を改善するための新たな戦略として浮上している。この実験的プロトコルは、血管新生療法がそれぞれの結果におけるその有効性の尺度においてその効果を発揮するメカニズムの包括的な理解を提供することができる。生後22週のC57ブラック6メスマウスでつま先ピンチへの応答の欠如を確認した後、右後肢から髪を剃り、加熱されたパッドの上の下肢からキュービタスの位置に動物を固定します。動物を解剖顕微鏡の下に置きます。そして、右後肢の太ももの上に1センチメートルの皮膚切開を行うために数11の外科メスの刃を使用してください。鈍い神経血管束を露出させるために皮下脂肪を解剖する。尖った鉗子、ばねはさみ、および眼科針ホルダーを使用して、膜状の回腸鞘を開き、遠位外腸骨および大腿骨血管を露出させる。神経から動脈と静脈を解剖して分離した後、7つのO非吸収性ポリプロピレン縫合糸を使用して、遠位大腿動脈および静脈および遠位外腸骨動脈および静脈をリゲートする。遠位外部腸骨動脈の同定と遠位外腸骨、大腿動脈および静脈の結紮および切除は、処置の成功にとって重要である。バネはさみを使用して、近位と近位の結び目の間の骨位動脈と静脈のセグメントを横断します。そして、吸収性縫合糸で切開を閉じます。その後、腹腔間で動物に抗鎮静液を送り込み、完全回復までモニタリングしてマウスを自宅のケージに戻します。胃頭筋を収穫するには、両方の後肢から皮膚を取り除く。そして、綿棒を使用して、筋肉から皮膚を分離します。アキレス腱を保持し、脛骨と脛骨から膝関節まで筋肉を分離するためにスプリングハサミを使用します。そして、上腕二頭筋を胃頭筋から分離する。春のはさみを使用して、膝関節レベルで胃腸筋の挿入をカットします。そして、小さなコルクディスク上の横方向に収穫した筋肉を配置するために10%トリガサンスを使用してください。その後、液体窒素で試料を凍結し、マイナス80°Cの貯蔵のためにイセプタンを冷却します。毛細管マイクロディセクショニングレーザーキャプチャの場合、筋肉標本の12マイクロメートルの切片を得た後、マイナス20度の摂氏で5分間冷却された純粋なアセトンの50ミリリットルのスライドに組織を固定します。空気乾燥後、疎水性ペンで各標本を丸で囲みます。そして、4°CでPBSで2モル塩化ナトリウムでサンプルを水分補給します。再水和の終了時に、目的の適切な一次抗体を一晩で摂氏4度で標識します。その後、PBSで1回の洗浄につき2回の塩化モルナトリウムを2回洗浄する。2回目の洗浄後、示されているように、4°Cで30分間適切な二次抗体でセクションにラベルを付け、続いてPBSで塩化ナトリウムに2回の洗浄を行います。次に、アビジン共役ペルオキシダーゼ複合体を摂氏4度で30分間ラベル付けします。続いて、DABペルオキシダーゼ基材で洗浄し、5分間の標識を行った。インキュベーションの終了時に、90%エタノールおよび100%エタノールエマースを順次氷冷で組織を脱水する。次いで、後のマイクロディスセクションシステムを使用し、固体355ナノメートルレーザーへのパルスを装備して、マウスあたり10,000個の毛細血管を解剖し、解剖毛細血管をマイクロフュージチューブ粘着キャップにカタパルトする。図示したように、後肢灌流の完全な喪失は、後肢虚血誘導直後に観察される。血流量の定量的評価は、ISCとNISCの肢の比率として表され、HLI後15日目および45日目にプロ血管新生刺激にさらされたマウスにおける四肢灌流の有意な増強を示した。胃頭筋組織切片の組織学的切片におけるCD31陽性毛細血管の定量化は、虚血性の血管密度が虚血性において非虚血性肢に対して大きいことを示す。予想通り。しかし、この効果は、プロ血管新生剤での治療後にさらに増幅される。副次的な血管密度も一貫して虚血性肢で増加し、この増加は、プロ血管新生刺激で曝露した後に有意に高い。CD31陽性内皮細胞におけるプロ血管新生遺伝子発現の逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応解析は、プロ血管新生剤に曝露されたマウスまたは非存在のマウス間の遺伝子発現の明確な変化を示す。血管解剖中に動脈と静脈の裂け目を避けるために、膜状の腸骨鞘を開くために古い眼科針を使用することが重要です。この血管は、レーザードップラーベースの灌流測定によって容易に評価された後肢虚血に応答し、毛細血管密度の組織学的定量化により血管形成を評価することができます。

Research

JoVE Journal

Medicine

A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

血管新生研究のための角膜ポケットアッセイのマウスモデル

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are ...

Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

胎児性アルコール暴露のゼブラフィッシュモデルの催奇形性変化を評価する

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

A Murine Closed-chest Model of Myocardial Ischemia and Reperfusion

心筋虚血再灌流障害のマウスクローズド胸モデル

Surgical trauma by thoracotomy in open-chest models of coronary ligation induces an immune response which modifies different mechanisms involved in ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

ヒアルロン酸ナトリウムの網膜下注入によるげっ歯類における網膜剥離モデル

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Reproducable Paraplegia by Thoracic Aortic Occlusion in a Murine Model of Spinal Cord Ischemia-reperfusion

脊髄虚血再灌流のマウスモデルにおいて胸部大動脈閉塞によって再現可能対麻痺

Background
Lower extremity paralysis continues to complicate aortic interventions. The lack of understanding of the underlying pathology has hindered ...

A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery

左前下の動脈の結紮を通して心筋虚血再灌流傷害のマウスモデル

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms ...

Murine Model of Intestinal Ischemia-reperfusion Injury

腸管虚血 - 再灌流傷害のマウスモデル

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, ...

Methods for Acute and Subacute Murine Hindlimb Ischemia

急性および亜急性ネズミ後肢虚血のための方法

Peripheral artery disease (PAD) is a leading cause of cardiovascular morbidity and mortality in developed countries, and animal models that reliably ...

A Chronic Cardiac Ischemia Model in Swine Using an Ameroid Constrictor

アメロイド収縮を使用して豚の慢性心筋虚血モデル

Cardiovascular disease remains the number one cause of mortality in the United States. There are numerous approaches to treating these diseases, but ...