Name: assessing therapeutic angiogenesis in a murine model of hindlimb ischemia
Uploaded: 2019-06-08T13:00:00
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우리는 호세 리노와 타니아 카르발호, 생물 이미징 시설의 머리와 인스티투토 드 메디치나 분자 주앙 로보 Antunes의 조직학 및 비교 병리학 연구소의 머리, 각각 감사합니다. 우리는 또한 노바 의과 대학 / Faculdade 드 Ciências 메디카스, 유니버시 다드 노바 드 리스보아의 해부학학과에서 Vyacheslav Sushchyk 감사합니다.
자금 지원 참조: UID/IC/0306/2016 Fundação 파라 a Ciência e a Tecnologia에 의해 투자된 프로젝트. 폴라 드 올리베이라는 Fundação 파라 아 시에엔시아 e 테크놀로지아에서 펠로우십(SFRH/BD/80483/2011)에 의해 지원됩니다.

모든 동물 절차는 지침 2010/63/EU에 따라 되며 기관 동물 복지 기구의 승인을 받았으며 포르투갈 동물 보호 당국인 DGAV의 허가를 받았습니다(면허 번호 023861/2013).
주의: 프로토콜에 사용된 몇몇 화학물질은 독성이 있고 유해합니다. 모든 적절한 안전 관행 및 개인 보호 장비(장갑, 실험실 코트, 전신 바지, 발가락 신발)를 사용하십시오.
1. 뒷다리 허혈의 뮤린 ?...

<ol>
	<li>Becker, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+I:+Definitions,+epidemiology,+clinical+presentation+and+prognosis.">Chapter I: Definitions, epidemiology, clinical presentation and prognosis.</a> European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 42 Suppl 2, S4-S12 (2011).</li><li>Fowkes, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+artery+disease:+epidemiology+and+global+perspectives.">Peripheral artery disease: epidemiology and global perspectives.</a> Nature Reviews Cardiology. 14 (3), 156-170 (2017).</li><li>Abu Dabrh, A. 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CLI의 뮤린 모델은 대부분 프로펀다 페모리스 4,5,6,7,8,9의 기원에 불과한 대퇴동맥의 결찰로 이루어져있다. 이것은 7 일 9안에 사지에 혈류량을 복구하는 부수적인 순환의 대부분을 그대로 두는 것을 보여주었습니다. 부수적 인 침?...

말초 동맥 질환 (PAD)은 주로 더 낮은 사지에 영향을 미칩니다. PAD는 동맥 경화증, 하반신의 혈류에 심각한 제한을 일으킬 수있는 동맥폐쇄에 의해 발생 1. 간헐적 파행은 PAD의 첫 번째 징후이며 걸을 때 근육 통을 말합니다. CLI는 PAD의 가장 가혹한 단계, 허혈성 나머지 통증, 궤양 또는 회지2를 보여주는 환자에서 진단되고. CLI를 가진 환자는 절단의 고위험이 있습니다, 치료되지 않는 경우에 특히3. 더 낮은 사지 revascularization (개천 수술 또는 혈관 내 절차에 의해) 현재 사지 회수를 달성하는 유일한 방법입니다. 그러나, CLI 환자의 약 30%는 병변의 위치, 동맥 폐색의 패턴 및 광범위한 동반변을 포함하는 이유로 이러한절차에 적합하지 않습니다 4,5. 그러므로, 혈관신생의 승진이 더 강렬한 조사에서 전략인 것과 더불어, 이 그렇지 않으면 치료할 수 없는 환자를 위해 새로운 치료가 필요합니다.
인간에서 테스트하기 전에 생체 내 새로운 치료법의 효과와 안전성을 동물 모델에서 고려해야 합니다. 몇몇 모형은 CLI의 연구 결과를 위해 개발되었습니다, 주로마우스6,7,8,9,10에있는 뒷다리 허혈 (HLI)를 유도하 여. 그러나, 이 모형은 결찰및/또는 절제되는 동맥의 본질 및 및 주위정맥 및 신경이 또한 6,7,8, 해부되는지 의 여부를 포함하여 몇몇 양상에서 다릅니다 9,10. 종합하면, 이러한 양상은 각 동물의 허혈 재관류 손상의 중증도에 영향을 미치므로 결과를 비교하기가 어렵습니다. 따라서, 허혈을 유도하는 절차와 다른 표적의 평가를 표준화하여 주어진 혈관신생 치료가 효과적일 지 여부를 평가하는 효과적인 프로토콜을 개발하는 것이 중요하다. 이러한 모든 측면을 커버하도록 설계된 실험 프로토콜은 혈관 신생 치료가 효과를 발휘하는 메커니즘과 각 결과에서 효능의 측정을 포괄적으로 이해할 수 있습니다. 우리 팀에 의해 최근에 간행된 2개의 명백한 일은 좋은 보기11,12,치료 혈관신생을 유도하기 위하여 다른 접근이 이것에 더 상세히 기술될 것이다 동일 프로토콜을 사용하여 평가되었다는 것을 프로토콜.
이 프로토콜의 전반적인 목표는 CLI의 효과를 모방하고 가양성 혈관 신생의 기능적, 적학적 및 분자 적 효과에 대한 포괄적 인 평가를위한 실험 기반을 마련 할 수있는 재현 가능한 실험 모델을 설명하는 것입니다. 에이전트.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:840px;" width="839">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:251px;">7500 Fast Real-Time PCR</td>
			<td style="width:235px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:223px;">Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Acetone</td>
			<td>Merk</td>
			<td>1000141000</td>
			<td>Reagent; Caution - highly flammable</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Adenosine</td>
			<td>Valdepharm</td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Atipamezole</td>
			<td>OrionPharma</td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Barium sulphate (Micropaque)</td>
			<td>Guebert</td>
			<td>8671404 (ref. Infarmed)</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Buprenorphine</td>
			<td>RichterPharma</td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Carl Zeiss Opmi-1 FC Surgical Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">cDNA RT2 PreAMP cDNA Synthesis kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td style="width:132px;">7335730</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Cryostat Leica CM</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>3050S</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">DAB peroxidase substrate kit</td>
			<td>DAKO;Vector Laboratories</td>
			<td>K3468</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">hydrogen peroxidase</td>
			<td>Merk</td>
			<td>1072090250</td>
			<td>Reagent; Caution - nocif</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">hydrophobic pen</td>
			<td>Dako</td>
			<td>411121</td>
			<td>Reagent; Caution - toxic</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Ketamidor</td>
			<td style="width:235px;">Richterpharma</td>
			<td>CN:580393,7 630/01/12 Dfvf</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Laser Doppler perfusion imager moorLDI2-HIR</td>
			<td style="width:235px;">MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, UK</td>
			<td>5710</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Leica DM2500 upright brightfield microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Medetor</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>037/01/07RFVPT</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>UN1230</td>
			<td>Reagent; Caution - toxic and highly flammable</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Papaverine</td>
			<td>Labesfal</td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Pentano Isso</td>
			<td>Merk</td>
			<td>1060561000</td>
			<td>Reagent; Caution - highly flammable</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Power SYBR&#174; Green</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td style="width:132px;">4309155</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Purified rat anti-mouse CD31</td>
			<td>Pharmingen</td>
			<td>550274</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">RNeasy Micro kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Surgic-Pro 6.0</td>
			<td>Medtronic (Coviden)</td>
			<td>VP733X</td>
			<td>Suture</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:251px;">VECTASTAIN ABC HRP Kit (Peroxidase, Rat IgG)</td>
			<td>Vectastain ABC kit; Vector Laboratories</td>
			<td>PK-4004</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Vicryl5.0/ Vicryl 6.0</td>
			<td>Medtronic (Covidien)</td>
			<td>UL202/ UL101</td>
			<td>Suture</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Zeiss PALM MicroBeam Laser Microdissection System</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy, Germany</td>
			<td>1023290916</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Stereotaxic microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Digital camera</td>
			<td>Linux</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing therapeutic angiogenesis in a murine model of hindlimb ischemia

중요한 사지 허혈은 (CLI) 더 낮은 사지 절단의 고위험을 수반하는 심각한 상태입니다. 금 표준 치료인 재혈관화에도 불구하고, 상당수의 CLI 환자는 외과적 또는 혈관내 혈관 혈관 혈관 혈관 화에 적합하지 않습니다. 혈관 신생 치료는 이 환자를 위한 선택권으로 나오고 있습니다 그러나 현재 조사되고 있습니다. 인간에 있는 신청의 앞에, 그 치료는 동물 모형에서 시험되어야 하고 그것의 기계장치는 명확하게 이해되어야 합니다. 뒷다리 허혈 (HLI)의 동물 모델은 쥐에서 말단 외부 불역및 대퇴 동맥 및 정맥의 결찰 및 절제에 의해 개발되었습니다. 기능, 기능학 및 분자 수준에서 허혈 및 가용 혈관 신생 요법의 효과를 평가하기 위해 포괄적 인 테스트 패널이 모였습니다. 레이저 도플러는 관류의 유량 측정 및 기능적 평가에 사용되었다. 조직 반응은 위장근육의 조직학적 섹션상에서 항 CD31 항체로 염색한 후 모세관 밀도를 분석하고 대각선 화 후 부수적인 혈관 밀도를 측정하여 평가하였다. 혈관신생 유전자의 발현은 쥐 위장관 근육으로부터 레이저 포획 미세내부를 포착한 후 내피 세포(ECs)에서만 선택된 혈관신생 인자를 대상으로 RT-PCR 표적화에 의해 정량화되었다. 이 방법은 허혈성 및 비 허혈성 사지 사이 그리고 처리되고 처리되지 않은 사지 사이 다름을 확인하는 에서 민감했습니다. 이 프로토콜은 CLI의 재현 가능한 모델과 혈관 신생 요법을 테스트하기위한 프레임 워크를 제공합니다.

기재된 프로토콜을 사용하여, 탯줄 중간엽 줄기 세포 및 저용량 이온화 방사선(LDIR)을 가설 혈관신생 요법으로 시험하였다 11,12. 레이저 도플러 관류 판독값은 허혈 유도 전과 허혈 유도 직후부터 허혈 후 45일까지 미리 지정된 시점에서 수득하였다. 레이저 도플러에 의한 조직 관류 수치는 색으로 구분된 이미지로 기록되었으며, 관류는 진한 파란색으로...

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Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia

여기에서, 중요한 뒷다리 허혈 실험 모형은 혈관 신생 치료의 효과를 평가하기 위하여 기능적, 적학 및 분자 시험의 건전지에 선행됩니다.

힌들보 리 허 혈의 뮤린 모델에서 치료 혈관 신생 평가

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard ...

이 실험의 전반적인 목표, 우리의 뒷다리 허혈 모델은 실험이 putative 혈관 유발 제의 기능, 히스토아제 및 분자 효과에 대한 포괄적 인 평가를위한 기초를 조명하는 것입니다. 이 프로토콜은 임상 맥락에서 향후 적용 가능성을 가진 작은 동물 모델에서 가능한 혈관 신생 요법의 시험을 위한 표준을 필드. 재혈관화는 중요한 허혈 환자의 20~30%에 적합하지 않기 때문에 치료 혈관신생은 허혈성 부위의 혈액 풍부를 개선하기 위한 새로운 전략으로 부상하고 있다.이 실험 프로토콜은 혈관 신생 요법이 각 결과에 대한 효능의 척도에서 효과를 발휘하는 메커니즘에 대한 포괄적 인 이해를 제공 할 수 있습니다. 22주 된 C57 블랙 6 여성 마우스에서 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, 오른쪽 뒷다리에서 머리를 면도하고 가열 패드에 큐비투스 위치에 등쪽의 동물을 고정. 동물을 해부 현미경 으로 놓습니다.그리고 오른쪽 뒷다리의 허벅지 에 1 센티미터 피부 절개를 만들기 위해 숫자 11 수술 메스 블레이드를 사용합니다. 무딘 신경 혈관 번들을 노출 피하 지방을 해부. 그리고 뾰족한 집게, 스프링 가위 및 안과 바늘 홀더를 사용하여 막막 에로피모페랄 칼집을 열어 말단 외부 장심 및 대퇴혈관을 노출시킵니다.동맥과 정맥을 신경에서 해부하고 분리한 후 7O 비흡수성 폴리프로필렌 봉합사를 사용하여 해골 대퇴동맥과 정맥 및 말단 외부 장모 동맥 및 정맥을 리칭하십시오. 말단 외부 장악 동맥의 식별과 결찰 및 절단 은 단상 외부 장악 및 대퇴 동맥 및 정맥의 결찰 및 절제는 절차의 성공에 매우 중요합니다. 스프링 가위를 사용하여 실피성 동맥과 정맥의 부분을 탈구와 근위 매듭 사이에 분리합니다.그리고 흡수 성 봉합사로 절개를 닫습니다. 그런 다음 복상 간 항용액을 동물에 전달하고 마우스를 전체 복구할 때까지 모니터링하여 홈 케이지로 반환합니다. 위장관 근육을 수확하려면 두 뒷다리에서 피부를 제거하십시오.그리고 면봉을 사용하여 피부와 근육을 분리합니다. 아킬레스 건을 들고, 스프링 가위를 사용하여 경골과 비골에서 무릎 관절까지 근육을 분리하십시오. 그리고 이두근 페모리스를 위트롬혈근육과 분리한다.스프링 가위를 사용하여 무릎 관절 수준에서 위장관 근육의 삽입을 자른다. 그리고 10%트리가산을 사용하여 수확한 근육을 작은 코르크 디스크의 횡방향에 배치합니다. 이어서, 액체 질소 냉각에 표본을 동결 하 고 영하 80도 저장에 대 한 opentane.모세관 미세 절 레이저 캡처의 경우 근육 표본의 12 마이크로 미터 섹션을 얻은 후, 영하 20도에서 5 분 동안 냉각 된 순수 아세톤의 50 밀리리터에서 슬라이드에 조직을 고정합니다. 공기 건조 후 소수성 펜으로 각 시편을 동그라미. 그리고 PBS에서 염화 나트륨 2개를 섭씨 4도에서 재수화합니다.재수분의 끝에서, 하룻밤 섭씨 4도에서 관심의 적절한 1 차 항체와 샘플을 라벨. 그 다음에 는 세척당 PBS에서 신선한 2개의 어금니 나트륨 염화나트륨으로 23분간 세척합니다. 두 번째 세척 후, 4섭씨에서 30분 동안 적절한 이차 항체로 섹션을 표시한 다음 PBS의 염화나트륨에 2개의 세척을 시연한다.다음으로, 4섭씨에서 30분 동안 아비딘 컨쥬게이드 페록시다제 복합체로 샘플을 라벨로 붙인다. DAB peroxidase 기판으로 세척 및 5 분 라벨링이 뒤따릅니다. 인큐베이션이 끝나면 순차적 얼음 에서 조직을 탈수하여 90%에탄올과 100% 에탄올 에머지에서 탈수합니다.이어서, 마우스당 10, 000개의 모세혈관을 해부하고 투석기당 10, 000개의 모세혈관을 마이크로후지 튜브 접착제 캡으로 해부하기 위해 355나노미터 레이저를 솔리드 상태로 펄스가 장착한 후 마이크로절시스템을 사용한다. 그림과 같이, 뒷다리 관류의 완전한 손실은 뒤다리 허혈 유도 후에 즉시 관찰됩니다. ISC와 NISC 사지의 비율로 표현된 혈류의 정량적 평가는 HLI 이후 15일과 45일에 친 혈관신생 자극에 노출된 마우스의 사지 혈액 관류가 현저하게 향상된 것으로 나타났다.위장혈증 근육 조직 섹션의 조직학적 섹션에서 CD31 양성 모세혈관의 정량화는 모세관 밀도가 허혈성 대 비 허혈성 사지에서 더 크다는 것을 보여줍니다. 예상대로. 그러나 이 효력은 프로 혈관신생 에이전트를 가진 처리 후에 추가 증폭됩니다.부수적인 혈관 밀도는 또한 허혈성 사지에 있는 일관되게 증가하고 이 증가는 친 혈관신생 자극을 가진 노출 후에 상당히 높습니다. CD31 양성 내피 세포에서 프로 혈관신생 유전자 발현의 역전사 중합체 연쇄 반응 분석은 프로 혈관신생 제에게 노출되거나 그렇지 않은 마우스 간의 유전자 발현의 명확한 변화를 보여준다. 혈관 해부 동안 동맥과 정맥의 찢어방지막 일리오페모랄 칼집을 열기 위해 더 오래된 안과 바늘을 사용하는 것이 중요합니다.이 선박은 레이저 도플러 기반 의 관류 측정 및 모세관 혈관 밀도의 조직학적 정량화에 의해 용이하게 평가된 뒷다리 허혈에 반응하여 혈관 신생을 평가할 수 있게 한다.

Research

JoVE Journal

Medicine

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A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are ...

연구

의학

Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

태아 알코올 노출의 Zebrafish 모델에서 Teratogenic 변경 사항 평가

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

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심근 국소 빈혈 및 Reperfusion의 Murine 폐쇄 가슴 모델

Surgical trauma by thoracotomy in open-chest models of coronary ligation induces an immune response which modifies different mechanisms involved in ...

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나트륨 히알루 론산의 망막 주사 설치류에있는 망막 박리 모델

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Reproducable Paraplegia by Thoracic Aortic Occlusion in a Murine Model of Spinal Cord Ischemia-reperfusion

척수 허혈 - 재관류의 생쥐 모델에서 흉부 대동맥 폐색에 의해 재생산 할 하반신 마비

Background
Lower extremity paralysis continues to complicate aortic interventions. The lack of understanding of the underlying pathology has hindered ...

A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery

왼쪽 앞쪽에 내림차순 동맥의 결찰을 통해 심근 허혈 - 재관류 손상의 생쥐 모델

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms ...

Murine Model of Intestinal Ischemia-reperfusion Injury

창자 허혈 - 재관류 손상의 쥐 모델

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, ...

Methods for Acute and Subacute Murine Hindlimb Ischemia

급성 및 아 급성 쥐 뒷다리 국소 빈혈하는 방법

Peripheral artery disease (PAD) is a leading cause of cardiovascular morbidity and mortality in developed countries, and animal models that reliably ...

A Chronic Cardiac Ischemia Model in Swine Using an Ameroid Constrictor

Ameroid 압축을 사용 하 여 돼지에서 만성 심장 허 혈 모델

Cardiovascular disease remains the number one cause of mortality in the United States. There are numerous approaches to treating these diseases, but ...