Name: evaluation of the storage stability of extracellular vesicles
Uploaded: 2019-05-22T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل برنامج البحوث النانوماتفوتوره المبتدئين الذي قدمته وزاره التعليم والبحوث الاتحادية في ألمانيا (رقم المنحة 13XP5029A). وقد تم دعم ماكسيميليان ريختر من قبل المؤسسة الاكاديميه المانيه للمنح الدراسية من خلال زمالة الدكتوراه.

1-ثقافة الخلية وإنتاج الخلايا المتوسطة المكيفة
<ol><li>عموما ، زراعه الخلايا تحت الظروف الفردية المطلوبة لخط الخلية المعنية.</li>
	<li>زراعه الخلايا ل 24-72 h في ظروف خاليه من المصل أو في المتوسطة التي تحتوي علي مصل الأبقار الجنينية المنضب EV. ملاحظه: إذا تم استخدام المستنفدة للمركبات اليورانيوم ا?...

<ol>
	<li>Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+and+diagnostic+applications+of+extracellular+vesicles.">Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles.</a> Journal of Controlled Release. 244, 167-183 (2016).</li><li>Fuhrmann, G., Herrmann, I. K., Stevens, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-derived+vesicles+for+drug+therapy+and+diagnostics:+Opportunities+and+challenges.">Cell-derived vesicles for drug therapy and diagnostics: Opportunities and challenges.</a> Nano Today. 10 (3), 397-409 (2015).</li><li>Goes, A., Fuhrmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenic+and+Biomimetic+Carriers+as+Versatile+Transporters+To+Treat+Infections.">Biogenic and Biomimetic Carriers as Versatile Transporters To Treat Infections.</a> ACS Infectious Diseases. 4 (6), 881-892 (2018).</li><li>Gy&#246;rgy, B., Hung, M. E., Breakefield, X. O., Leonard, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+Applications+of+Extracellular+Vesicles:+Clinical+Promise+and+Open+Questions.">Therapeutic Applications of Extracellular Vesicles: Clinical Promise and Open Questions.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 439-464 (2015).</li><li>Schulz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatible+bacteria-derived+vesicles+show+inherent+antimicrobial+activity.">Biocompatible bacteria-derived vesicles show inherent antimicrobial activity.</a> Journal of Controlled Release. 290, 46-55 (2018).</li><li>Feng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+class+of+extracellular+vesicles+from+breast+cancer+cells+activates+VEGF+receptors+and+tumour+angiogenesis.">A class of extracellular vesicles from breast cancer cells activates VEGF receptors and tumour angiogenesis.</a> Nature Communications. 8, 14450 (2017).</li><li>Bewicke-Copley, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+released+following+heat+stress+induce+bystander+effect+in+unstressed+populations.">Extracellular vesicles released following heat stress induce bystander effect in unstressed populations.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1340746 (2017).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+transfer+antigens+to+dendritic+cells+by+releasing+exosomes+containing+dead-cell-associated+antigens+partially+through+a+ceramide-dependent+pathway+to+enhance+CD4(+)+T-cell+responses.">Macrophages transfer antigens to dendritic cells by releasing exosomes containing dead-cell-associated antigens partially through a ceramide-dependent pathway to enhance CD4(+) T-cell responses.</a> Immunology. 149 (2), 157-171 (2016).</li><li>Buzas, E. I., Gy&#246;rgy, B., Nagy, G., Falus, A., Gay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+extracellular+vesicles+in+inflammatory+diseases.">Emerging role of extracellular vesicles in inflammatory diseases.</a> Nature Reviews Rheumatology. 10, 356 (2014).</li><li>Rajappa, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+Astrocytic+Tumor+Progression+Potentiated+by+JAK-mediated+Recruitment+of+Myeloid+Cells.">Malignant Astrocytic Tumor Progression Potentiated by JAK-mediated Recruitment of Myeloid Cells.</a> Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 23 (12), 3109-3119 (2017).</li><li>Umezu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal+miR-135b+shed+from+hypoxic+multiple+myeloma+cells+enhances+angiogenesis+by+targeting+factor-inhibiting+HIF-1.">Exosomal miR-135b shed from hypoxic multiple myeloma cells enhances angiogenesis by targeting factor-inhibiting HIF-1.</a> Blood. 124 (25), 3748-3757 (2014).</li><li>Costa-Silva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer+exosomes+initiate+pre-metastatic+niche+formation+in+the+liver.">Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver.</a> Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).</li><li>Boulanger, C. M., Loyer, X., Rautou, P. -. E., Amabile, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+coronary+artery+disease.">Extracellular vesicles in coronary artery disease.</a> Nature Reviews Cardiology. 14, 259 (2017).</li><li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+toxicity+and+immunogenicity+studies+reveal+minimal+effects+in+mice+following+sustained+dosing+of+extracellular+vesicles+derived+from+HEK293T+cells.">Comprehensive toxicity and immunogenicity studies reveal minimal effects in mice following sustained dosing of extracellular vesicles derived from HEK293T cells.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324730 (2017).</li><li>Vader, P., Mol, E. A., Pasterkamp, G., Schiffelers, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+for+drug+delivery.">Extracellular vesicles for drug delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 106, 148-156 (2016).</li><li>Ingato, D., Lee, J. U., Sim, S. J., Kwon, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Good+things+come+in+small+packages:+Overcoming+challenges+to+harness+extracellular+vesicles+for+therapeutic+delivery.">Good things come in small packages: Overcoming challenges to harness extracellular vesicles for therapeutic delivery.</a> Journal of Controlled Release. 241, 174-185 (2016).</li><li>Gimona, M., Pachler, K., Laner-Plamberger, S., Schallmoser, K., Rohde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manufacturing+of+Human+Extracellular+Vesicle-Based+Therapeutics+for+Clinical+Use.">Manufacturing of Human Extracellular Vesicle-Based Therapeutics for Clinical Use.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1190 (2017).</li><li>Jeyaram, A., Jay, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+and+Storage+Stability+of+Extracellular+Vesicles+for+Therapeutic+Applications.">Preservation and Storage Stability of Extracellular Vesicles for Therapeutic Applications.</a> The AAPS Journal. 20 (1), 1 (2017).</li><li>L&#337;rincz, &. #. 1. 9. 3. ;. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+storage+on+physical+and+functional+properties+of+extracellular+vesicles+derived+from+neutrophilic+granulocytes.">Effect of storage on physical and functional properties of extracellular vesicles derived from neutrophilic granulocytes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 25465 (2014).</li><li>Kreke, M., Smith, R., Hanscome, P., Peck, K., Ibrahim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processes+for+producing+stable+exosome+formulations.">Processes for producing stable exosome formulations.</a> US patent. , (2016).</li><li>Frank, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+protect+glucuronidase+model+enzymes+during+freeze-drying.">Extracellular vesicles protect glucuronidase model enzymes during freeze-drying.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12377 (2018).</li><li>Charoenviriyakul, C., Takahashi, Y., Nishikawa, M., Takakura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+exosomes+at+room+temperature+using+lyophilization.">Preservation of exosomes at room temperature using lyophilization.</a> International Journal of Pharmaceutics. 553 (1), 1-7 (2018).</li><li>Kusuma, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+Protect+and+to+Preserve:+Novel+Preservation+Strategies+for+Extracellular+Vesicles.">To Protect and to Preserve: Novel Preservation Strategies for Extracellular Vesicles.</a> Frontiers in Pharmacology. 9 (1199), (2018).</li><li>Haney, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+as+drug+delivery+vehicles+for+Parkinson's+disease+therapy.">Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy.</a> Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).</li><li>Fuhrmann, G., Serio, A., Mazo, M., Nair, R., Stevens, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+loading+into+extracellular+vesicles+significantly+improves+the+cellular+uptake+and+photodynamic+effect+of+porphyrins.">Active loading into extracellular vesicles significantly improves the cellular uptake and photodynamic effect of porphyrins.</a> Journal of Controlled Release. 205, 35-44 (2015).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W. G., Sargent, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+sizing+and+enumeration+by+nanoparticle+tracking+analysis.">Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 19671 (2013).</li><li>Vestad, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+concentration+analyses+of+extracellular+vesicles+by+nanoparticle+tracking+analysis:+a+variation+study.">Size and concentration analyses of extracellular vesicles by nanoparticle tracking analysis: a variation study.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1344087 (2017).</li><li>Bosch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose+prevents+aggregation+of+exosomes+and+cryodamage.">Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage.</a> Scientific Reports. 6, 36162 (2016).</li><li>Bhattacharjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DLS+and+zeta+potential+-+What+they+are+and+what+they+are+not.">DLS and zeta potential - What they are and what they are not.</a> Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).</li><li>Van Deun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+disparate+isolation+methods+for+extracellular+vesicles+on+downstream+RNA+profiling.">The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24858 (2014).</li><li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes.">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li><li>Patel, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+cell+culture+parameters+on+production+and+vascularization+bioactivity+of+mesenchymal+stem+cell-derived+extracellular+vesicles.">Impact of cell culture parameters on production and vascularization bioactivity of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles.</a> Bioengineering &amp; Translational Medicine. 2 (2), 170-179 (2017).</li><li>Gardiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+used+for+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles:+results+of+a+worldwide+survey.">Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945 (2016).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+distinct+nanoparticles+and+subsets+of+extracellular+vesicles+by+asymmetric+flow+field-flow+fractionation.">Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation.</a> Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).</li><li>Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+centrifugation+induces+aggregation+of+extracellular+vesicles.">High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 29509 (2015).</li><li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma.">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).</li></ol>

في هذه المخطوطة ، نقدم بروتوكولا شاملا لدراسة استقرار المركبات التي تخضع لظروف تخزين مختلفه. مع مزيج من جلوكوروداز مغلفه كما قراءات وظيفية وتقييم المعلمات الفيزيائية للمركبات المركبات الخاصة ، وبروتوكول يسمح لتقييم الاستقرار التخزين مباشره من المركبات الخاصة ومقارنه المركبات الخاصة م?...

المركبات أليفه هي جسيمات نانويه الغشاء التي تنتجها تقريبا جميع أنواع الخلايا. للخلايا الثدييات ، يمكن تقسيم المركبات الاساسيه إلى مجموعتين رئيسيتين مع مسارات إنتاج متميزة1،2. وتنتج الحويصلات غشاء ، مع نطاق حجم من تقريبا 100-1000 نانومتر ، من قبل الناشئة مباشره من غشاء الخلية. وتستمد exosomes ، الحجم 30-200 نانومتر ، من الهيئات متعددة الخلايا التي شكلتها الداخل في مهدها إلى التنظير الداخلي الذي فتيل في وقت لاحق مع غشاء الخلية للإفراج عن التماثيل المتعددة في وقت واحد. الوظيفة الرئيسية لهذه الحويصلات هو نقل المعلومات بين الخلايا3. لهذا الغرض ، يتم فرز الشحنات مثل RNA والحمض النووي والبروتينات بنشاط في نفوسهم. المركبات التي يمكن ان تنقل مجموعه متنوعة من الآثار علي أهدافها ، مع الآثار المترتبة علي كل من الحالة الصحية والمرض. علي جانب واحد, انها التوسط الآثار الايجابيه مثل تجديد الانسجه, العرض مستضد, أو اثار المضادات الحيوية, مما يجعلها أهداف الميمون لتنميتها كما التداوي4,5. علي الجانب الآخر, المركبات النارية يمكن ان تعزز الاوعيه الدموية الورم6, حمل اثار المارة في الاستجابات الإجهاد7, وقد تلعب دورا في امراض المناعة الذاتية8 والامراض التهابيه9. التالي ، فانها قد تكون عنصرا رئيسيا لفهم أفضل للعديد من الآثار المرضية. ومع ذلك ، فان وجود المركبات المتغيرة في الامراض المنوعة ، مثل السرطان10،11،12 واضطرابات القلب والاوعيه الدموية13، وسهوله الوصول اليها في الدم والبول يجعلها مثاليه حيوي. وأخيرا ، والتوافق البيولوجي جيده14 وقدرتها علي استهداف المتاصله جعل المركبات الحيوية أيضا مثيره للاهتمام لتسليم المخدرات15. في هذه المخطوطة ، نقوم بوصف بروتوكول لتقييم استقرار التخزين للمركبات المركبة التي تستمد من خلايا الثدييات ، وهي خاصيه هامه لا يزال التحقيق فيها قليلا.
للتطوير السريري للمركبات المركبات الخاصة ، لا تزال هناك العديد من العقبات للتغلب علي16، بما في ذلك تقييم اثارها العلاجية ، والإنتاج ، وتنقيه ، وتخزين17. بينما-80 درجه مئوية وينظر علي نطاق واسع علي انها معيار الذهب لتخزين EV18، والمجمدات المطلوبة مكلفه ، والحفاظ علي سلسله الباردة المطلوبة من الإنتاج إلى المريض يمكن ان تكون صعبه. وعلاوة علي ذلك ، تشير بعض التقارير إلى ان التخزين في-80 درجه مئوية لا يزال لا يحفظ علي النحو الأمثل المركبات أليفه ويدفع خسارة في وظيفة EV19,20. وقد اقترحت طرق أخرى ، مثل تجميد التجفيف21أو22 أو التجفيف بالرذاذ23، كبدائل محتمله للتخزين المجمد للمركبات المركبة.
والطريقة المثلي لتقييم استقرار التخزين هي اختبار المركبات الحيوية في المقايسات الوظيفية أو من خلال تقييم علامة محدده ، علي سبيل المثال ، نشاطها المضاد للبكتيريا19. وهذا ممكن عندما يكون التاثير المطلوب من الحويصلات المعروفة وعندما مجموعه واحده متميزة من المركبات التي يمكن دراستها. وإذا ما قورنت المركبات التي من مصادر مختلفه للخلايا (علي سبيل المثال ، بالنسبة لتغليف المخدرات) أو إذا لم تكن هناك قراءات وظيفية معروفه ، فانه لم يعد من الممكن تقييم التغيرات الناجمة عن التخزين بطريقه مباشره.
من ناحية أخرى ، ببساطه تقييم التغييرات في المعلمات الفيزيائية الكيميائية ، مثل الحجم ، واستعاده الجسيمات ، وتركيز البروتين ، لا يتنبا دائما التغيرات في نشاط EV ، كما هو مبين في براءة اختراع الاخيره20.
هنا ، ونحن نقدم بروتوكول قابل للتطبيق بسهوله لقياس استقرار التخزين من المركبات أليفه من خلال تقييم المعلمات الفيزيائية الكيميائية جنبا إلى جنب مع نشاط انزيم بيتا جلوكوروداز مغلفه كبديل للبضائع من المركبات أليفه. يتم تحميل الانزيم من قبل حضانة سابونين ، طريقه معتدله التي أنشئت مع المركبات الخاصة من مصادر مختلفه21،24،25. يشكل سابونين المسام العابرة في غشاء EV ، والذي يسمح بامتصاص الانزيم في الحويصلة. كما الانزيمات عرضه لتفقد نشاطها إذا تعرضت لظروف التخزين غير المواتية ، فهي بديل مثالي لتقييم الحفاظ علي الشحنات الوظيفية للمركبات المركبات الخاصة.
وقد أثبتنا ان تطبيق هذا البروتوكول علي المركبات التي تستمد من الخلايا الجذعية البشرية (MSCs) ، والخلايا المبطنة بالوريد السري البشري (HUVECs) ، والخلايا الظهاريه السرطانية البشرية (A549) تؤدي في الواقع إلى اختلافات كبيره في استقرار التخزين بين خطوط الخلايا المختلفة ، والتي ينبغي ان تؤخذ في الاعتبار عند اختيار مصدر EV21.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:933px;" width="933">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">1,2 dimyristoyl-sn glycero-3-phospho-choline (DMPC)</td>
			<td style="width:315px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P2663-25MG</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-choline (DPPC)</td>
			<td style="width:315px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4329-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">225 cm&#178; cell culture flasks</td>
			<td style="width:315px;">Corning</td>
			<td>431082</td>
			<td>Used with 25 ml of medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">30 kDa regenerated cellulose membrane</td>
			<td style="width:315px;">Wyatt Technology Europe</td>
			<td>1854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">350 &#181;m spacer</td>
			<td style="width:315px;">Wyatt Technology Europe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Automated fraction collector</td>
			<td style="width:315px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Beta-glucuronidase</td>
			<td style="width:315px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7646-100KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Chloroform</td>
			<td style="width:315px;">Fisher scientific</td>
			<td>C/4966/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Column oven</td>
			<td style="width:315px;">Hitachi High-Technologies Europe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">D-(+)-Trehalose dihydrate</td>
			<td style="width:315px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9531-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">DAWN HELEOS II, Multi-angle light scattering detector</td>
			<td style="width:315px;">&#160;Wyatt Technology Europe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Durapore Membrane filter, PVDF,&#160; 0,1&#160;&#181;m, 47&#160;mm</td>
			<td style="width:315px;">Merck</td>
			<td>VVLP04700</td>
			<td>Used for the preparation of buffers for AF4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">EBM-2</td>
			<td style="width:315px;">Lonza Verviers, S.p.r.</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td>Endothelial Cell Growth basal medium, used for the serum free culture of HUVEC cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Eclipse dualtec</td>
			<td style="width:315px;">Wyatt Technology Europe</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">EGM-2</td>
			<td style="width:315px;">Lonza Verviers, S.p.r.</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>Endothelial Cell Growth medium, used for the normal culture of HUVEC cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ELISA Plate Sealers</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>DY992</td>
			<td>used for sealing of 96-well plates for the glucuronidase assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Ethanol</td>
			<td style="width:315px;">Fisher scientific</td>
			<td>E/0665DF/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Extruder Set With Holder/Heating Block</td>
			<td style="width:315px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Filter support</td>
			<td style="width:315px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610014-1EA</td>
			<td>used for liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Fluorescein di-&#946;-D-glucoronide</td>
			<td style="width:315px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F2915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Gibco PBS-tablets+CA10:F36</td>
			<td style="width:315px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Hettich Universal 320 R</td>
			<td>Andreas Hettich GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used for pelleting cells at 300 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Hettich Rotina 420 R</td>
			<td style="width:315px;">Andreas Hettich GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used for pelleting larger debris at 3000 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">HUVEC cells</td>
			<td style="width:315px;">Lonza Verviers, S.p.r.</td>
			<td style="width:119px;">C2517A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Kimble&#160; FlexColumn 1X30CM</td>
			<td style="width:315px;">Kimble</td>
			<td>420401-1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Lyophilizer ALPHA 2-4 LSC</td>
			<td style="width:315px;">Christ</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge Tubes, Polypropylene</td>
			<td>VWR international</td>
			<td style="width:119px;">525-0255</td>
			<td>the tubes used for all EV-handling, found to be more favorable than comparable products from other suppliers regarding particle recovery</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Nanosight LM14 equipped with a green laser</td>
			<td style="width:315px;">Malvern Pananalytical</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Nanosight-software version 3.1</td>
			<td style="width:315px;">Malvern Pananalytical</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">Nucleopore 200 nm track-etch polycarbonate membranes</td>
			<td>Whatman/GE Healthcare</td>
			<td align="right">110406</td>
			<td>used for liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">PEEK Inline filter holder</td>
			<td style="width:315px;">Wyatt Technology Europe</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphotungstic acid hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>79690-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Polycarbonate bottles for ultracentrifugation</td>
			<td style="width:315px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">355622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QuantiPro BCA Assay Kit</td>
			<td style="width:315px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>QPBCA-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Saponin</td>
			<td style="width:315px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Scanning electron microscopy Zeiss EVO HD 15</td>
			<td style="width:315px;">Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Sepharose Cl-2b</td>
			<td style="width:315px;">GE Healthcare</td>
			<td>17014001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">SEM copper grids with carbon film</td>
			<td style="width:315px;">Plano</td>
			<td>S160-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Small AF4 channel</td>
			<td style="width:315px;">Wyatt Technology Europe</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Sputter-coater Q150R ES</td>
			<td style="width:315px;">Quorum Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">Transmission electron microscopy JEOL JEM 2011</td>
			<td style="width:315px;">Oxford Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Type 45 Ti ultracentrifugation rotor</td>
			<td style="width:315px;">Beckman Coulter</td>
			<td>339160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Ultimate 3000 Dionex autosampler</td>
			<td style="width:315px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Ultimate 3000 Dionex isocratic pump</td>
			<td style="width:315px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Ultimate 3000 Dionex online vacuum degasser</td>
			<td style="width:315px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Ultracentrifuge OptimaTM L-90 K</td>
			<td style="width:315px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">UV detector</td>
			<td style="width:315px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Whatman 0.2 &#181;m pore size mixed cellulose filter</td>
			<td>Whatman/GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">10401712</td>
			<td>Used for the filtration of all buffers used with the EVs and in SEC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of the storage stability of extracellular vesicles

الحويصلات خارج الخلية (المركبات الحيوية) هي أهداف واعده في البحوث الحالية ، لاستخدامها كادويه ، وناقلات المخدرات ، والمؤشرات الحيوية. لتطويرهم السريري ، ليس فقط نشاطهم الصيدلاني مهم ولكن أيضا إنتاجهم يحتاج إلى تقييم. وفي هذا السياق ، تركز البحوث علي عزل المركبات الخاصة ، وتوصيفها ، وتخزينها. تهدف المخطوطة الحالية إلى توفير اجراء لتقييم تاثير ظروف التخزين المختلفة علي المركبات الحيوية ، دون التلاعب بالجينات أو المقايسات الوظيفية المحددة. وهذا يجعل من الممكن الحصول بسرعة علي الانطباع الأول من استقرار المركبات التي تحت حاله تخزين معينه ، ويمكن مقارنه المركبات التي تستمد من مصادر الخلايا المختلفة بسهوله. ويستند قياس الاستقرار علي المعلمات الفيزيائية الكيميائية للمركبات (الحجم ، وتركيز الجسيمات ، والمورفولوجية) والحفاظ علي نشاط حمولتها. يتم تقييم هذا الأخير من قبل التغليف بوساطة سابونين من انزيم بيتا جلوكوروداز في المركبات أليفه. جلوكوروداز يعمل كبديل ويسمح للقياس الكمي سهله عن طريق انشقاق جزيء مراسل الفلورسنت. يمكن ان يكون هذا البروتوكول أداه للباحثين في البحث عن ظروف التخزين التي تحتفظ علي النحو الأمثل خصائص EV لدفع البحوث EV إلى التطبيق السريري.

الشكل 1 يعرض خصائص التخزين من المركبات التي تم عزلها من HUVECs. تم عزل المركبات الخاصة من قبل جامعه كاليفورنيا ، تم تغليف جلوكورونيداز ، وبعد SEC ، تم تقييم المركبات الكيميائية المنقية لخصائصها الفيزيائية من قبل NTA. وخضعت عينه من الحويصلات لاحقا لتنقيه AF4 وتم قياس نشاط جلوكوروداز.
<p cl...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles at JoVE.com

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

تقييم استقرار التخزين من الحويصلات خارج الخلية

هنا نقدم بروتوكول قابل للتطبيق بسهوله لتقييم استقرار التخزين من الحويصلات خارج الخلية ، وهي مجموعه من الجسيمات النانويه التي تحدث بشكل طبيعي التي تنتجها الخلايا. يتم تحميل الحويصلات مع جلوكوروداز كانزيم نموذج وتخزينها في ظل ظروف مختلفه. بعد التخزين ، يتم تقييم المعلمات الفيزيائية الكيميائية ونشاط الانزيم المغلف.

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

استقرار التخزين من السعايا الخلوية الإضافية هو معلمة هامة لاستخدامها العلاجي المحتمل. يوفر بروتوكولنا أداة قابلة للتطبيق بسهولة لتقييم كيفية تأثير التخزين على الـ(vesicles). الميزة الرئيسية لتقنيتنا هي أنه من خلال إدخال glucuronidase كعلامة خارجية ، vesicles خارج الخلية المستمدة من الخلايا الأم المختلفة يمكن مقارنة بسهولة فيما يتعلق بصلاحيتها.تجزئة تدفق تدفق تدفق غير متماثل، أو AF4، هو بديل معتدل لحجم تنقية الكروماتوغرافيا استبعاد للمركبات الحساسة جدا. لأن المركبات تواجه أقل محض الإجهاد في القناة. كما glucuronidase هو انزيم حساس, نوعية يقيم فوائد من التخطيط الدقيق وتنفيذ خطوات لتنقية وتحليل العودة إلى الوراء.بعد زراعة خط الخلية من الفائدة وفقا للشروط القياسية لتلك الخلايا، استبدال مغامر مع المصل الحر أو اضافية حويصلات الخلوية المنضب المتوسطة والعودة إلى الخلايا الحاضنة ثقافة الخلية لمدة إضافية 24 إلى 72 ساعة. في نهاية الحضانة، وجمع نات السوبر من كل قارورة والطرد المركزي العينات إلى رواسب الخلايا. جمع بعناية في المتوسطة الخلية مشروطة دون إزعاج بيليه.وطاردة مركزية المتوسطة مرة أخرى لإزالة حطام الخلية والمجاميع الكبيرة. ثم نقل بعناية supernatants في أنابيب فائقة التركيز. إذا كان استخدام دوار زاوية ثابتة، وضع علامة على اتجاه الأنابيب في جهاز الطرد المركزي لتسهيل استرجاع بيليه من خارج الخلية بعد الطرد المركزي.في نهاية الطرد الفائق، استخدم ماصة مصلية لتجاهل المابس بعناية دون إزعاج بيليه الحويصلة خارج الخلية. في 200 ميكرولترات من 0.2 ميكرومتر المسام تصفية برنامج تلفزيوني إلى السوبر المتبقية من أنبوب فائقة الوضوح الأول. بعد resuspending بيليه، نقل تعليق vesicle خارج الخلية الناتجة إلى الأنبوب التالي لإعادة النيطة اللاحقة حتى تم إعادة تعليق جميع الكريات من خارج الخلية.إضافة بيتا glucuronidase إلى الحل بيليه resuspended النهائي لتركيز النهائي من 1.5 ملليغرام لكل ملليلتر. والسابونين إلى تركيز نهائي من 0.1 ملليغرام لكل ملليلتر. ثم تخلط جيدا من خلال دوامة لمدة ثلاث ثوان ووضع رد فعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق مع الخفقان لطيف متقطعة.بمجرد أن تم تغليف glucuronidase، تأكد من تنفيذ جميع خطوات تقييم حابية تنقية اللاحقة في نفس اليوم للحصول على نتائج استقرار التخزين غير متحيزة. يكون حجم استبعاد العمود الكروماتوغرافيا توازنها مع ما لا يقل عن اثنين من وحدات التخزين العمود من برنامج تلفزيوني على استعداد لتنقية بيليه مباشرة بعد حضانة saponin. لتنقية، إضافة ما يصل إلى 400 ميكرولترات من تعليق خارج الخلية إلى العمود.ثم جمع كسور ملليلتر واحدة من الويّز. لتتوافق مع فصل من حويصلات خارج الخلية من البروتينات الملوثة وخالية من الجلوكورونيداز، وقياس تركيز البروتين من قبل مقايسة حمض bicinchoninic وفقا لتعليمات المصنعين. باستخدام المعلمات الأمثل لأداة كل ونوع من نوع الفينة، واستخدام أداة تحليل تتبع الجسيمات نانو لقياس حجم الخلايا خارج الخلية والتركيز.لقياس نشاط جلوكرونيديز، إضافة 25 ميكرولترات من الفلوريسين الطازجة إعداد دي-بيتا-D-glucuronide إلى 125 ميكرولترات من الفهيصلات خارج الخلية المنقاة وإضافة العينة إلى بئر واحد من لوحة سوداء 96 جيدا. قياس إنتاج الفلوريسين الصفر الوقت على قارئ لوحة في 480 نانومتر الإثارة و 516 نانومتر الانبعاثات. غطي اللوحة بإحكام مع رقائق بلاستيكية شفافة للحد من التبخر.ثم احتضان لوحة محمية من الضوء لمدة 18 ساعة في 37 درجة مئوية. قياس إنتاج الفلوريسين 18 ساعة على قارئ لوحة كما أظهرت للتو. بالنسبة للتجميل خارج الخلية، أضف أربعة ملليجرامات لكل ملليلتر من الترهالوس إلى الفينات المنقى.وتجميد الحويصلات في ناقص 80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل. لlyophilize العينات، تعيين درجة حرارة الرف من مزيل ال التسليح إلى 15 درجة مئوية والضغط إلى 0.180 ملليبار. جففي الـ"هاد" في ظل هذه الظروف لمدة 46 ساعة.في نهاية خطوة التجفيف الرئيسية، تعيين درجة حرارة الرف إلى 25 درجة مئوية والضغط إلى 0035 ملليبار وتجفيف العينات لمدة ساعتين في ظل هذه الظروف. ثم تخزين العينات الميوفية في أربع درجات مئوية. لإعادة تهويد العينات بعد التخزين، إضافة كمية من الماء يساوي حجم تعليق الفضوي خارج الخلية قبل الليسفيلي.لتقييم نشاط الإنزيم بعد التخزين، قم بتحميل أداة AF4 مع 0.1 ميكرومتر مرشّح حديثًا من برنامج PBS للمرحلة المتنقلة وأدخل غشاء فلتر ميكرومتر 0.1 في مرشح مدخل الذروة بعد المضخة لتقليل ضوضاء الجسيمات من المذيبات. بعد تفكيك، تنظيف قناة صغيرة لAF4 مع المياه millEq. هيدرات غشاء السليلوز جديدة مجددة مع قطع الوزن الجزيئي من 30 كيلودالون ووضع الغشاء على رأس الحنق مع الجانب لامعة حتى.ضع مسافة 350 ميكرومتر واسعة تحت النصف العلوي من القناة وتجميع أجزاء القناة. باستخدام مفك عزم الدوران، وتشديد مسامير أولا إلى عزم دوران خمسة متر نيوتن، ثم إلى عزم دوران من سبعة متر نيوتن. تشديد المسامير حول الكتلة في نمط متقاطع.قم بتوصيل مدخل القنوات والمنفذ ومنفذ التدفق عبري إلى الكسوف. ثم من ثلاث عينات قديمة على الأقل لتكبيل الغشاء. برنامج تشغيل تجزئة مع تدفق كاشف وتدفق التركيز تعيين إلى ملليلتر واحد في الدقيقة الواحدة وتدفق حقن من 0.2 ملليلتر في الدقيقة.بعد خطوة قبل التركيز لمدة دقيقة واحدة، حقن العينة على مدى فترة 10 دقائق في التركيز والحقن خطوة، قبل تقليل تدفق عبر من ملليلتر اثنين في الدقيقة إلى 0.1 ملليلتر في الدقيقة على مدى ثماني دقائق. الانتهاء من تشغيل تجزئة مع خطوة elution دون تدفق عبر لمدة 10 دقائق وإضافة خطوة الغسيل من elution والحقن، تليها elution. ثم اضبط القناة للشوط التالي مع تدفق عبر أولي من ميليلترين في الدقيقة الواحدة وتعيين كاشف الأشعة فوق البنفسجية إلى 280 نانومتر.عندما تم تعيين جميع البرامج ، وحقن 300 ميكرولترات من العينة وتسجيل الأشعة فوق البنفسجية وإشارات تشتت الضوء في برنامج ASTRA. بعد 12 دقيقة ونصف, تبدأ في جمع كسور ملليلتر واحد حتى 27 دقيقة حقن آخر. ثم تنفيذ مقايسة جلوكرونيديز وتحليل تتبع الجسيمات نانو كما ثبت.هنا، يظهر استرداد الجسيمات وحجم الحويصلات خارج الخلية المعزولة من الخلايا البطانية الوعائية البشرية بعد سبعة أيام من التخزين في ظروف مختلفة بالمقارنة مع عينة جديدة. وخضعت الزعويات بعد ذلك لتنقية AF4 وتم قياس نشاط الجلوكورونيدز لكل جسيم. كلا الكروماتوغرافيا استبعاد حجم و AF4 ناجحة في فصل حويظة خارج الخلية من جلوكورونيديز الحرة.بسبب درجة أعلى من الفصل ل AF4 بين الجسيمات والانزيم الحر، تلوث الكسور التي تحتوي على حويصلات أقل احتمالا. AF4 تنقية بعد التخزين يزيل إنزيم الحرة من العينات، وبالتالي يقلل من كمية نشاط الانزيم المستردة لكل جسيم. هذا التأثير هو الأكثر بروزا بعد التخزين في أربع درجات مئوية، والتي لوحظت 2/3 تخفيض.حذف هذه الخطوة تنقية إضافية يمكن أن يؤدي إلى افتراض خاطئ حول استقرار الانزيم. لا يكشف المجهر الإلكتروني انتقال اختلافات كبيرة في الشكل للحويصلات خارج الخلية lyophilized دون cryoprotectant. المسح المجهري الإلكتروني التصوير، ومع ذلك، يكشف عن وجود مجاميع داخل العينات الlyophilized التي لم يتم العثور عليها في العينات المخزنة ناقص 80 درجة.ومن الأهمية بمكان أن يتم إزالة إنزيم الحرة من حويصلات قبل مقايسة جلوكرونيديز. وبالتالي، فإن التقنية المستخدمة لتنقية الفُضاءة تحتاج إلى تقييم دقيق. ويمكن أيضا أن ينظر إلى الجسيمات النقية من حيث شحن سطحها لمعرفة ما إذا كان التخزين قد غير التكوين الطبيعي للبروتينات الغشاء أو السكريات.مع أسلوبنا، فمن الممكن الحصول على أول إشارة حول استقرار تخزين الخلايا خارج الخلية، حتى عندما لا توجد علامات محددة معروفة أو المقايسات للنشاط المتاحة.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

المغناطيسي منهجية Elastography الرنين لتقييم الأنسجة المهندسة النمو كونستركت

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

ثابت الطريقة النتوء الضغط التي تسيطر عليها لإعداد الحويصلات الدهن نانو الحجم

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

وتغليف من النسخ خالية من الخلايا وآلات الترجمة في الحويصلات لتشييد المقلدون الخلوية

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

الكمي والحجم التنميط من خارج الخلية عن طريق الحويصلات الانضباطي مقاوم نبض الاستشعار

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D تتبع المداري في التعديل المجهر ثنائي الفوتون: دراسة تطبيقية على تتبع من بين الخلايا الحويصلات

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

أجهزة الورقية للعزل وتوصيف خارج الخلية الحويصلات

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

تصنيع كسوات وناقل دقيق مستمد مصفوفة خارج الخلية حيث الثقافة خلية الأنسجة محددة ومنصات التوصيل

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

التوضيح الأولي لسائل زراعة الخلايا المقطوعة CHO باستخدام فاصل صوتي

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...

Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants

وضع العلامات على الحويصلات خارج الخلية لرصد الهجرة والإقبال في الغضاريف Explants

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their ...

Platelet-Derived Extracellular Vesicle Functionalization of Ti Implants

الصفائح الدموية المشتقة من وظائف الحويكل خارج الخلية من يزرع تي

Extracellular Vesicles (EVs) are biological nanovesicles that play a key role in cell communication. Their content includes active biomolecules such as ...