Name: evaluation of the storage stability of extracellular vesicles
Uploaded: 2019-05-22T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles at JoVE.com

Het NanoMatFutur Junior research programma van het Federaal Ministerie van onderwijs en onderzoek, Duitsland (Grant Number 13XP5029A) steunde dit werk. Maximilian Richter werd gesteund door Studienstiftung des deutschen Volkes (Duitse academische beurs Stichting) door middel van een Ph.D. Fellowship.

1. de cultuur van de cel en de productie van cel-geconditioneerd middel
<ol><li>In het algemeen, cultiveren cellen onder de individuele voorwaarden die nodig zijn voor de desbetreffende cel lijn.</li>
	<li>Kweek de cellen voor 24-72 h in serum vrije voorwaarden of in medium met EV-verarmd foetale boviene serum (FBS). Opmerking: als EV-uitgeput FBS wordt gebruikt, gebruik maken van een methode bewezen om efficiënt afbreken van het serum, om verontreiniging te voorkomen met runderen serum-afgeleide EVs<sup class="xre...

<ol>
	<li>Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+and+diagnostic+applications+of+extracellular+vesicles.">Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles.</a> Journal of Controlled Release. 244, 167-183 (2016).</li><li>Fuhrmann, G., Herrmann, I. K., Stevens, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-derived+vesicles+for+drug+therapy+and+diagnostics:+Opportunities+and+challenges.">Cell-derived vesicles for drug therapy and diagnostics: Opportunities and challenges.</a> Nano Today. 10 (3), 397-409 (2015).</li><li>Goes, A., Fuhrmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenic+and+Biomimetic+Carriers+as+Versatile+Transporters+To+Treat+Infections.">Biogenic and Biomimetic Carriers as Versatile Transporters To Treat Infections.</a> ACS Infectious Diseases. 4 (6), 881-892 (2018).</li><li>Gy&#246;rgy, B., Hung, M. E., Breakefield, X. O., Leonard, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+Applications+of+Extracellular+Vesicles:+Clinical+Promise+and+Open+Questions.">Therapeutic Applications of Extracellular Vesicles: Clinical Promise and Open Questions.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 439-464 (2015).</li><li>Schulz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatible+bacteria-derived+vesicles+show+inherent+antimicrobial+activity.">Biocompatible bacteria-derived vesicles show inherent antimicrobial activity.</a> Journal of Controlled Release. 290, 46-55 (2018).</li><li>Feng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+class+of+extracellular+vesicles+from+breast+cancer+cells+activates+VEGF+receptors+and+tumour+angiogenesis.">A class of extracellular vesicles from breast cancer cells activates VEGF receptors and tumour angiogenesis.</a> Nature Communications. 8, 14450 (2017).</li><li>Bewicke-Copley, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+released+following+heat+stress+induce+bystander+effect+in+unstressed+populations.">Extracellular vesicles released following heat stress induce bystander effect in unstressed populations.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1340746 (2017).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+transfer+antigens+to+dendritic+cells+by+releasing+exosomes+containing+dead-cell-associated+antigens+partially+through+a+ceramide-dependent+pathway+to+enhance+CD4(+)+T-cell+responses.">Macrophages transfer antigens to dendritic cells by releasing exosomes containing dead-cell-associated antigens partially through a ceramide-dependent pathway to enhance CD4(+) T-cell responses.</a> Immunology. 149 (2), 157-171 (2016).</li><li>Buzas, E. I., Gy&#246;rgy, B., Nagy, G., Falus, A., Gay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+extracellular+vesicles+in+inflammatory+diseases.">Emerging role of extracellular vesicles in inflammatory diseases.</a> Nature Reviews Rheumatology. 10, 356 (2014).</li><li>Rajappa, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+Astrocytic+Tumor+Progression+Potentiated+by+JAK-mediated+Recruitment+of+Myeloid+Cells.">Malignant Astrocytic Tumor Progression Potentiated by JAK-mediated Recruitment of Myeloid Cells.</a> Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 23 (12), 3109-3119 (2017).</li><li>Umezu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal+miR-135b+shed+from+hypoxic+multiple+myeloma+cells+enhances+angiogenesis+by+targeting+factor-inhibiting+HIF-1.">Exosomal miR-135b shed from hypoxic multiple myeloma cells enhances angiogenesis by targeting factor-inhibiting HIF-1.</a> Blood. 124 (25), 3748-3757 (2014).</li><li>Costa-Silva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer+exosomes+initiate+pre-metastatic+niche+formation+in+the+liver.">Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver.</a> Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).</li><li>Boulanger, C. M., Loyer, X., Rautou, P. -. E., Amabile, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+coronary+artery+disease.">Extracellular vesicles in coronary artery disease.</a> Nature Reviews Cardiology. 14, 259 (2017).</li><li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+toxicity+and+immunogenicity+studies+reveal+minimal+effects+in+mice+following+sustained+dosing+of+extracellular+vesicles+derived+from+HEK293T+cells.">Comprehensive toxicity and immunogenicity studies reveal minimal effects in mice following sustained dosing of extracellular vesicles derived from HEK293T cells.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324730 (2017).</li><li>Vader, P., Mol, E. A., Pasterkamp, G., Schiffelers, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+for+drug+delivery.">Extracellular vesicles for drug delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 106, 148-156 (2016).</li><li>Ingato, D., Lee, J. U., Sim, S. J., Kwon, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Good+things+come+in+small+packages:+Overcoming+challenges+to+harness+extracellular+vesicles+for+therapeutic+delivery.">Good things come in small packages: Overcoming challenges to harness extracellular vesicles for therapeutic delivery.</a> Journal of Controlled Release. 241, 174-185 (2016).</li><li>Gimona, M., Pachler, K., Laner-Plamberger, S., Schallmoser, K., Rohde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manufacturing+of+Human+Extracellular+Vesicle-Based+Therapeutics+for+Clinical+Use.">Manufacturing of Human Extracellular Vesicle-Based Therapeutics for Clinical Use.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1190 (2017).</li><li>Jeyaram, A., Jay, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+and+Storage+Stability+of+Extracellular+Vesicles+for+Therapeutic+Applications.">Preservation and Storage Stability of Extracellular Vesicles for Therapeutic Applications.</a> The AAPS Journal. 20 (1), 1 (2017).</li><li>L&#337;rincz, &. #. 1. 9. 3. ;. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+storage+on+physical+and+functional+properties+of+extracellular+vesicles+derived+from+neutrophilic+granulocytes.">Effect of storage on physical and functional properties of extracellular vesicles derived from neutrophilic granulocytes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 25465 (2014).</li><li>Kreke, M., Smith, R., Hanscome, P., Peck, K., Ibrahim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processes+for+producing+stable+exosome+formulations.">Processes for producing stable exosome formulations.</a> US patent. , (2016).</li><li>Frank, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+protect+glucuronidase+model+enzymes+during+freeze-drying.">Extracellular vesicles protect glucuronidase model enzymes during freeze-drying.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12377 (2018).</li><li>Charoenviriyakul, C., Takahashi, Y., Nishikawa, M., Takakura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+exosomes+at+room+temperature+using+lyophilization.">Preservation of exosomes at room temperature using lyophilization.</a> International Journal of Pharmaceutics. 553 (1), 1-7 (2018).</li><li>Kusuma, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+Protect+and+to+Preserve:+Novel+Preservation+Strategies+for+Extracellular+Vesicles.">To Protect and to Preserve: Novel Preservation Strategies for Extracellular Vesicles.</a> Frontiers in Pharmacology. 9 (1199), (2018).</li><li>Haney, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+as+drug+delivery+vehicles+for+Parkinson's+disease+therapy.">Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy.</a> Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).</li><li>Fuhrmann, G., Serio, A., Mazo, M., Nair, R., Stevens, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+loading+into+extracellular+vesicles+significantly+improves+the+cellular+uptake+and+photodynamic+effect+of+porphyrins.">Active loading into extracellular vesicles significantly improves the cellular uptake and photodynamic effect of porphyrins.</a> Journal of Controlled Release. 205, 35-44 (2015).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W. G., Sargent, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+sizing+and+enumeration+by+nanoparticle+tracking+analysis.">Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 19671 (2013).</li><li>Vestad, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+concentration+analyses+of+extracellular+vesicles+by+nanoparticle+tracking+analysis:+a+variation+study.">Size and concentration analyses of extracellular vesicles by nanoparticle tracking analysis: a variation study.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1344087 (2017).</li><li>Bosch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose+prevents+aggregation+of+exosomes+and+cryodamage.">Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage.</a> Scientific Reports. 6, 36162 (2016).</li><li>Bhattacharjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DLS+and+zeta+potential+-+What+they+are+and+what+they+are+not.">DLS and zeta potential - What they are and what they are not.</a> Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).</li><li>Van Deun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+disparate+isolation+methods+for+extracellular+vesicles+on+downstream+RNA+profiling.">The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24858 (2014).</li><li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes.">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li><li>Patel, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+cell+culture+parameters+on+production+and+vascularization+bioactivity+of+mesenchymal+stem+cell-derived+extracellular+vesicles.">Impact of cell culture parameters on production and vascularization bioactivity of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles.</a> Bioengineering &amp; Translational Medicine. 2 (2), 170-179 (2017).</li><li>Gardiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+used+for+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles:+results+of+a+worldwide+survey.">Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945 (2016).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+distinct+nanoparticles+and+subsets+of+extracellular+vesicles+by+asymmetric+flow+field-flow+fractionation.">Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation.</a> Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).</li><li>Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+centrifugation+induces+aggregation+of+extracellular+vesicles.">High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 29509 (2015).</li><li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma.">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).</li></ol>

In dit manuscript presenteren we een uitgebreid protocol om de stabiliteit van EVs onder verschillende opslagomstandigheden te bestuderen. Met de combinatie van ingekapseld glucuronidase als een functionele uitlezing en de evaluatie van de fysisch-chemische parameters van het EVs, het protocol zorgt voor een eenvoudige opslag stabiliteit evaluatie van EVs en de vergelijking van EVs uit verschillende cel Lijnen. SEM en TEM als complementaire methoden maken een inzicht in de veranderingen van de EVs op de single-particle n...

EVs zijn membraan gebonden nanodeeltjes geproduceerd door bijna alle soorten cellen. Voor zoogdiercellen kan EVS worden onderverdeeld in twee hoofdgroepen met verschillende productie trajecten1,2. Membraan blaasjes, met een grootte variëren van ongeveer 100-1000 nm, worden geproduceerd door directe ontluikende uit het celmembraan. Exosomes, sized 30-200 nm, zijn afgeleid van multivesiculaire lichamen gevormd door innerlijke ontluiken in endosomes die vervolgens fuseren met de celmembraan om meerdere Exosomes in een keer vrij te geven. De belangrijkste functie van deze blaasjes is het vervoer van informatie tussen cellen3. Voor dit doel, worden de ladingen zoals RNA, DNA, en proteïnen actief gesorteerd in hen. EVs kan brengen een verscheidenheid van effecten op hun doelstellingen, met implicaties voor zowel gezondheid en ziekte staat. Aan de ene kant, ze bemiddelen positieve effecten, zoals weefselregeneratie, antigeen presentatie, of antibiotica-effecten, waardoor ze veelbelovende doelen voor hun ontwikkeling als therapeutische4,5. Aan de andere kant, EVs kan bevorderen tumor vascularisatie6, omstanders effecten induceren in stressreacties7, en kan een rol spelen bij auto-immuunziekten8 en inflammatoire ziekten9. Aldus, zouden zij een zeer belangrijke component aan een beter begrip van vele pathologische gevolgen kunnen zijn. Echter, de aanwezigheid van veranderde EVS in diverse ziekten, zoals kanker10,11,12 en cardiovasculaire aandoeningen13, en hun gemakkelijke bereikbaarheid in bloed en urine maakt ze ideaal Biomarkers. Ten slotte, hun goede biocompatibiliteit14 en hun inherente targeting vermogen maken EVS ook interessant voor drug delivery15. In dit manuscript beschrijven we een protocol voor de evaluatie van de opslag stabiliteit van EVs afkomstig van zoogdiercellen, een belangrijke eigenschap die nog weinig wordt onderzocht.
Voor de klinische ontwikkeling van EVs, zijn er nog vele hindernissen om16te overwinnen, met inbegrip van de evaluatie van hun therapeutische gevolgen, productie, reiniging, en opslag17. Terwijl-80 °C op grote schaal wordt gezien als de gouden standaard voor EV opslag18, de vereiste diepvriezers zijn duur, en het handhaven van de vereiste koude keten van de productie naar de patiënt kan worden uitdagend. Bovendien, sommige rapporten geven aan dat de opslag bij-80 °c nog steeds niet optimaal EVS behoudt en induceert een verlies in EV functionaliteit19,20. Andere methoden, zoals vriesdrogen21,22 of spray-droging23, zijn voorgesteld als mogelijke alternatieven voor de bevroren opslag van EVS.
De optimale manier om de opslag stabiliteit te beoordelen zou zijn om de EVs te testen in functionele assays of door de evaluatie van een specifieke marker, bijvoorbeeld, hun antibacteriële activiteit19. Dit is mogelijk wanneer het gewenste effect van de blaasjes bekend is en wanneer een afzonderlijke groep van EVs moet worden bestudeerd. Als EVs uit verschillende cel bronnen moet worden vergeleken (bijv. voor drug inkapseling) of als er geen bekende functionele uitlezing is, is het niet langer mogelijk om wijzigingen als gevolg van opslag op een directe manier te beoordelen.
Aan de andere kant, gewoon de evaluatie van veranderingen in hun fysisch-chemische parameters, zoals grootte, deeltjes herstel, en eiwitconcentratie, niet altijd voorspellen veranderingen in EV activiteit, zoals is aangetoond in een recent patent20.
Hier bieden wij een gemakkelijk toepasbare protocol voor het meten van de opslag stabiliteit van EVs door de beoordeling van hun fysisch-chemische parameters in combinatie met de activiteit van een ingekapseld Beta-glucuronidase enzym als een surrogaat voor de lading van de EVs. De lading van het enzym wordt gedaan door saponine incubatie, een milde methode die met EVS van verschillende bronnen21,24,25wordt gevestigd. Saponine vormen voorbijgaande poriën in de EV membraan, die het mogelijk maakt enzym opname in de blaasje. Als enzymen zijn geneigd om hun activiteit te verliezen als onderworpen aan ongunstige opslagomstandigheden, ze zijn een ideale surrogaat voor de evaluatie van het behoud van functionele ladingen van de EVs.
We hebben aangetoond dat de toepassing van dit protocol op EVs afgeleid van menselijke mesenchymale stamcellen (MSCs), menselijke navelstreng endothelial cellen (HUVECs), en de menselijke adenocarcinoom alveolaire epitheelcellen (A549) inderdaad resulteren in grote verschillen in de stabiliteit van de opslag tussen verschillende cel lijnen, die in overweging zouden moeten worden genomen wanneer het kiezen van EV bron21.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:933px;" width="933">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">1,2 dimyristoyl-sn glycero-3-phospho-choline (DMPC)</td>
			<td style="width:315px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P2663-25MG</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-choline (DPPC)</td>
			<td style="width:315px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4329-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">225 cm&#178; cell culture flasks</td>
			<td style="width:315px;">Corning</td>
			<td>431082</td>
			<td>Used with 25 ml of medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">30 kDa regenerated cellulose membrane</td>
			<td style="width:315px;">Wyatt Technology Europe</td>
			<td>1854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">350 &#181;m spacer</td>
			<td style="width:315px;">Wyatt Technology Europe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Automated fraction collector</td>
			<td style="width:315px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Beta-glucuronidase</td>
			<td style="width:315px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7646-100KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Chloroform</td>
			<td style="width:315px;">Fisher scientific</td>
			<td>C/4966/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Column oven</td>
			<td style="width:315px;">Hitachi High-Technologies Europe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">D-(+)-Trehalose dihydrate</td>
			<td style="width:315px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9531-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">DAWN HELEOS II, Multi-angle light scattering detector</td>
			<td style="width:315px;">&#160;Wyatt Technology Europe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Durapore Membrane filter, PVDF,&#160; 0,1&#160;&#181;m, 47&#160;mm</td>
			<td style="width:315px;">Merck</td>
			<td>VVLP04700</td>
			<td>Used for the preparation of buffers for AF4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">EBM-2</td>
			<td style="width:315px;">Lonza Verviers, S.p.r.</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td>Endothelial Cell Growth basal medium, used for the serum free culture of HUVEC cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Eclipse dualtec</td>
			<td style="width:315px;">Wyatt Technology Europe</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">EGM-2</td>
			<td style="width:315px;">Lonza Verviers, S.p.r.</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>Endothelial Cell Growth medium, used for the normal culture of HUVEC cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ELISA Plate Sealers</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>DY992</td>
			<td>used for sealing of 96-well plates for the glucuronidase assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Ethanol</td>
			<td style="width:315px;">Fisher scientific</td>
			<td>E/0665DF/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Extruder Set With Holder/Heating Block</td>
			<td style="width:315px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Filter support</td>
			<td style="width:315px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610014-1EA</td>
			<td>used for liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Fluorescein di-&#946;-D-glucoronide</td>
			<td style="width:315px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F2915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Gibco PBS-tablets+CA10:F36</td>
			<td style="width:315px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Hettich Universal 320 R</td>
			<td>Andreas Hettich GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used for pelleting cells at 300 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Hettich Rotina 420 R</td>
			<td style="width:315px;">Andreas Hettich GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used for pelleting larger debris at 3000 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">HUVEC cells</td>
			<td style="width:315px;">Lonza Verviers, S.p.r.</td>
			<td style="width:119px;">C2517A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Kimble&#160; FlexColumn 1X30CM</td>
			<td style="width:315px;">Kimble</td>
			<td>420401-1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Lyophilizer ALPHA 2-4 LSC</td>
			<td style="width:315px;">Christ</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge Tubes, Polypropylene</td>
			<td>VWR international</td>
			<td style="width:119px;">525-0255</td>
			<td>the tubes used for all EV-handling, found to be more favorable than comparable products from other suppliers regarding particle recovery</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Nanosight LM14 equipped with a green laser</td>
			<td style="width:315px;">Malvern Pananalytical</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Nanosight-software version 3.1</td>
			<td style="width:315px;">Malvern Pananalytical</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">Nucleopore 200 nm track-etch polycarbonate membranes</td>
			<td>Whatman/GE Healthcare</td>
			<td align="right">110406</td>
			<td>used for liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">PEEK Inline filter holder</td>
			<td style="width:315px;">Wyatt Technology Europe</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphotungstic acid hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>79690-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Polycarbonate bottles for ultracentrifugation</td>
			<td style="width:315px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">355622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QuantiPro BCA Assay Kit</td>
			<td style="width:315px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>QPBCA-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Saponin</td>
			<td style="width:315px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Scanning electron microscopy Zeiss EVO HD 15</td>
			<td style="width:315px;">Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Sepharose Cl-2b</td>
			<td style="width:315px;">GE Healthcare</td>
			<td>17014001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">SEM copper grids with carbon film</td>
			<td style="width:315px;">Plano</td>
			<td>S160-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Small AF4 channel</td>
			<td style="width:315px;">Wyatt Technology Europe</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Sputter-coater Q150R ES</td>
			<td style="width:315px;">Quorum Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">Transmission electron microscopy JEOL JEM 2011</td>
			<td style="width:315px;">Oxford Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Type 45 Ti ultracentrifugation rotor</td>
			<td style="width:315px;">Beckman Coulter</td>
			<td>339160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Ultimate 3000 Dionex autosampler</td>
			<td style="width:315px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Ultimate 3000 Dionex isocratic pump</td>
			<td style="width:315px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Ultimate 3000 Dionex online vacuum degasser</td>
			<td style="width:315px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Ultracentrifuge OptimaTM L-90 K</td>
			<td style="width:315px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">UV detector</td>
			<td style="width:315px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Whatman 0.2 &#181;m pore size mixed cellulose filter</td>
			<td>Whatman/GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">10401712</td>
			<td>Used for the filtration of all buffers used with the EVs and in SEC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of the storage stability of extracellular vesicles

Extracellulaire blaasjes (EVs) zijn veelbelovende doelen in het huidige onderzoek, om te worden gebruikt als drugs, drug-carriers, en biomarkers. Voor hun klinische ontwikkeling, niet alleen hun farmaceutische activiteit is belangrijk, maar ook hun productie moet worden geëvalueerd. In dit verband richt het onderzoek zich op het isoleren van EVs, hun karakterisering en hun opslag. Het huidige manuscript beoogt een gemakkelijke procedure te bieden voor de beoordeling van het effect van verschillende opslagomstandigheden op EVs, zonder genetische manipulatie of specifieke functionele analyses. Dit maakt het mogelijk om snel een eerste indruk van de stabiliteit van EVs te krijgen onder een bepaalde opslag conditie, en EVs afgeleid van verschillende bronnen van de cel kan gemakkelijk worden vergeleken. De stabiliteits meting is gebaseerd op de fysisch-chemische parameters van de EVs (grootte, DEELTJESCONCENTRATIE en morfologie) en het behoud van de activiteit van hun lading. De laatste wordt beoordeeld door de saponine-gemedieerde inkapseling van het enzym Beta-glucuronidase in de EVs. Glucuronidase fungeert als een surrogaat en zorgt voor een eenvoudige kwantificering via de splitsing van een fluorescerende reporter molecuul. Het huidige protocol kan een hulpmiddel voor onderzoekers in het zoeken naar opslagomstandigheden die optimaal te behouden EV eigenschappen om EV onderzoek naar klinische toepassing vooraf.

Figuur 1 toont de opslag karakteristieken van EVS geïsoleerd van HUVECs. EVs werden geïsoleerd door UC, glucuronidase werd ingekapseld, en na SEC, de gezuiverde EVs werden geëvalueerd voor hun fysisch-chemische eigenschappen door de transatlantische. Een steekproef van de blaasjes werd later onderworpen aan AF4 reiniging en de glucuronidase activiteit werd gemeten.
De blaasjes werden dan opgeslagen voor 7 d bij 4 °C of-80 °C en bij 4 °C in gelyofiliseerde vorm, in het la...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles at JoVE.com

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Evaluatie van de opslag stabiliteit van extracellulaire blaasjes

Hier presenteren we een gemakkelijk toepasbare protocol om de opslag stabiliteit van de extracellulaire blaasjes te beoordelen, een groep van nature voorkomende nanodeeltjes geproduceerd door cellen. De blaasjes worden geladen met glucuronidase als model enzym en in verschillende omstandigheden opgeslagen. Na opslag worden de fysisch-chemische parameters en de activiteit van het ingekapseld enzym geëvalueerd.

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

De opslagstabiliteit van extra cellulaire akeltjes is een belangrijke parameter voor hun prospectief therapeutisch gebruik. Ons protocol biedt een gemakkelijk toepasbare tool om te evalueren hoe opslag de vesicles beïnvloedt. Het belangrijkste voordeel van onze techniek is dat door de invoering van glucuronidase als een exogene marker, extracellulaire vesikels afgeleid van verschillende oudercellen een gemakkelijk te vergelijken met betrekking tot hun storvermogen.Asymmetrische stroomveld stroom fractionering, of AF4, is een mild alternatief voor grootte uitsluiting chromatografie zuivering voor zeer gevoelige verbindingen. Omdat de verbindingen minder pure stress tegenkomen in het kanaal. Omdat glucuronidase een gevoelig enzym is, profiteert de kwaliteit van de verblijven van een grondige planning en het uitvoeren van de stappen voor zuivering en analyse rug aan rug.Na het kweken van de cellijn van belang volgens de standaard voorwaarden voor die cellen, vervang de supernatant met serum vrij of extra cellulaire vesicle uitgeput medium en de cellen terug te keren naar de cel cultuur incubator voor een extra 24 tot 72 uur. Verzamel aan het einde van de incubatie de supernatant van elke kolf en centrifugeer de monsters om de cellen te bespeuren. Verzamel zorgvuldig het geconditioneerde medium van de cel zonder de pellet te verstoren.En centrifuge het medium weer om celpuin en grote aggregaten te verwijderen. Breng de supernatants vervolgens voorzichtig over in ultracentrifugebuizen. Bij gebruik van een rotor met een vaste hoek, markeer dan de oriëntatie van de buizen in de centrifuge om het ophalen van de extracellulaire blaasjespellet na de centrifugatie te vergemakkelijken.Gebruik aan het einde van de ultracentrifugatie een serologische pipet om de supernatant zorgvuldig weg te gooien zonder de extracellulaire blaasjespellet te verstoren. Bij 200 microliter van 0,2 micrometer gefilterde PBS naar de resterende supernatant van de eerste ultracentrifugebuis. Breng na het opnieuw inleveren van de pellet de resulterende extracellulaire vesiclesuspensie over naar de volgende buis voor resuspensie van de daaropvolgende pellet totdat alle extracellulaire blaasjes zijn opnieuw bespenpend.Voeg bètaglucuronidase toe aan de uiteindelijke geresuspended pelletoplossing tot een uiteindelijke concentratie van 1,5 milligram per milliliter. En saponine tot een laatste concentratie van 0,1 milligram per milliliter. Meng vervolgens goed door drie seconden te vortexen en plaats de reactie gedurende 10 minuten op kamertemperatuur met intermitterende zachte flicking.Zodra de glucuronidase is ingekapseld, moet u alle volgende zuiveringsbeoordelingsstappen op dezelfde dag uitvoeren om onbevooroordeelde resultaten van de stabiliteit van de opslag te verkrijgen. Hebben een grootte uitsluiting chromatografie kolom geëquilibreerd met ten minste twee kolom volumes van PBS klaar om de pellet te zuiveren onmiddellijk na de saponine incubatie. Om te zuiveren, voeg tot 400 microliter extracellulaire vesicle suspensie toe aan de kolom.Verzamel vervolgens een milliliterfractie van het eluaat. Om de scheiding van de extracellulaire vikjes van de besmette eiwitten en vrije glucuronidase te conformeren, meet de eiwitconcentratie door bicinchoninic zuurtest volgens de instructies van de fabrikanten. Gebruik parameters die zijn geoptimaliseerd voor het respectievelijke instrument en het type blaasje, gebruik een nanodeeltjestrackinganalyse-instrument om de extracellulaire vesiclegrootte en -concentratie te meten.Om de glucuronidaseactiviteit te meten, voeg je 25 microliters vers bereide fluorescin di-beta-D-glucuronide toe aan 125 microliters van de gezuiverde extracellulaire vratels en voeg het monster toe aan een put van een zwarte 96-putplaat. Meet de tijd nul fluorescin productie op een plaatlezer op een 480 nanometer excitatie en 516 nanometer emissie. Bedek de plaat stevig met transparante plastic folie om verdamping te verminderen.Dan incubeer de plaat beschermd tegen licht voor 18 uur op 37 graden Celsius. Meet de 18 uur fluorescin productie op de plaatlezer zoals net aangetoond. Voor extracellulaire vesicle lyophilisatie, voeg vier milligram per milliliter trehalose aan de gezuiverde blaasjes.En bevries de apen op min 80 graden Celsius voor ten minste een uur. Om de monsters lyofiel te maken, stel je de planktemperatuur van een lyofieliever op 15 graden Celsius en de druk op 0,180 millibar. Droog de bloemetjes onder deze omstandigheden gedurende 46 uur.Stel aan het einde van de belangrijkste droogstap de planktemperatuur in op 25 graden Celsius en de druk op 0035 millibar en droog de monsters onder deze omstandigheden twee uur. Bewaar vervolgens de gelyofiele monsters op vier graden Celsius. Om de monsters na opslag te hydrateren, voeg een watervolume toe dat gelijk is aan het volume van de extracellulaire vesiclesususpensie voorafgaand aan de lyophilisatie.Om de enzymactiviteit na opslag te beoordelen, laadt u een AF4-instrument met vers geprepareerde PBS van 0,1 micrometer voor de mobiele fase en plaatst u een filtermembraan van 0,1 micrometer in het piekinlaatfilter na de pomp om deeltjesgeluid van het oplosmiddel te verminderen. Reinig na het demonteren het kleine kanaal voor AF4 met millEq water. Hydrateer een nieuw geregenereerd cellulosemembraan met een moleculair gewicht afgesneden van 30 kilodaltons en plaats het membraan bovenop de fret met de glanzende kant omhoog.Plaats een brede 350 micrometer spacer onder de bovenste helft van het kanaal en monteer de kanaaldelen. Met behulp van een koppel schroevendraaier, draai de schroeven eerst tot een koppel van vijf Newton meter, dan tot een koppel van zeven Newton meter. Het aandraaien van de schroeven rond het blok in een kriskras patroon.Sluit de kanalen inlaat, uitlaat, en cross flow poort aan de eclips. Dan van ten minste drie oude monsters om het membraan te equilibreren. Programmeer een fractionatie run met de detector stroom en focus stroom ingesteld op een milliliter per minuut en een inject stroom van 0,2 milliliter per minuut.Na een pre-focus stap van één minuut, injecteer het monster over een periode van 10 minuten in de focus en injecteer stap, alvorens de cross flow te verlagen van twee milliliter per minuut tot 0,1 milliliter per minuut in de loop van acht minuten. Voltooi de fractionatierun met een elutiestap zonder kruisstroom gedurende 10 minuten en voeg een wasstap van elutie en injectie toe, gevolgd door een elutie. Vervolgens equilibrate het kanaal voor de volgende run met een eerste dwarsstroom van twee milliliter per minuut en zet de UV-detector op 280 nanometer.Wanneer alle programma's zijn ingesteld, injecteer 300 microliter van het monster en neem de UV-en lichtverstrooiingssignalen in de ASTRA-software. Na 12 en een halve minuut, beginnen met het verzamelen van een milliliter fracties tot 27 minuten na injectie. Voer vervolgens een glucuronidase test en een nano deeltjes tracking analyse zoals aangetoond.Hier worden het deeltjesterugwinning en de grootte van de extracellulaire akelige akelige cellen geïsoleerd uit menselijke vasculaire endotheelcellen na zeven dagen opslag onder verschillende omstandigheden weergegeven in vergelijking met een vers monster. Vesicles werden vervolgens onderworpen aan AF4 zuivering en de glucuronidase activiteit per deeltje werd gemeten. Zowel grootte uitsluiting chromatografie en AF4 zijn succesvol in het scheiden van extracellulaire vesicle van vrije glucuronidase.Door de hogere mate van scheiding voor AF4 tussen deeltjes en vrij enzym is verontreiniging van de fracties die vesicles bevatten minder waarschijnlijk. AF4 zuivering na opslag verwijdert gratis enzym uit de monsters en verlaagt zo de hoeveelheid teruggewonnen enzymactiviteit per deeltje. Dit effect is het meest prominent na opslag bij vier graden Van Celsius, waarvoor een 2/3 vermindering wordt waargenomen.Het weglaten van deze extra zuiveringsstap kan leiden tot verkeerde veronderstelling over de enzymstabiliteit. Transmissie elektronenmicroscopie onthult geen grote verschillen in vorm voor extracellulaire vesikels lyophilized zonder cryoprotectant. Scanning elektronenmicroscopie imaging, echter, onthult de aanwezigheid van aggregaten in de lyophilized monsters die niet worden gevonden in de min 80 graden opgeslagen monsters.Het is van cruciaal belang dat het vrije enzym vóór de glucuronidasetest uit de vluipen worden verwijderd. Zo moet de techniek die wordt gebruikt voor vesicle zuivering grondig worden geëvalueerd. De gezuiverde deeltjes kunnen ook worden bekeken in termen van hun oppervlaktelading om erachter te komen of de opslag de natuurlijke samenstelling van de membraaneiwitten of suikers veranderde.Met onze techniek is het mogelijk om een eerste indicatie te krijgen over extracellulaire vesicleopslagstabiliteit, zelfs als er geen specifieke markers of tests voor de activiteit beschikbaar zijn.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Magnetic Resonance elastografie methodologie voor de evaluatie van Tissue Engineered Construct groei

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Constant Pressure-gecontroleerde Extrusie werkwijze voor de bereiding van Nano-sized lipide bolletjes

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

De inkapseling van de Cell-free transcriptie en vertaling Machines in Blaasjes voor de bouw van Cellular Mimics

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

Kwantificering en Maat-profilering van extracellulaire blaasjes behulp Melodieuze Resistive Pulse Sensing

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Orbital Tracking in een gemodificeerde twee-foton microscoop: een toepassing op het volgen van intracellulaire blaasjes

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

Papieren Inrichtingen voor isolatie en karakterisering van extracellulaire blaasjes

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Fabricage van extracellulaire matrix-afgeleide schuimen en microdragers Weefsel-specifieke Cell Cultuur en Delivery Platforms

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Primaire verduidelijking van CHO-geoogste celkweekvloeistof met behulp van een akoestische separator

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...

Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants

Etikettering van extracellulaire blaasjes voor het monitoren van migratie en opname in kraakbeenexplantaten

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their ...

Platelet-Derived Extracellular Vesicle Functionalization of Ti Implants

Van bloedplaatjes afgeleide extracellulaire vesikel functionalisatie van Ti-implantaten

Extracellular Vesicles (EVs) are biological nanovesicles that play a key role in cell communication. Their content includes active biomolecules such as ...