Name: evaluation of the storage stability of extracellular vesicles
Uploaded: 2019-05-22T14:30:00
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Le programme de recherche Junior NanoMatFutur du ministère fédéral de l’éducation et de la recherche, Allemagne (Grant number 13XP5029A) a appuyé ce travail. Maximilian Richter a été soutenu par la Studienstiftung des Deutschen Volkes (Fondation allemande des bourses d’études académiques) par le biais d’une bourse de doctorat.

1. culture cellulaire et production de milieu cellulaire
<ol><li>En général, cultiver des cellules dans les conditions individuelles requises pour la lignée cellulaire respective.</li>
	<li>Cultiver les cellules pendant 24-72 h dans des conditions exemptes de sérum ou dans un milieu contenant du sérum bovin foetal (FBS) appauvri en EV. Remarque: si le FBS appauvri en EV est utilisé, utiliser une méthode éprouvée pour épuiser efficacement le sérum, afin de prévenir la contamination par des EVs de bovins d...

<ol>
	<li>Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+and+diagnostic+applications+of+extracellular+vesicles.">Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles.</a> Journal of Controlled Release. 244, 167-183 (2016).</li><li>Fuhrmann, G., Herrmann, I. K., Stevens, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-derived+vesicles+for+drug+therapy+and+diagnostics:+Opportunities+and+challenges.">Cell-derived vesicles for drug therapy and diagnostics: Opportunities and challenges.</a> Nano Today. 10 (3), 397-409 (2015).</li><li>Goes, A., Fuhrmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenic+and+Biomimetic+Carriers+as+Versatile+Transporters+To+Treat+Infections.">Biogenic and Biomimetic Carriers as Versatile Transporters To Treat Infections.</a> ACS Infectious Diseases. 4 (6), 881-892 (2018).</li><li>Gy&#246;rgy, B., Hung, M. E., Breakefield, X. O., Leonard, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+Applications+of+Extracellular+Vesicles:+Clinical+Promise+and+Open+Questions.">Therapeutic Applications of Extracellular Vesicles: Clinical Promise and Open Questions.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 439-464 (2015).</li><li>Schulz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatible+bacteria-derived+vesicles+show+inherent+antimicrobial+activity.">Biocompatible bacteria-derived vesicles show inherent antimicrobial activity.</a> Journal of Controlled Release. 290, 46-55 (2018).</li><li>Feng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+class+of+extracellular+vesicles+from+breast+cancer+cells+activates+VEGF+receptors+and+tumour+angiogenesis.">A class of extracellular vesicles from breast cancer cells activates VEGF receptors and tumour angiogenesis.</a> Nature Communications. 8, 14450 (2017).</li><li>Bewicke-Copley, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+released+following+heat+stress+induce+bystander+effect+in+unstressed+populations.">Extracellular vesicles released following heat stress induce bystander effect in unstressed populations.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1340746 (2017).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+transfer+antigens+to+dendritic+cells+by+releasing+exosomes+containing+dead-cell-associated+antigens+partially+through+a+ceramide-dependent+pathway+to+enhance+CD4(+)+T-cell+responses.">Macrophages transfer antigens to dendritic cells by releasing exosomes containing dead-cell-associated antigens partially through a ceramide-dependent pathway to enhance CD4(+) T-cell responses.</a> Immunology. 149 (2), 157-171 (2016).</li><li>Buzas, E. I., Gy&#246;rgy, B., Nagy, G., Falus, A., Gay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+extracellular+vesicles+in+inflammatory+diseases.">Emerging role of extracellular vesicles in inflammatory diseases.</a> Nature Reviews Rheumatology. 10, 356 (2014).</li><li>Rajappa, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+Astrocytic+Tumor+Progression+Potentiated+by+JAK-mediated+Recruitment+of+Myeloid+Cells.">Malignant Astrocytic Tumor Progression Potentiated by JAK-mediated Recruitment of Myeloid Cells.</a> Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 23 (12), 3109-3119 (2017).</li><li>Umezu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal+miR-135b+shed+from+hypoxic+multiple+myeloma+cells+enhances+angiogenesis+by+targeting+factor-inhibiting+HIF-1.">Exosomal miR-135b shed from hypoxic multiple myeloma cells enhances angiogenesis by targeting factor-inhibiting HIF-1.</a> Blood. 124 (25), 3748-3757 (2014).</li><li>Costa-Silva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer+exosomes+initiate+pre-metastatic+niche+formation+in+the+liver.">Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver.</a> Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).</li><li>Boulanger, C. M., Loyer, X., Rautou, P. -. E., Amabile, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+coronary+artery+disease.">Extracellular vesicles in coronary artery disease.</a> Nature Reviews Cardiology. 14, 259 (2017).</li><li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+toxicity+and+immunogenicity+studies+reveal+minimal+effects+in+mice+following+sustained+dosing+of+extracellular+vesicles+derived+from+HEK293T+cells.">Comprehensive toxicity and immunogenicity studies reveal minimal effects in mice following sustained dosing of extracellular vesicles derived from HEK293T cells.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324730 (2017).</li><li>Vader, P., Mol, E. A., Pasterkamp, G., Schiffelers, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+for+drug+delivery.">Extracellular vesicles for drug delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 106, 148-156 (2016).</li><li>Ingato, D., Lee, J. U., Sim, S. J., Kwon, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Good+things+come+in+small+packages:+Overcoming+challenges+to+harness+extracellular+vesicles+for+therapeutic+delivery.">Good things come in small packages: Overcoming challenges to harness extracellular vesicles for therapeutic delivery.</a> Journal of Controlled Release. 241, 174-185 (2016).</li><li>Gimona, M., Pachler, K., Laner-Plamberger, S., Schallmoser, K., Rohde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manufacturing+of+Human+Extracellular+Vesicle-Based+Therapeutics+for+Clinical+Use.">Manufacturing of Human Extracellular Vesicle-Based Therapeutics for Clinical Use.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1190 (2017).</li><li>Jeyaram, A., Jay, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+and+Storage+Stability+of+Extracellular+Vesicles+for+Therapeutic+Applications.">Preservation and Storage Stability of Extracellular Vesicles for Therapeutic Applications.</a> The AAPS Journal. 20 (1), 1 (2017).</li><li>L&#337;rincz, &. #. 1. 9. 3. ;. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+storage+on+physical+and+functional+properties+of+extracellular+vesicles+derived+from+neutrophilic+granulocytes.">Effect of storage on physical and functional properties of extracellular vesicles derived from neutrophilic granulocytes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 25465 (2014).</li><li>Kreke, M., Smith, R., Hanscome, P., Peck, K., Ibrahim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processes+for+producing+stable+exosome+formulations.">Processes for producing stable exosome formulations.</a> US patent. , (2016).</li><li>Frank, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+protect+glucuronidase+model+enzymes+during+freeze-drying.">Extracellular vesicles protect glucuronidase model enzymes during freeze-drying.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12377 (2018).</li><li>Charoenviriyakul, C., Takahashi, Y., Nishikawa, M., Takakura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+exosomes+at+room+temperature+using+lyophilization.">Preservation of exosomes at room temperature using lyophilization.</a> International Journal of Pharmaceutics. 553 (1), 1-7 (2018).</li><li>Kusuma, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+Protect+and+to+Preserve:+Novel+Preservation+Strategies+for+Extracellular+Vesicles.">To Protect and to Preserve: Novel Preservation Strategies for Extracellular Vesicles.</a> Frontiers in Pharmacology. 9 (1199), (2018).</li><li>Haney, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+as+drug+delivery+vehicles+for+Parkinson's+disease+therapy.">Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy.</a> Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).</li><li>Fuhrmann, G., Serio, A., Mazo, M., Nair, R., Stevens, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+loading+into+extracellular+vesicles+significantly+improves+the+cellular+uptake+and+photodynamic+effect+of+porphyrins.">Active loading into extracellular vesicles significantly improves the cellular uptake and photodynamic effect of porphyrins.</a> Journal of Controlled Release. 205, 35-44 (2015).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W. G., Sargent, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+sizing+and+enumeration+by+nanoparticle+tracking+analysis.">Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 19671 (2013).</li><li>Vestad, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+concentration+analyses+of+extracellular+vesicles+by+nanoparticle+tracking+analysis:+a+variation+study.">Size and concentration analyses of extracellular vesicles by nanoparticle tracking analysis: a variation study.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1344087 (2017).</li><li>Bosch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose+prevents+aggregation+of+exosomes+and+cryodamage.">Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage.</a> Scientific Reports. 6, 36162 (2016).</li><li>Bhattacharjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DLS+and+zeta+potential+-+What+they+are+and+what+they+are+not.">DLS and zeta potential - What they are and what they are not.</a> Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).</li><li>Van Deun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+disparate+isolation+methods+for+extracellular+vesicles+on+downstream+RNA+profiling.">The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24858 (2014).</li><li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes.">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li><li>Patel, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+cell+culture+parameters+on+production+and+vascularization+bioactivity+of+mesenchymal+stem+cell-derived+extracellular+vesicles.">Impact of cell culture parameters on production and vascularization bioactivity of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles.</a> Bioengineering &amp; Translational Medicine. 2 (2), 170-179 (2017).</li><li>Gardiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+used+for+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles:+results+of+a+worldwide+survey.">Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945 (2016).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+distinct+nanoparticles+and+subsets+of+extracellular+vesicles+by+asymmetric+flow+field-flow+fractionation.">Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation.</a> Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).</li><li>Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+centrifugation+induces+aggregation+of+extracellular+vesicles.">High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 29509 (2015).</li><li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma.">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).</li></ol>

Dans ce manuscrit, nous présentons un protocole complet pour étudier la stabilité des véhicules électriques dans des conditions de stockage différentes. Avec la combinaison de glucuronidase encapsulée comme lecture fonctionnelle et l’évaluation des paramètres physicochimiques des EVs, le protocole permet une évaluation simple de la stabilité du stockage des véhicules électriques et la comparaison des EVs de différentes cellules Lignes. SEM et TEM en tant que méthodes complémentaires permettent un aperç...

Les EVs sont des nanoparticules liées à la membrane produites par presque tous les types de cellules. Pour les cellules de mammifères, EVS peut être subdivisé en deux groupes principaux avec des voies de production distinctes1,2. Les vésicules membranaires, d’une taille allant d’environ 100 à 1000 nm, sont produites par le bourgeonnement direct de la membrane cellulaire. Les exosomes, de taille 30-200 nm, sont dérivés de corps multivésiculaires formés par le bourgeonnement vers l’intérieur en endosomes qui fusionnent ensuite avec la membrane cellulaire pour libérer plusieurs exosomes à la fois. La fonction principale de ces vésicules est le transport de l’information entre les cellules3. À cette fin, les cargaisons tels que l’ARN, l’ADN et les protéines sont activement triés en eux. EVs peut transmettre une variété d’effets sur leurs cibles, avec des implications pour la santé et l’état de la maladie. D’un côté, ils médient des effets positifs tels que la régénération tissulaire, la présentation de l’antigène ou les effets antibiotiques, ce qui en fait des cibles propices à leur développement en tant que thérapeutique4,5. De l’autre côté, EVs peut favoriser la vascularisation tumorale6, induire des effets de spectateur dans les réponses de stress7, et pourrait jouer un rôle dans les maladies auto-immunes8 et les maladies inflammatoires9. Ainsi, ils pourraient être un élément clé pour une meilleure compréhension de nombreux effets pathologiques. Cependant, la présence de EVS altérés dans les maladies multiples, comme le cancer10,11,12 et les troubles cardiovasculaires13, et leur accessibilité facile dans le sang et l’urine les rend idéales Biomarqueurs. Enfin, leur bonne biocompatibilité14 et leur capacité de ciblage intrinsèque rendent les EVS aussi intéressants pour la livraison de médicaments15. Dans ce manuscrit, nous décrivons un protocole pour l’évaluation de la stabilité de stockage des EVs dérivées de cellules de mammifères, une propriété importante qui est encore peu étudiée.
Pour le développement clinique des EVs, il y a encore beaucoup d’obstacles à surmonter16, y compris l’évaluation de leurs effets thérapeutiques, la production, la purification, et le stockage17. Alors que-80 ° c est largement considéré comme la norme d’or pour le stockage EV18, les congélateurs requis sont coûteux, et le maintien de la chaîne de froid requis de la production au patient peut être difficile. De plus, certains rapports indiquent que le stockage à-80 ° c ne préserve pas encore de manière optimale EVS et induit une perte dans la fonctionnalité ev19,20. D’autres méthodes, comme le lyophilisation21,22 ou le séchage par pulvérisation23, ont été proposées comme alternatives potentielles au stockage congelé des véhicules électriques.
La meilleure façon d’évaluer la stabilité du stockage serait de tester les EVs dans les essais fonctionnels ou par l’évaluation d’un marqueur spécifique, par exemple, leur activité antibactérienne19. Ceci est possible lorsque l’effet désiré des vésicules est connu et quand un groupe distinct d’EVs doit être étudié. Si des EVs provenant de différentes sources cellulaires doivent être comparées (p. ex. pour l’encapsulation de médicaments) ou s’il n’y a pas de lecture fonctionnelle connue, il n’est plus possible d’évaluer les changements dus au stockage de manière directe.
D’autre part, l’évaluation simple des changements dans leurs paramètres physicochimiques, tels que la taille, la récupération des particules et la concentration des protéines, ne prédit pas toujours les changements dans l’activité EV, comme cela a été démontré dans un brevet récent20.
Ici, nous fournissons un protocole facilement applicable pour mesurer la stabilité de stockage des EVs en évaluant leurs paramètres physicochimiques combinés avec l’activité d’une enzyme bêta-glucuronidase encapsulée comme substitut pour la cargaison du EVs. Le chargement de l’enzyme se fait par incubation de saponine, une méthode légère établie avec des EVS provenant de différentes sources21,24,25. La saponine forme des pores transitoires dans la membrane EV, ce qui permet l’absorption enzymatique dans la vésicule. Comme les enzymes sont sujettes à perdre leur activité si elles sont soumises à des conditions de stockage défavorables, elles constituent un substitut idéal pour l’évaluation de la préservation des cargaisons fonctionnelles des véhicules électriques.
Nous avons démontré que l’application de ce protocole à des EVs dérivées de cellules souches métréchymateuses humaines (MSCs), de cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVECs) et d’adénocarcinome des cellules épithéliales alvéolaires (A549), en effet, entraîne de grandes différences dans stabilité de stockage entre les différentes lignées cellulaires, qui doivent être prises en considération lors du choix de la source EV21.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:933px;" width="933">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">1,2 dimyristoyl-sn glycero-3-phospho-choline (DMPC)</td>
			<td style="width:315px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P2663-25MG</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-choline (DPPC)</td>
			<td style="width:315px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4329-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">225 cm&#178; cell culture flasks</td>
			<td style="width:315px;">Corning</td>
			<td>431082</td>
			<td>Used with 25 ml of medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">30 kDa regenerated cellulose membrane</td>
			<td style="width:315px;">Wyatt Technology Europe</td>
			<td>1854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">350 &#181;m spacer</td>
			<td style="width:315px;">Wyatt Technology Europe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Automated fraction collector</td>
			<td style="width:315px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Beta-glucuronidase</td>
			<td style="width:315px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7646-100KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Chloroform</td>
			<td style="width:315px;">Fisher scientific</td>
			<td>C/4966/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Column oven</td>
			<td style="width:315px;">Hitachi High-Technologies Europe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">D-(+)-Trehalose dihydrate</td>
			<td style="width:315px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9531-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">DAWN HELEOS II, Multi-angle light scattering detector</td>
			<td style="width:315px;">&#160;Wyatt Technology Europe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Durapore Membrane filter, PVDF,&#160; 0,1&#160;&#181;m, 47&#160;mm</td>
			<td style="width:315px;">Merck</td>
			<td>VVLP04700</td>
			<td>Used for the preparation of buffers for AF4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">EBM-2</td>
			<td style="width:315px;">Lonza Verviers, S.p.r.</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td>Endothelial Cell Growth basal medium, used for the serum free culture of HUVEC cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Eclipse dualtec</td>
			<td style="width:315px;">Wyatt Technology Europe</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">EGM-2</td>
			<td style="width:315px;">Lonza Verviers, S.p.r.</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>Endothelial Cell Growth medium, used for the normal culture of HUVEC cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ELISA Plate Sealers</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>DY992</td>
			<td>used for sealing of 96-well plates for the glucuronidase assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Ethanol</td>
			<td style="width:315px;">Fisher scientific</td>
			<td>E/0665DF/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Extruder Set With Holder/Heating Block</td>
			<td style="width:315px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Filter support</td>
			<td style="width:315px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610014-1EA</td>
			<td>used for liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Fluorescein di-&#946;-D-glucoronide</td>
			<td style="width:315px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F2915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Gibco PBS-tablets+CA10:F36</td>
			<td style="width:315px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Hettich Universal 320 R</td>
			<td>Andreas Hettich GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used for pelleting cells at 300 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Hettich Rotina 420 R</td>
			<td style="width:315px;">Andreas Hettich GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used for pelleting larger debris at 3000 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">HUVEC cells</td>
			<td style="width:315px;">Lonza Verviers, S.p.r.</td>
			<td style="width:119px;">C2517A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Kimble&#160; FlexColumn 1X30CM</td>
			<td style="width:315px;">Kimble</td>
			<td>420401-1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Lyophilizer ALPHA 2-4 LSC</td>
			<td style="width:315px;">Christ</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge Tubes, Polypropylene</td>
			<td>VWR international</td>
			<td style="width:119px;">525-0255</td>
			<td>the tubes used for all EV-handling, found to be more favorable than comparable products from other suppliers regarding particle recovery</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Nanosight LM14 equipped with a green laser</td>
			<td style="width:315px;">Malvern Pananalytical</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Nanosight-software version 3.1</td>
			<td style="width:315px;">Malvern Pananalytical</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">Nucleopore 200 nm track-etch polycarbonate membranes</td>
			<td>Whatman/GE Healthcare</td>
			<td align="right">110406</td>
			<td>used for liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">PEEK Inline filter holder</td>
			<td style="width:315px;">Wyatt Technology Europe</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphotungstic acid hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>79690-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Polycarbonate bottles for ultracentrifugation</td>
			<td style="width:315px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">355622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QuantiPro BCA Assay Kit</td>
			<td style="width:315px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>QPBCA-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Saponin</td>
			<td style="width:315px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Scanning electron microscopy Zeiss EVO HD 15</td>
			<td style="width:315px;">Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Sepharose Cl-2b</td>
			<td style="width:315px;">GE Healthcare</td>
			<td>17014001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">SEM copper grids with carbon film</td>
			<td style="width:315px;">Plano</td>
			<td>S160-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Small AF4 channel</td>
			<td style="width:315px;">Wyatt Technology Europe</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Sputter-coater Q150R ES</td>
			<td style="width:315px;">Quorum Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">Transmission electron microscopy JEOL JEM 2011</td>
			<td style="width:315px;">Oxford Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Type 45 Ti ultracentrifugation rotor</td>
			<td style="width:315px;">Beckman Coulter</td>
			<td>339160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Ultimate 3000 Dionex autosampler</td>
			<td style="width:315px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Ultimate 3000 Dionex isocratic pump</td>
			<td style="width:315px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Ultimate 3000 Dionex online vacuum degasser</td>
			<td style="width:315px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Ultracentrifuge OptimaTM L-90 K</td>
			<td style="width:315px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">UV detector</td>
			<td style="width:315px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Whatman 0.2 &#181;m pore size mixed cellulose filter</td>
			<td>Whatman/GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">10401712</td>
			<td>Used for the filtration of all buffers used with the EVs and in SEC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of the storage stability of extracellular vesicles

Les vésicules extracellulaires (EVs) sont des cibles prometteuses dans la recherche actuelle, à utiliser comme médicaments, porteurs de médicaments et biomarqueurs. Pour leur développement clinique, non seulement leur activité pharmaceutique est importante, mais aussi leur production doit être évaluée. Dans ce contexte, la recherche se concentre sur l’isolement des véhicules électriques, leur caractérisation et leur stockage. Le présent manuscrit vise à fournir une procédure facile pour l’évaluation de l’effet des différentes conditions de stockage sur les véhicules électriques, sans manipulation génétique ou essais fonctionnels spécifiques. Cela permet d’obtenir rapidement une première impression de la stabilité des véhicules électriques sous une condition de stockage donnée, et les EVs dérivées de différentes sources de cellules peuvent être comparées facilement. La mesure de stabilité est basée sur les paramètres physicochimiques des EVs (taille, concentration des particules et morphologie) et la préservation de l’activité de leur cargaison. Ce dernier est évalué par l’encapsulation médiée par la saponine de l’enzyme bêta-glucuronidase dans les EVs. La glucuronidase agit comme un substitut et permet une quantification facile par le clivage d’une molécule de reporter fluorescente. Le présent protocole pourrait être un outil pour les chercheurs dans la recherche de conditions de stockage qui conservent de manière optimale les propriétés EV pour faire progresser la recherche EV vers l’application clinique.

La figure 1 affiche les caractéristiques de stockage des véhicules électriques isolés des HUVECs. Les EVs ont été isolés par UC, la glucuronidase a été encapsulée et après la SEC, les EVs purifiées ont été évaluées pour leurs propriétés physicochimiques par NTA. Un échantillon des vésicules a ensuite été soumis à la purification AF4 et l’activité de la glucuronidase a été mesurée.
Les vésicules ont ensuite été entreposées pour 7 d à 4 ° c ou-...

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Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Évaluation de la stabilité du stockage des vésicules extracellulaires

Nous présentons ici un protocole facilement applicable pour évaluer la stabilité du stockage des vésicules extracellulaires, un groupe de nanoparticules naturelles produites par les cellules. Les vésicules sont chargées de glucuronidase en tant qu’enzyme modèle et stockées dans des conditions différentes. Après le stockage, leurs paramètres physicochimiques et l’activité de l’enzyme encapsulée sont évalués.

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

La stabilité de stockage des vésicules cellulaires supplémentaires est un paramètre important pour leur utilisation thérapeutique prospective. Notre protocole fournit un outil facilement applicable pour évaluer comment le stockage a des effets sur les vésicules. Le principal avantage de notre technique est qu’en introduisant la glucuronidase comme marqueur exogène, les vésicules extracellulaires dérivées de différentes cellules mères sont facilement comparées en ce qui concerne leur storabilité.La fractionnement asymétrique du débit du champ d’écoulement, ou AF4, est une alternative douce à la purification de la chromatographie d’exclusion de taille pour les composés très sensibles. Parce que les composés rencontrent moins de stress dans le canal. Comme la glucuronidase est une enzyme sensible, la qualité de la réside bénéficie d’une planification approfondie et la réalisation des étapes pour la purification et l’analyse dos à dos.Après avoir cultivé la ligne d’intérêt cellulaire selon les conditions standard pour ces cellules, remplacer le supernatant par du sérum libre ou extra cellulaire vésicule épuisé moyen et retourner les cellules à l’incubateur de culture cellulaire pour un supplément de 24 à 72 heures. À la fin de l’incubation, recueillir le super natant de chaque flacon et centrifuger les échantillons pour sédimenter les cellules. Recueillir soigneusement le milieu conditionné de la cellule sans déranger la pastille.Et centrifuger le milieu à nouveau pour enlever les débris cellulaires et les gros agrégats. Ensuite, transférez soigneusement les supernatants dans des tubes d’ultracentrifugeuse. Si vous utilisez un rotor à angle fixe, marquez l’orientation des tubes dans la centrifugeuse pour faciliter la récupération de la pastille de vésicule extracellulaire après la centrifugation.À la fin de l’ultracentrifugation, utilisez une pipette sérologique pour jeter soigneusement le supernatant sans perturber la pastille de vésicule extracellulaire. À 200 microlitres de 0,2 micromètre pore filtré PBS au supernatant résiduel du premier tube d’ultracentrifugeuse. Après avoir resuspendu la pastille, transférez la suspension de vésicule extracellulaire résultante au tube suivant pour la résuspension de la pastille suivante jusqu’à ce que toutes les granules de vésicule extracellulaire aient été résuspendus.Ajouter la bêta-glucuronidase à la solution finale de granulés résuspendus à une concentration finale de 1,5 milligramme par millilitre. Et la saponine à une concentration finale de 0,1 milligramme par millilitre. Mélangez ensuite bien en tourbillonnant pendant trois secondes et placez la réaction à température ambiante pendant 10 minutes avec un scintillement doux intermittent.Une fois que le glucuronidase a été encapsulé, assurez-vous d’effectuer toutes les étapes suivantes d’évaluation vésicule de purification le même jour pour obtenir des résultats impartiaux de stabilité de stockage. Avoir une colonne de chromatographie d’exclusion de taille équilibrée avec au moins deux volumes de colonne de PBS prêts à purifier la pastille immédiatement après l’incubation de saponine. Pour purifier, ajouter jusqu’à 400 microlitres de suspension vésicule extracellulaire à la colonne.Puis recueillir une fraction millilitre de l’allongement. Pour se conformer à la séparation des vésicules extracellulaires des protéines contaminantes et de la glucuronidase libre, mesurez la concentration en protéines par analyse d’acide bicinchoninique selon les instructions des fabricants. À l’aide de paramètres optimisés pour le type d’instrument et de vésicule respectifs, utilisez un instrument d’analyse du suivi des nanoparticules pour mesurer la taille et la concentration extracellulaires des vésicules.Pour mesurer l’activité de la glucuronidase, ajouter 25 microlitres de fluorescine di-bêta-D-glucuronide fraîchement préparé à 125 microlitres des vésicules extracellulaires purifiées et ajouter l’échantillon à un puits d’une plaque noire de 96 puits. Mesurez le temps de production zéro fluoréscine sur un lecteur de plaque à une excitation de 480 nanomètres et une émission de 516 nanomètres. Couvrir hermétiquement la plaque de papier d’aluminium transparent pour réduire l’évaporation.Puis incuber la plaque protégée de la lumière pendant 18 heures à 37 degrés Celsius. Mesurez la production de fluorescine de 18 heures sur le lecteur de plaque comme nous venons de le démontrer. Pour la lyophilisation extracellulaire de vésicule, ajoutez quatre milligrammes par millilitre de tréhalose aux vésicules purifiées.Et congeler les vésicules à moins 80 degrés Celsius pendant au moins une heure. Pour lyophiliser les échantillons, réglez la température de conservation d’un lyophilisateur à 15 degrés Celsius et la pression à 0,180 millibars. Séchez les vésicules dans ces conditions pendant 46 heures.À la fin de l’étape de séchage principale, réglez la température du plateau à 25 degrés Celsius et la pression à 0035 millibars et séchez les échantillons pendant deux heures dans ces conditions. Rangez ensuite les échantillons lyophilisés à quatre degrés Celsius. Pour réhydrater les échantillons après stockage, ajouter un volume d’eau égal au volume de la suspension vésicule extracellulaire avant la lyophilisation.Pour évaluer l’activité enzymatique après stockage, chargez un instrument AF4 avec du PBS filtré de 0,1 micromètre fraîchement préparé pour la phase mobile et insérez une membrane filtrante de 0,1 micromètre dans le filtre à entrées de pointe après la pompe pour réduire le bruit des particules du solvant. Après le démontage, nettoyer le petit canal pour AF4 avec de l’eau millEq. Hydratez une nouvelle membrane de cellulose régénérée avec un poids moléculaire coupé de 30 kilodaltons et placez la membrane sur le dessus de la frette avec le côté brillant vers le haut.Placez un large espaceur de 350 micromètres sous la moitié supérieure du canal et assemblez les parties du canal. À l’aide d’un tournevis de couple, serrer les vis d’abord à un couple de cinq mètres Newton, puis à un couple de sept mètres Newton. Serrant les vis autour du bloc dans un modèle sillonné.Connectez l’entrée des canaux, la sortie et le port de flux transbordement à l’éclipse. Puis à partir d’au moins trois vieux échantillons pour équilibrer la membrane. Programmez une fractionnement avec le flux du détecteur et le flux de mise au point réglé à un millilitre par minute et un débit d’injection de 0,2 millilitres par minute.Après une étape de pré-focalisation d’une minute, injecter l’échantillon sur une période de 10 minutes dans la mise au point et injecter l’étape, avant de diminuer le flux de croix de deux millilitres par minute à 0,1 millilitres par minute au cours de huit minutes. Terminer la course de fractionnement avec une étape d’élitution sans écoulement croisé pendant 10 minutes et ajouter une étape de lavage de l’élitution et l’injection, suivie d’une élitution. Ensuite, équilibrer le canal pour la prochaine course avec un flux de croix initiale de deux millilitres par minute et régler le détecteur UV à 280 nanomètres.Lorsque tous les programmes ont été définis, injectez 300 microlitres de l’échantillon et enregistrez les signaux de diffusion UV et lumineux dans le logiciel ASTRA. Après 12 minutes et demie, commencer à recueillir une fraction millilitre jusqu’à 27 minutes après l’injection. Effectuez ensuite un test de glucuronidase et une analyse de suivi des nanoparticules comme démontré.Ici, la récupération des particules et la taille des vésicules extracellulaires isolées des cellules endothéliales vasculaires humaines après sept jours de stockage dans des conditions différentes sont montrées par rapport à un échantillon frais. Des vésicules ont été plus tard soumises à la purification d’AF4 et l’activité de glucuronidase par particule a été mesurée. La chromatographie d’exclusion de taille et AF4 réussissent à séparer la vésicule extracellulaire de la glucuronidase libre.En raison du degré plus élevé de séparation de l’AF4 entre les particules et l’enzyme libre, la contamination des fractions contenant des vésicules est moins probable. La purification AF4 après stockage élimine l’enzyme libre des échantillons et réduit ainsi la quantité d’activité enzymatique récupérée par particule. Cet effet est plus important après stockage à quatre degrés Celsius, pour lequel une réduction de 2/3 est observée.Omettre cette étape de purification supplémentaire peut conduire à une mauvaise hypothèse sur la stabilité de l’enzyme. La microscopie électronique de transmission ne révèle pas de grandes différences de forme pour les vésicules extracellulaires lyophilisées sans cryoprotecteur. La microscopie électronique à balayage révèle toutefois la présence d’agrégats dans les échantillons lyophilisés qui ne se trouvent pas dans les échantillons stockés à moins 80 degrés.Il est crucial que l’enzyme libre soit enlevée des vésicules avant l’essai de glucuronidase. Ainsi, la technique utilisée pour la purification vésicule doit être soigneusement évaluée. Les particules purifiées pourraient également être examinées en fonction de leur charge de surface pour savoir si le stockage a modifié la composition naturelle des protéines membranaires ou des sucres.Avec notre technique, il est possible d’obtenir une première indication sur la stabilité extracellulaire de stockage vésiculeux, même lorsqu’il n’y a pas de marqueurs spécifiques connus ou d’analyses pour l’activité disponible.

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Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants

Marquage des vésicules extracellulaires pour surveiller la migration et l’absorption dans les explants cartilagineux

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Extracellular Vesicles (EVs) are biological nanovesicles that play a key role in cell communication. Their content includes active biomolecules such as ...