Name: evaluation of the storage stability of extracellular vesicles
Uploaded: 2019-05-22T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles at JoVE.com

תוכנית מחקר זוטר של ננו מהמשרד הפדרלי של החינוך והמחקר, גרמניה (גרנט מספר 13XP5029A) תמך בעבודה זו. מקסימיליאן ריכטר נתמך על ידי סטודיו דה Deutschen Volkes (קרן המלגות האקדמית הגרמנית) באמצעות מלגת דוקטורט.

1. תרבות התא והפקת מדיום ממוזג
<ol><li>בדרך כלל, לטפח תאים תחת התנאים הבודדים הנדרשים לקו התא המתאים.</li>
	<li>לטפח את התאים עבור 24-72 h בתנאים ללא סרום או בינוני המכיל סרום העוברי EV מרוקן (FBS). הערה: אם משתמשים ב-EV FBS, להעסיק שיטה שהווכחה ביעילות לרוקן את הנסיוב, כדי למנוע זיהום עם סרום בצורת הפרה EVs<sup...

<ol>
	<li>Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+and+diagnostic+applications+of+extracellular+vesicles.">Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles.</a> Journal of Controlled Release. 244, 167-183 (2016).</li><li>Fuhrmann, G., Herrmann, I. K., Stevens, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-derived+vesicles+for+drug+therapy+and+diagnostics:+Opportunities+and+challenges.">Cell-derived vesicles for drug therapy and diagnostics: Opportunities and challenges.</a> Nano Today. 10 (3), 397-409 (2015).</li><li>Goes, A., Fuhrmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenic+and+Biomimetic+Carriers+as+Versatile+Transporters+To+Treat+Infections.">Biogenic and Biomimetic Carriers as Versatile Transporters To Treat Infections.</a> ACS Infectious Diseases. 4 (6), 881-892 (2018).</li><li>Gy&#246;rgy, B., Hung, M. E., Breakefield, X. O., Leonard, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+Applications+of+Extracellular+Vesicles:+Clinical+Promise+and+Open+Questions.">Therapeutic Applications of Extracellular Vesicles: Clinical Promise and Open Questions.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 439-464 (2015).</li><li>Schulz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatible+bacteria-derived+vesicles+show+inherent+antimicrobial+activity.">Biocompatible bacteria-derived vesicles show inherent antimicrobial activity.</a> Journal of Controlled Release. 290, 46-55 (2018).</li><li>Feng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+class+of+extracellular+vesicles+from+breast+cancer+cells+activates+VEGF+receptors+and+tumour+angiogenesis.">A class of extracellular vesicles from breast cancer cells activates VEGF receptors and tumour angiogenesis.</a> Nature Communications. 8, 14450 (2017).</li><li>Bewicke-Copley, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+released+following+heat+stress+induce+bystander+effect+in+unstressed+populations.">Extracellular vesicles released following heat stress induce bystander effect in unstressed populations.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1340746 (2017).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+transfer+antigens+to+dendritic+cells+by+releasing+exosomes+containing+dead-cell-associated+antigens+partially+through+a+ceramide-dependent+pathway+to+enhance+CD4(+)+T-cell+responses.">Macrophages transfer antigens to dendritic cells by releasing exosomes containing dead-cell-associated antigens partially through a ceramide-dependent pathway to enhance CD4(+) T-cell responses.</a> Immunology. 149 (2), 157-171 (2016).</li><li>Buzas, E. I., Gy&#246;rgy, B., Nagy, G., Falus, A., Gay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+extracellular+vesicles+in+inflammatory+diseases.">Emerging role of extracellular vesicles in inflammatory diseases.</a> Nature Reviews Rheumatology. 10, 356 (2014).</li><li>Rajappa, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+Astrocytic+Tumor+Progression+Potentiated+by+JAK-mediated+Recruitment+of+Myeloid+Cells.">Malignant Astrocytic Tumor Progression Potentiated by JAK-mediated Recruitment of Myeloid Cells.</a> Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 23 (12), 3109-3119 (2017).</li><li>Umezu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal+miR-135b+shed+from+hypoxic+multiple+myeloma+cells+enhances+angiogenesis+by+targeting+factor-inhibiting+HIF-1.">Exosomal miR-135b shed from hypoxic multiple myeloma cells enhances angiogenesis by targeting factor-inhibiting HIF-1.</a> Blood. 124 (25), 3748-3757 (2014).</li><li>Costa-Silva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer+exosomes+initiate+pre-metastatic+niche+formation+in+the+liver.">Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver.</a> Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).</li><li>Boulanger, C. M., Loyer, X., Rautou, P. -. E., Amabile, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+coronary+artery+disease.">Extracellular vesicles in coronary artery disease.</a> Nature Reviews Cardiology. 14, 259 (2017).</li><li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+toxicity+and+immunogenicity+studies+reveal+minimal+effects+in+mice+following+sustained+dosing+of+extracellular+vesicles+derived+from+HEK293T+cells.">Comprehensive toxicity and immunogenicity studies reveal minimal effects in mice following sustained dosing of extracellular vesicles derived from HEK293T cells.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324730 (2017).</li><li>Vader, P., Mol, E. A., Pasterkamp, G., Schiffelers, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+for+drug+delivery.">Extracellular vesicles for drug delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 106, 148-156 (2016).</li><li>Ingato, D., Lee, J. U., Sim, S. J., Kwon, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Good+things+come+in+small+packages:+Overcoming+challenges+to+harness+extracellular+vesicles+for+therapeutic+delivery.">Good things come in small packages: Overcoming challenges to harness extracellular vesicles for therapeutic delivery.</a> Journal of Controlled Release. 241, 174-185 (2016).</li><li>Gimona, M., Pachler, K., Laner-Plamberger, S., Schallmoser, K., Rohde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manufacturing+of+Human+Extracellular+Vesicle-Based+Therapeutics+for+Clinical+Use.">Manufacturing of Human Extracellular Vesicle-Based Therapeutics for Clinical Use.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1190 (2017).</li><li>Jeyaram, A., Jay, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+and+Storage+Stability+of+Extracellular+Vesicles+for+Therapeutic+Applications.">Preservation and Storage Stability of Extracellular Vesicles for Therapeutic Applications.</a> The AAPS Journal. 20 (1), 1 (2017).</li><li>L&#337;rincz, &. #. 1. 9. 3. ;. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+storage+on+physical+and+functional+properties+of+extracellular+vesicles+derived+from+neutrophilic+granulocytes.">Effect of storage on physical and functional properties of extracellular vesicles derived from neutrophilic granulocytes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 25465 (2014).</li><li>Kreke, M., Smith, R., Hanscome, P., Peck, K., Ibrahim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processes+for+producing+stable+exosome+formulations.">Processes for producing stable exosome formulations.</a> US patent. , (2016).</li><li>Frank, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+protect+glucuronidase+model+enzymes+during+freeze-drying.">Extracellular vesicles protect glucuronidase model enzymes during freeze-drying.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12377 (2018).</li><li>Charoenviriyakul, C., Takahashi, Y., Nishikawa, M., Takakura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+exosomes+at+room+temperature+using+lyophilization.">Preservation of exosomes at room temperature using lyophilization.</a> International Journal of Pharmaceutics. 553 (1), 1-7 (2018).</li><li>Kusuma, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+Protect+and+to+Preserve:+Novel+Preservation+Strategies+for+Extracellular+Vesicles.">To Protect and to Preserve: Novel Preservation Strategies for Extracellular Vesicles.</a> Frontiers in Pharmacology. 9 (1199), (2018).</li><li>Haney, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+as+drug+delivery+vehicles+for+Parkinson's+disease+therapy.">Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy.</a> Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).</li><li>Fuhrmann, G., Serio, A., Mazo, M., Nair, R., Stevens, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+loading+into+extracellular+vesicles+significantly+improves+the+cellular+uptake+and+photodynamic+effect+of+porphyrins.">Active loading into extracellular vesicles significantly improves the cellular uptake and photodynamic effect of porphyrins.</a> Journal of Controlled Release. 205, 35-44 (2015).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W. G., Sargent, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+sizing+and+enumeration+by+nanoparticle+tracking+analysis.">Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 19671 (2013).</li><li>Vestad, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+concentration+analyses+of+extracellular+vesicles+by+nanoparticle+tracking+analysis:+a+variation+study.">Size and concentration analyses of extracellular vesicles by nanoparticle tracking analysis: a variation study.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1344087 (2017).</li><li>Bosch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose+prevents+aggregation+of+exosomes+and+cryodamage.">Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage.</a> Scientific Reports. 6, 36162 (2016).</li><li>Bhattacharjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DLS+and+zeta+potential+-+What+they+are+and+what+they+are+not.">DLS and zeta potential - What they are and what they are not.</a> Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).</li><li>Van Deun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+disparate+isolation+methods+for+extracellular+vesicles+on+downstream+RNA+profiling.">The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24858 (2014).</li><li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes.">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li><li>Patel, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+cell+culture+parameters+on+production+and+vascularization+bioactivity+of+mesenchymal+stem+cell-derived+extracellular+vesicles.">Impact of cell culture parameters on production and vascularization bioactivity of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles.</a> Bioengineering &amp; Translational Medicine. 2 (2), 170-179 (2017).</li><li>Gardiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+used+for+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles:+results+of+a+worldwide+survey.">Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945 (2016).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+distinct+nanoparticles+and+subsets+of+extracellular+vesicles+by+asymmetric+flow+field-flow+fractionation.">Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation.</a> Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).</li><li>Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+centrifugation+induces+aggregation+of+extracellular+vesicles.">High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 29509 (2015).</li><li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma.">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).</li></ol>

בכתב יד זה, אנו מציגים פרוטוקול מקיף לחקר יציבותה של EVs תחת תנאי אחסון שונים. עם שילוב של glucuronidase כדורית כבדיקה תפקודית והערכה של הפרמטרים הפיסיוכימיים של EVs, הפרוטוקול מאפשר הערכה ברורה של יציבות האחסון של EVs והשוואה של EVs מתא שונים קווים. SEM ו-TEM כשיטות משלימות מאפשרים תובנה לשינויים של EVs על ...

EVs הם חלקיקים מאוגד קרום המיוצר על ידי כל סוגי התא כמעט. עבור תאים ממיונקים, EVs ניתן לחולק לשתי קבוצות עיקריות עם שבילים הפקה ברורים1,2. שלפוחיות ממברנה, עם טווח גודל של בערך 100-1000 ננומטר, מיוצרים על ידי הנצה ישירה מקרום התא. אקסוזומים, בגודל 30-200 ננומטר, נגזרות מגופים רב שנוצרו על ידי הבנה פנימה לתוך אנזומים כי לאחר מכן הפתיל עם קרום התא כדי לשחרר האקסוזומים מרובים בבת אחת. הפונקציה העיקרית של שלפוחיות אלה היא העברת מידע בין תאים3. למטרה זו, מטענים כגון RNA, DNA, ו חלבונים ממוינים באופן פעיל לתוכם. EVs יכול להעביר מגוון של אפקטים על המטרות שלהם, עם השלכות על מצב בריאות ומחלות הן. בצד אחד, הם מתווכים אפקטים חיוביים כגון התחדשות רקמות, אנטיגן מצגת, או תופעות לאנטיביוטיקה, מה שהופך אותם מטרות מוצלחת עבור הפיתוח שלהם כמו therapeutics4,5. בצד השני, EVs יכול לקדם את הגידול vascularization6, לגרום לתופעות העובר בתגובות מתח7, ו עשוי לשחק תפקיד מחלות אוטואימוניות8 ומחלות דלקתיות9. לכן, הם עשויים להיות מרכיב מפתח להבנה טובה יותר של השפעות פתולוגיים רבות. עם זאת, הנוכחות של EVs שונה במחלות סעפת, כגון סרטן10,11,12 והפרעות לב וכלי דם13, ואת הנגישות הקל שלהם בדם ובשתן עושה אותם אידיאלי סמנים. בסופו של דבר, ביולוגית טובה14 שלהם יכולת מיקוד שלהם להפוך EVs מעניין גם לאספקת סמים15. בכתב יד זה אנו מתארים פרוטוקול להערכת יציבות האחסון של EVs שנגזר מתאי מיונקים, מאפיין חשוב שעדיין נחקר מעט.
עבור הפיתוח הקליני של EVs, יש עדיין מכשולים רבים להתגבר על16, כולל הערכה של ההשפעות הטיפוליות שלהם, ייצור, טיהור, ואחסון17. בעוד-80 ° c הוא ראה נרחב כמו תקן זהב עבור EV אחסון18, מקפיאים נדרשים יקרים, ושמירה על שרשרת קר הנדרש מייצור למטופל יכול להיות מאתגר. יתר על כן, דיווחים מסוימים מצביעים על כך אחסון ב-80 ° c עדיין לא אופטימלית שומרת EVs ומשרה הפסד ב-EV פונקציונליות19,20. שיטות אחרות, כגון הקפאת ייבוש21,22 או ספריי ייבוש23, הוצעו כחלופות פוטנציאליות אחסון קפוא של EVs.
הדרך האופטימלית של הערכת יציבות אחסון יהיה לבחון את EVs באופן פונקציונלי או על ידי הערכה של סמן מסוים, למשל, פעילות אנטיבקטריאלי שלהם19. זה אפשרי כאשר ההשפעה הרצויה של שלפוחיות ידוע וכאשר קבוצה אחת שונה של EVs היא ללמוד. אם EVs ממקורות תא שונים יש להשוות (למשל, עבור עטיפת התרופה) או אם אין בדיקה תפקודית ידועה, אין עוד אפשרות להעריך שינויים עקב אחסון באופן ישיר.
מצד שני, פשוט להעריך שינויים בפרמטרים הפיזיקליים שלהם, כגון גודל, שחזור חלקיקים, וריכוז חלבונים, לא תמיד לחזות שינויים בפעילות EV, כפי שמוצג בפטנט האחרון20.
כאן, אנו מספקים פרוטוקול החלים בקלות למדידת יציבות האחסון של EVs על ידי הערכת הפרמטרים הפיזיקליים שלהם בשילוב עם הפעילות של אנזים בטא glucuronidase כימוע כפונדקאית עבור המטען של EVs. טעינת האנזים נעשית על ידי הדגירה סאפונין, שיטה קלה שהוקמה עם EVs ממקורות שונים21,24,25. Saponin צורות נקבוביות זמניות ב קרום EV, אשר מאפשר ספיגת אנזימים לתוך vesicle. כמו אנזימים נוטים לאבד את פעילותם אם נתון לתנאי אחסון שלילי, הם תחליף אידיאלי להערכת שימור של מטענים פונקציונליים של EVs.
הדגמנו כי היישום של פרוטוקול זה כדי EVs נגזר מתאי גזע האדם mesenchymal (MSCs), הטבור האנושי תאים אנדותל (HUVECs), ו אדנוקרצינומה האדם תאים אפיתל (A549) אכן תוצאה הבדלים גדולים יציבות אחסון בין קווי תאים שונים, אשר יש לקחת בחשבון בעת בחירת מקור EV21.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:933px;" width="933">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">1,2 dimyristoyl-sn glycero-3-phospho-choline (DMPC)</td>
			<td style="width:315px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P2663-25MG</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-choline (DPPC)</td>
			<td style="width:315px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4329-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">225 cm&#178; cell culture flasks</td>
			<td style="width:315px;">Corning</td>
			<td>431082</td>
			<td>Used with 25 ml of medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">30 kDa regenerated cellulose membrane</td>
			<td style="width:315px;">Wyatt Technology Europe</td>
			<td>1854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">350 &#181;m spacer</td>
			<td style="width:315px;">Wyatt Technology Europe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Automated fraction collector</td>
			<td style="width:315px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Beta-glucuronidase</td>
			<td style="width:315px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7646-100KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Chloroform</td>
			<td style="width:315px;">Fisher scientific</td>
			<td>C/4966/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Column oven</td>
			<td style="width:315px;">Hitachi High-Technologies Europe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">D-(+)-Trehalose dihydrate</td>
			<td style="width:315px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9531-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">DAWN HELEOS II, Multi-angle light scattering detector</td>
			<td style="width:315px;">&#160;Wyatt Technology Europe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Durapore Membrane filter, PVDF,&#160; 0,1&#160;&#181;m, 47&#160;mm</td>
			<td style="width:315px;">Merck</td>
			<td>VVLP04700</td>
			<td>Used for the preparation of buffers for AF4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">EBM-2</td>
			<td style="width:315px;">Lonza Verviers, S.p.r.</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td>Endothelial Cell Growth basal medium, used for the serum free culture of HUVEC cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Eclipse dualtec</td>
			<td style="width:315px;">Wyatt Technology Europe</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">EGM-2</td>
			<td style="width:315px;">Lonza Verviers, S.p.r.</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>Endothelial Cell Growth medium, used for the normal culture of HUVEC cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ELISA Plate Sealers</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>DY992</td>
			<td>used for sealing of 96-well plates for the glucuronidase assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Ethanol</td>
			<td style="width:315px;">Fisher scientific</td>
			<td>E/0665DF/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Extruder Set With Holder/Heating Block</td>
			<td style="width:315px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Filter support</td>
			<td style="width:315px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610014-1EA</td>
			<td>used for liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Fluorescein di-&#946;-D-glucoronide</td>
			<td style="width:315px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F2915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Gibco PBS-tablets+CA10:F36</td>
			<td style="width:315px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Hettich Universal 320 R</td>
			<td>Andreas Hettich GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used for pelleting cells at 300 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Hettich Rotina 420 R</td>
			<td style="width:315px;">Andreas Hettich GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used for pelleting larger debris at 3000 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">HUVEC cells</td>
			<td style="width:315px;">Lonza Verviers, S.p.r.</td>
			<td style="width:119px;">C2517A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Kimble&#160; FlexColumn 1X30CM</td>
			<td style="width:315px;">Kimble</td>
			<td>420401-1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Lyophilizer ALPHA 2-4 LSC</td>
			<td style="width:315px;">Christ</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge Tubes, Polypropylene</td>
			<td>VWR international</td>
			<td style="width:119px;">525-0255</td>
			<td>the tubes used for all EV-handling, found to be more favorable than comparable products from other suppliers regarding particle recovery</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Nanosight LM14 equipped with a green laser</td>
			<td style="width:315px;">Malvern Pananalytical</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Nanosight-software version 3.1</td>
			<td style="width:315px;">Malvern Pananalytical</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">Nucleopore 200 nm track-etch polycarbonate membranes</td>
			<td>Whatman/GE Healthcare</td>
			<td align="right">110406</td>
			<td>used for liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">PEEK Inline filter holder</td>
			<td style="width:315px;">Wyatt Technology Europe</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphotungstic acid hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>79690-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Polycarbonate bottles for ultracentrifugation</td>
			<td style="width:315px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">355622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QuantiPro BCA Assay Kit</td>
			<td style="width:315px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>QPBCA-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Saponin</td>
			<td style="width:315px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Scanning electron microscopy Zeiss EVO HD 15</td>
			<td style="width:315px;">Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Sepharose Cl-2b</td>
			<td style="width:315px;">GE Healthcare</td>
			<td>17014001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">SEM copper grids with carbon film</td>
			<td style="width:315px;">Plano</td>
			<td>S160-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Small AF4 channel</td>
			<td style="width:315px;">Wyatt Technology Europe</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Sputter-coater Q150R ES</td>
			<td style="width:315px;">Quorum Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">Transmission electron microscopy JEOL JEM 2011</td>
			<td style="width:315px;">Oxford Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Type 45 Ti ultracentrifugation rotor</td>
			<td style="width:315px;">Beckman Coulter</td>
			<td>339160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Ultimate 3000 Dionex autosampler</td>
			<td style="width:315px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Ultimate 3000 Dionex isocratic pump</td>
			<td style="width:315px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Ultimate 3000 Dionex online vacuum degasser</td>
			<td style="width:315px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Ultracentrifuge OptimaTM L-90 K</td>
			<td style="width:315px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">UV detector</td>
			<td style="width:315px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Whatman 0.2 &#181;m pore size mixed cellulose filter</td>
			<td>Whatman/GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">10401712</td>
			<td>Used for the filtration of all buffers used with the EVs and in SEC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of the storage stability of extracellular vesicles

שלפוחיות שלפוחית (EVs) הם מטרות מבטיחות במחקר הנוכחי, לשמש סמים, סוחרי סמים, ו בסמנים. עבור הפיתוח הקליני שלהם, לא רק פעילות התרופות שלהם חשוב, אלא גם הייצור שלהם צריך להיות מוערך. בהקשר זה, המחקר מתמקד בבידוד של EVs, האפיון שלהם, האחסון שלהם. כתב היד הנוכחי שואפת לספק הליך נתיישב להערכת ההשפעה של תנאי אחסון שונים ב-EVs, ללא מניפולציה גנטית או assays פונקציונלי ספציפי. זה מאפשר במהירות לקבל רושם ראשוני של היציבות של EVs תחת מצב אחסון נתון, ו EVs נגזר ממקורות תאים שונים ניתן להשוות בקלות. מידת היציבות מתבססת על הפרמטרים הפיזיקליים של EVs (גודל, ריכוז חלקיקים ומורפולוגיה) ושימור פעילות המטען שלהם. האחרון הוא העריך על ידי saponin בתיווך עטיפת האנזים ביתא-glucuronidase לתוך EVs. Glucuronidase משמשת כפונדקאית ומאפשרת כימות קלה דרך המחשוף של מולקולת כתב פלורסנט. הפרוטוקול הנוכחי יכול להיות כלי עבור חוקרים בחיפוש אחר תנאי אחסון באופן אופטימלי לשמור על מאפייני EV כדי לקדם מחקר EV לקראת יישום קליני.

איור 1 מציג את מאפייני האחסון של EVs מבודדים מ-HUVECs. EVs היו מבודדים על ידי ה-UC, glucuronidase היה אנקפסולציה, ואחרי שניות, EVs מטוהרים הוערכו על המאפיינים הפיזיקליים שלהם על ידי נ. ב. א. מדגם של שלפוחיות היה נתון לאחר מכן לטיהור AF4 ופעילות glucuronidase נמדד.
השלפוחיות אוחסנו לאחר מכן ל -7...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles at JoVE.com

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

הערכת יציבות האחסון של שלפוחיות ומסחטות

כאן אנו מציגים פרוטוקול החלים בקלות כדי להעריך את יציבות האחסון של שלפוחיות ומסחטות, קבוצה של חלקיקים המתרחשים באופן טבעי המיוצר על ידי תאים. שלפוחיות הם טעונים עם glucuronidase כאנזים מודל מאוחסן בתנאים שונים. לאחר האחסון, הפרמטרים הפיזיקליים שלהם והפעילות של האנזים שעברו האנקפסולציה מוערכים.

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

יציבות האחסון של ורי סלולר נוספים היא פרמטר חשוב לשימוש הטיפולי הפוטנציאלי שלהם. הפרוטוקול שלנו מספק כלי ישים להערכת אופן האחסון של הווסיקים. היתרון העיקרי של הטכניקה שלנו הוא כי על ידי החדרת glucuronidase כמו סמן אקסוגני, וקסים חוץ תאיים הנגזרים מתאים אב שונים ניתן להשוות בקלות לגבי החסידות שלהם.שבר זרימה של שדה זרימה אסימטרי, או AF4, הוא חלופה קלה לטיהור כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל עבור תרכובות רגישות מאוד. כי התרכובות נתקלות בפחות לחץ בערוץ. כמו glucuronidase הוא אנזים רגיש, איכות השוכנים נהנה תכנון יסודי וביצוע השלבים לטיהור וניתוח גב אל גב.לאחר culturing את קו התא של עניין על פי התנאים הסטנדרטיים עבור תאים אלה, להחליף את supernatant עם סרום חינם או תוספת ורירית הסלולר מרוקן בינוני ולהחזיר את התאים החממה תרבות התא במשך 24 עד 72 שעות נוספות. בסוף הדגירה, לאסוף את natant סופר מכל בקבוק צנטריפוגה את הדגימות כדי להכביד על התאים. בזהירות לאסוף את התא מותנה בינוני מבלי להפריע גלולה.וצנטריפוגה המדיום שוב כדי להסיר פסולת תא אגרגטים גדולים. לאחר מכן מעבירים בזהירות את העל-טבעיים לצינורות אולטרה-מרכזיים. אם אתה משתמש ברוטור זווית קבועה, סמן את כיוון הצינורות בצנטריפוגה כדי להקל על אחזור גלולת הווסקולרית החוץ-תאית לאחר הצנטריפוגה.בסוף האולטרה-צנטריפוגה, השתמשו בפיפטה סרולוגית כדי להשליך בזהירות את העל-טבעי מבלי להפריע לכדור הדם החוץ-תאי. ב-200 מיקרוליטרים של נקבובית מיקרומטר 0.2 סיננו את PBS לשאריות העל-טבעיות של צינור האולטרה-מרכזי הראשון. לאחר שימוש חוזר את גלולה, להעביר את ההשעיה חוץ תאית וכתוצאה מכך לצינור הבא עבור התדלוק של גלולה הבאה עד כל כדורי חוץ חוץ תאיים כבר resuspended.הוסף בטא glucuronidase לפתרון גלולה resuspended הסופי לריכוז הסופי של 1.5 מיליגרם למיליליטר. וספונין לריכוז סופי של 0.1 מיליגרם למיליליטר. לאחר מכן מערבבים היטב על ידי מערבולת במשך שלוש שניות ומ מניחים את התגובה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות עם הבהוב עדין לסירוגין.לאחר glucuronidase כבר עכוף, הקפד לבצע את כל השלבים הבאים הערכה תקן טיהור באותו יום כדי להשיג תוצאות יציבות אחסון משוחדת. יש עמודת כרומטוגרפיה אי-הכללה בגודל שמצויידת בלפחות שני כרכים של עמודות של PBS המוכנים לטהר את גלולת הכדור מיד לאחר הדגירה של סאפונין. כדי לטהר, להוסיף עד 400 microliters של השעיה חוץ תאית חוץ תאית לעמודה.ואז לאסוף שבר אחד מיליליטר של eluate. כדי להתאים את ההפרדה של וקסיקים חוץ תאיים מן החלבונים המזהמים glucuronidase חינם, למדוד את ריכוז החלבון על ידי אסאי חומצה ביצינצ'ונית על פי הוראות היצרנים. באמצעות פרמטרים המותאמים עבור המכשיר וסוג הווסקל המתאים, השתמש במכשיר ניתוח מעקב חלקיקי ננו כדי למדוד את גודל וריכוז ולררית החוץ-תאית.כדי למדוד את פעילות glucuronidase, להוסיף 25 microliters של פלואורצין די בטא-D-Glucuronide מוכן טרי ל 125 microliters של ורידים חוץ תאיים מטוהרים ולהוסיף את המדגם לגם אחד של צלחת שחורה 96 היטב. למדוד את הזמן אפס ייצור פלואורצין על קורא צלחת ב 480 ננומטר העירור ו 516 פליטת ננומטר. מכסים את הצלחת בחוזקה בנייר כסף שקוף כדי להפחית את האידוי.ואז לה הדגירה את הצלחת מוגנת מפני אור במשך 18 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. למדוד את ייצור פלואורצין 18 שעות על קורא הלוח כפי שהוכח רק. עבור ליופיפיליזציה חוץ-תאית של דם, יש להוסיף ארבעה מיליגרם למיליליטר טרהלוז לווסיקלים המטוהרים.ולהקפיא את הווסיקים במינוס 80 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפחות. כדי lyophilize את הדגימות, להגדיר את טמפרטורת המדף של lyophilizer ל 15 מעלות צלזיוס ואת הלחץ ל 0.180 מיליבארים. יבש את הווסיקים בתנאים אלה במשך 46 שעות.בסוף שלב הייבוש העיקרי, הגדר את טמפרטורת המדף ל -25 מעלות צלזיוס ואת הלחץ ל 0035 מיליבארים ולייבש את הדגימות במשך שעתיים בתנאים אלה. ואז לאחסן את דגימות ליופילים בארבע מעלות צלזיוס. כדי rehydrate את הדגימות לאחר האחסון, להוסיף נפח מים שווה לנפח של ההשעיה חוץ תאית לפני lyophilization.כדי להעריך את פעילות האנזים לאחר האחסון, לטעון מכשיר AF4 עם PBS מסונן 0.1 מיקרומטר מוכן טרי לשלב הנייד ולהכניס קרום מסנן מיקרומטר 0.1 לתוך מסנן הכניסה שיא לאחר המשאבה כדי להפחית את רעש החלקיק מן הממס. לאחר פירוק, לנקות את התעלה הקטנה עבור AF4 עם מי millEq. לחות קרום תאית חדש מחדש עם משקל מולקולרי לחתוך של 30 קילודאלטון ולהציב את הממברנה על גבי fret עם הצד המבריק למעלה.מניחים רווח רחב של 350 מיקרומטר מתחת לחצי העליון של הערוץ ומרכיבים את חלקי הערוץ. באמצעות מברג נוי, הדק את הברגים תחילה למומנט של חמישה מטרים של ניוטון, ולאחר מכן לממנט של שבעה מטרים של ניוטון. הידוק הברגים סביב הבלוק בתבנית שתי וערב.חבר את יציאת הערוצים, השקע והזרימה הצולבת לליקוי החמה. ואז מלפחות שלוש דגימות ישנות כדי לצייד את הממברנה. תוכנית שבר לרוץ עם זרימת גלאי וזרימת מיקוד מוגדר מיליליטר אחד לדקה וזרימת הזרקה של 0.2 מיליליטר לדקה.לאחר צעד אחד לפני המיקוד, להזריק את המדגם על פני תקופה של 10 דקות בפוקוס ולהזריק צעד, לפני הפחתת זרימת הצלב משני מיליליטר לדקה ל 0.1 מיליליטר לדקה במהלך שמונה דקות. לסיים את השבר לרוץ עם צעד אלוטיון ללא זרימה צולבת במשך 10 דקות ולהוסיף שלב כביסה של אלוטיון והזרקה, ואחריו אלוטיון. לאחר מכן לצייד את הערוץ להפעלה הבאה עם זרימה צולבת ראשונית של שני מיליליטר לדקה ולהגדיר את גלאי UV ל 280 ננומטר.כאשר כל התוכניות נקבעו, להזריק 300 microliters של המדגם ולהקליט את אותות פיזור UV ואור בתוכנת ASTRA. לאחר 12 וחצי דקות, להתחיל לאסוף שבר אחד מיליליטר עד 27 דקות לאחר הזרקת. לאחר מכן לבצע בדיקה glucuronidase וניתוח מעקב חלקיקים ננו כפי שהוכח.כאן, התאוששות החלקיקים ואת הגודל של וקסיקים חוץ תאיים מבודדים תאים אנדותל כלי דם אנושיים לאחר שבעה ימים של אחסון בתנאים שונים מוצגים בהשוואה לדגימה טרייה. וקסקלים היו נתונים לאחר מכן לטיהור AF4 ופעילות הגלוקורונידה לכל חלקיק נמדדה. הן כרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל והן AF4 מצליחות להפריד בין ורידים חוץ-תאיים לבין גלוקוקורונידס חופשי.בשל דרגת ההפרדה הגבוהה יותר עבור AF4 בין חלקיקים ואנזים חופשי, זיהום של שברים המכילים ווסיקים הוא פחות סביר. טיהור AF4 לאחר אחסון מסיר אנזים חינם מן הדגימות ובכך מוריד את כמות פעילות האנזים התאושש לכל חלקיק. אפקט זה בולט ביותר לאחר אחסון בארבע מעלות צלזיוס, שעבורו נצפתה הפחתה של 2/3.השמטת שלב טיהור נוסף זה עלולה להוביל להנחה שגויה לגבי יציבות האנזים. מיקרוסקופ אלקטרונים שידור אינו חושף הבדלים גדולים בצורה עבור סטרוקולרים חוץ תאיים lyophilized ללא cryoprotectant. סריקת הדמיה מיקרוסקופית אלקטרונים, לעומת זאת, מגלה את נוכחותם של אגרגטים בתוך דגימות ליופילים שלא נמצאו בדגימות מאוחסנות מינוס 80 מעלות.זה חיוני כי אנזים חינם מוסר מן הווסיקים לפני מוצף glucuronidase. לכן, הטכניקה המשמשת לטיהור וויסקל צריך להיות מוערך ביסודיות. ניתן גם לבדוק את החלקיקים המטוהרים במונחים של מטען פני השטח שלהם כדי לגלות אם האחסון שינה את ההרכב הטבעי של חלבוני הממברנה או הסוכרים.עם הטכניקה שלנו, ניתן לקבל אינדיקציה ראשונה על יציבות אחסון חוץ חוץ תאי, גם כאשר אין סמנים ספציפיים ידועים או תן עבור הפעילות הזמינה.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

תהודה מגנטית elastography מתודולוגיה להערכת של רקמות מהונדסות צמיחה Construct

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

שחול קבוע לחץ שבשליטת שיטה להכנת בגודל ננו שלפוחית ​​שומנים

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Encapsulation של תמלול נטול סלולרי ומכונות בתרגום לשלפוחית ​​לבניית מחקה סלולרי

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

כימות וגודל-פרופיל של תאית שלפוחית ​​באמצעות Pulse חישה מתכוונן התנגדותי

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Orbital מעקב במיקרוסקופ שני פוטונים השתנה: בקשה למעקב של תאיים שלפוחית

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

מכשירים מבוססי נייר לבידוד ואפיון של תאית שלפוחית

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

ייצור של תאי מטריקס הנגזרות קצפים Microcarriers כמו תרבית תאי רקמות ספציפיות פלטפורמות משלוח

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

הבהרה ראשונית של נוזל תרבית תאים שנקטפו על ידי CHO באמצעות מפריד אקוסטי

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...

Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants

תיוג של שלל חוץ-תאי לניטור הגירה וספיגה של סחוס

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their ...

Platelet-Derived Extracellular Vesicle Functionalization of Ti Implants

תפקוד ארסיות חוץ-תאית שמקורה בטסיות דם של שתלי Ti

Extracellular Vesicles (EVs) are biological nanovesicles that play a key role in cell communication. Their content includes active biomolecules such as ...