Name: evaluation of the storage stability of extracellular vesicles
Uploaded: 2019-05-22T14:30:00
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Il programma di ricerca di NanoMatFutur Junior del Ministero federale dell'istruzione e della ricerca, Germania (Grant Number 13XP5029A) ha sostenuto questo lavoro. Maximilian Richter è stato sostenuto dalla Studienstiftung des deutschen Volkes (Fondazione tedesca per le borse accademiche) attraverso una borsa di studio di dottorato.

1. coltura cellulare e produzione di supporti cellulari condizionati
<ol><li>In genere, coltivare le cellule nelle condizioni individuali necessarie per la rispettiva linea cellulare.</li>
	<li>Coltivare le cellule per 24-72 h in condizioni prive di siero o in media contenenti siero bovino fetale impoverito EV (FBS). Nota: se si utilizza FBS EV-impoverito, impiegare un metodo provato a esaurire efficacemente il siero, per prevenire la contaminazione con i bovini derivati da siero bovino26.</l...

<ol>
	<li>Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+and+diagnostic+applications+of+extracellular+vesicles.">Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles.</a> Journal of Controlled Release. 244, 167-183 (2016).</li><li>Fuhrmann, G., Herrmann, I. K., Stevens, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-derived+vesicles+for+drug+therapy+and+diagnostics:+Opportunities+and+challenges.">Cell-derived vesicles for drug therapy and diagnostics: Opportunities and challenges.</a> Nano Today. 10 (3), 397-409 (2015).</li><li>Goes, A., Fuhrmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenic+and+Biomimetic+Carriers+as+Versatile+Transporters+To+Treat+Infections.">Biogenic and Biomimetic Carriers as Versatile Transporters To Treat Infections.</a> ACS Infectious Diseases. 4 (6), 881-892 (2018).</li><li>Gy&#246;rgy, B., Hung, M. E., Breakefield, X. O., Leonard, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+Applications+of+Extracellular+Vesicles:+Clinical+Promise+and+Open+Questions.">Therapeutic Applications of Extracellular Vesicles: Clinical Promise and Open Questions.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 439-464 (2015).</li><li>Schulz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatible+bacteria-derived+vesicles+show+inherent+antimicrobial+activity.">Biocompatible bacteria-derived vesicles show inherent antimicrobial activity.</a> Journal of Controlled Release. 290, 46-55 (2018).</li><li>Feng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+class+of+extracellular+vesicles+from+breast+cancer+cells+activates+VEGF+receptors+and+tumour+angiogenesis.">A class of extracellular vesicles from breast cancer cells activates VEGF receptors and tumour angiogenesis.</a> Nature Communications. 8, 14450 (2017).</li><li>Bewicke-Copley, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+released+following+heat+stress+induce+bystander+effect+in+unstressed+populations.">Extracellular vesicles released following heat stress induce bystander effect in unstressed populations.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1340746 (2017).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+transfer+antigens+to+dendritic+cells+by+releasing+exosomes+containing+dead-cell-associated+antigens+partially+through+a+ceramide-dependent+pathway+to+enhance+CD4(+)+T-cell+responses.">Macrophages transfer antigens to dendritic cells by releasing exosomes containing dead-cell-associated antigens partially through a ceramide-dependent pathway to enhance CD4(+) T-cell responses.</a> Immunology. 149 (2), 157-171 (2016).</li><li>Buzas, E. I., Gy&#246;rgy, B., Nagy, G., Falus, A., Gay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+extracellular+vesicles+in+inflammatory+diseases.">Emerging role of extracellular vesicles in inflammatory diseases.</a> Nature Reviews Rheumatology. 10, 356 (2014).</li><li>Rajappa, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+Astrocytic+Tumor+Progression+Potentiated+by+JAK-mediated+Recruitment+of+Myeloid+Cells.">Malignant Astrocytic Tumor Progression Potentiated by JAK-mediated Recruitment of Myeloid Cells.</a> Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 23 (12), 3109-3119 (2017).</li><li>Umezu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal+miR-135b+shed+from+hypoxic+multiple+myeloma+cells+enhances+angiogenesis+by+targeting+factor-inhibiting+HIF-1.">Exosomal miR-135b shed from hypoxic multiple myeloma cells enhances angiogenesis by targeting factor-inhibiting HIF-1.</a> Blood. 124 (25), 3748-3757 (2014).</li><li>Costa-Silva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer+exosomes+initiate+pre-metastatic+niche+formation+in+the+liver.">Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver.</a> Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).</li><li>Boulanger, C. M., Loyer, X., Rautou, P. -. E., Amabile, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+coronary+artery+disease.">Extracellular vesicles in coronary artery disease.</a> Nature Reviews Cardiology. 14, 259 (2017).</li><li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+toxicity+and+immunogenicity+studies+reveal+minimal+effects+in+mice+following+sustained+dosing+of+extracellular+vesicles+derived+from+HEK293T+cells.">Comprehensive toxicity and immunogenicity studies reveal minimal effects in mice following sustained dosing of extracellular vesicles derived from HEK293T cells.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324730 (2017).</li><li>Vader, P., Mol, E. A., Pasterkamp, G., Schiffelers, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+for+drug+delivery.">Extracellular vesicles for drug delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 106, 148-156 (2016).</li><li>Ingato, D., Lee, J. U., Sim, S. J., Kwon, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Good+things+come+in+small+packages:+Overcoming+challenges+to+harness+extracellular+vesicles+for+therapeutic+delivery.">Good things come in small packages: Overcoming challenges to harness extracellular vesicles for therapeutic delivery.</a> Journal of Controlled Release. 241, 174-185 (2016).</li><li>Gimona, M., Pachler, K., Laner-Plamberger, S., Schallmoser, K., Rohde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manufacturing+of+Human+Extracellular+Vesicle-Based+Therapeutics+for+Clinical+Use.">Manufacturing of Human Extracellular Vesicle-Based Therapeutics for Clinical Use.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1190 (2017).</li><li>Jeyaram, A., Jay, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+and+Storage+Stability+of+Extracellular+Vesicles+for+Therapeutic+Applications.">Preservation and Storage Stability of Extracellular Vesicles for Therapeutic Applications.</a> The AAPS Journal. 20 (1), 1 (2017).</li><li>L&#337;rincz, &. #. 1. 9. 3. ;. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+storage+on+physical+and+functional+properties+of+extracellular+vesicles+derived+from+neutrophilic+granulocytes.">Effect of storage on physical and functional properties of extracellular vesicles derived from neutrophilic granulocytes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 25465 (2014).</li><li>Kreke, M., Smith, R., Hanscome, P., Peck, K., Ibrahim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processes+for+producing+stable+exosome+formulations.">Processes for producing stable exosome formulations.</a> US patent. , (2016).</li><li>Frank, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+protect+glucuronidase+model+enzymes+during+freeze-drying.">Extracellular vesicles protect glucuronidase model enzymes during freeze-drying.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12377 (2018).</li><li>Charoenviriyakul, C., Takahashi, Y., Nishikawa, M., Takakura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+exosomes+at+room+temperature+using+lyophilization.">Preservation of exosomes at room temperature using lyophilization.</a> International Journal of Pharmaceutics. 553 (1), 1-7 (2018).</li><li>Kusuma, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+Protect+and+to+Preserve:+Novel+Preservation+Strategies+for+Extracellular+Vesicles.">To Protect and to Preserve: Novel Preservation Strategies for Extracellular Vesicles.</a> Frontiers in Pharmacology. 9 (1199), (2018).</li><li>Haney, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+as+drug+delivery+vehicles+for+Parkinson's+disease+therapy.">Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy.</a> Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).</li><li>Fuhrmann, G., Serio, A., Mazo, M., Nair, R., Stevens, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+loading+into+extracellular+vesicles+significantly+improves+the+cellular+uptake+and+photodynamic+effect+of+porphyrins.">Active loading into extracellular vesicles significantly improves the cellular uptake and photodynamic effect of porphyrins.</a> Journal of Controlled Release. 205, 35-44 (2015).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W. G., Sargent, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+sizing+and+enumeration+by+nanoparticle+tracking+analysis.">Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 19671 (2013).</li><li>Vestad, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+concentration+analyses+of+extracellular+vesicles+by+nanoparticle+tracking+analysis:+a+variation+study.">Size and concentration analyses of extracellular vesicles by nanoparticle tracking analysis: a variation study.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1344087 (2017).</li><li>Bosch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose+prevents+aggregation+of+exosomes+and+cryodamage.">Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage.</a> Scientific Reports. 6, 36162 (2016).</li><li>Bhattacharjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DLS+and+zeta+potential+-+What+they+are+and+what+they+are+not.">DLS and zeta potential - What they are and what they are not.</a> Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).</li><li>Van Deun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+disparate+isolation+methods+for+extracellular+vesicles+on+downstream+RNA+profiling.">The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24858 (2014).</li><li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes.">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li><li>Patel, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+cell+culture+parameters+on+production+and+vascularization+bioactivity+of+mesenchymal+stem+cell-derived+extracellular+vesicles.">Impact of cell culture parameters on production and vascularization bioactivity of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles.</a> Bioengineering &amp; Translational Medicine. 2 (2), 170-179 (2017).</li><li>Gardiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+used+for+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles:+results+of+a+worldwide+survey.">Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945 (2016).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+distinct+nanoparticles+and+subsets+of+extracellular+vesicles+by+asymmetric+flow+field-flow+fractionation.">Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation.</a> Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).</li><li>Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+centrifugation+induces+aggregation+of+extracellular+vesicles.">High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 29509 (2015).</li><li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma.">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).</li></ol>

In questo manoscritto, presentiamo un protocollo completo per studiare la stabilità dei veicoli elettrici in diverse condizioni di conservazione. Con la combinazione di glucuronidasi incapsulata come lettura funzionale e la valutazione dei parametri fisico-chimici degli EV, il protocollo consente una semplice valutazione della stabilità dello stoccaggio dei veicoli elettrici e il confronto di EVs da diverse cellule Linee. SEM e TEM come metodi complementari consentono una panoramica dei cambiamenti dei veicoli elettric...

Gli EV sono nanoparticelle legate a membrana prodotte da quasi tutti i tipi di cellule. Per le cellule di mammifero, i veicoli elettrici possono essere suddivisi in due gruppi principali con percorsi di produzione distinti1,2. Le vescicole di membrana, con una gamma di dimensioni da circa 100-1000 Nm, sono prodotte da erba diretta dalla membrana cellulare. Gli esosomi, di dimensioni 30-200 Nm, derivano da corpi multivesicolari formati dall'interno in erba in endosomi che successivamente si fondono con la membrana cellulare per rilasciare più esosomi contemporaneamente. La funzione principale di queste vescicole è il trasporto di informazioni tra le cellule3. A questo scopo, i carichi come RNA, DNA e proteine sono attivamente ordinati in loro. I veicoli elettrici possono trasmettere una varietà di effetti sui loro bersagli, con implicazioni sia per la salute che per lo stato di malattia. Da un lato, essi mediano effetti positivi come la rigenerazione dei tessuti, presentazione di antigene, o effetti antibiotici, che li rende obiettivi propizi per il loro sviluppo come Therapeutics4,5. Dall'altro lato, gli EV possono promuovere la vascolarizzazione tumorale6, indurre gli effetti spettatore nelle risposte di stress7, e potrebbe svolgere un ruolo nelle malattie autoimmuni8 e malattie infiammatorie9. Così, potrebbero essere un componente chiave per una migliore comprensione di molti effetti patologici. Tuttavia, la presenza di EV alterati in molteplici malattie, come il cancro10,11,12 e disturbi cardiovascolari13, e la loro facile accessibilità nel sangue e nelle urine li rende ideali Biomarcatori. Infine, la loro buona biocompatibilità14 e la loro intrinseca capacità di targeting rendono gli EVS anche interessanti per la consegna di farmaci15. In questo manoscritto, descriviamo un protocollo per la valutazione della stabilità di stoccaggio dei veicoli elettrici derivati da cellule di mammiferi, una proprietà importante che è ancora poco indagata.
Per lo sviluppo clinico di EV, ci sono ancora molti ostacoli per superare16, tra cui la valutazione dei loro effetti terapeutici, produzione, purificazione, e stoccaggio17. Mentre-80 ° c è ampiamente visto come il gold standard per lo stoccaggio di EV18, i congelatori necessari sono costosi, e mantenere la catena di freddo necessaria dalla produzione al paziente può essere impegnativo. Inoltre, alcune segnalazioni indicano che la conservazione a-80 ° c non conserva in modo ottimale le SVE e induce una perdita della funzionalità EV19,20. Altri metodi, come la liofilizzazione21,22 o l'essiccazione a spruzzo23, sono stati proposti come potenziali alternative alla conservazione congelata di EVS.
Il modo ottimale per valutare la stabilità dello stoccaggio sarebbe quello di testare i veicoli elettrici in saggi funzionali o la valutazione di un marcatore specifico, ad esempio, la loro attività antibatterica19. Questo è possibile quando l'effetto desiderato delle vescicole è noto e quando un gruppo distinto di EV deve essere studiato. Se i veicoli elettrici provenienti da diverse fonti cellulari devono essere confrontati (ad esempio, per l'incapsulamento dei farmaci) o se non esiste una lettura funzionale nota, non è più possibile valutare le modifiche dovute allo stoccaggio in modo diretto.
D'altra parte, semplicemente valutando i cambiamenti nei loro parametri fisico-chimici, come la dimensione, il recupero delle particelle, e la concentrazione proteica, non sempre prevedere i cambiamenti nell'attività EV, come è stato dimostrato in un recente brevetto20.
Qui, forniamo un protocollo prontamente applicabile per misurare la stabilità di stoccaggio dei veicoli elettrici valutando i loro parametri fisico-chimici combinati con l'attività di un enzima beta-glucuronidasi incapsulato come surrogato per il carico dei veicoli elettrici. Il carico dell'enzima è fatto da incubazione di saponina, un metodo delicato stabilito con EVS da diverse fonti21,24,25. La saponina forma i pori transitori nella membrana EV, che consente l'assorbimento enzimatico nella vescicola. Poiché gli enzimi sono inclini a perdere la loro attività se sottoposti a condizioni di conservazione sfavorevoli, sono un surrogato ideale per la valutazione della conservazione dei carichi funzionali dei veicoli elettrici.
Abbiamo dimostrato che l'applicazione di questo protocollo agli EVs derivati da cellule staminali mesenchimali umane (MSC), cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVECs) e cellule epiteliali alveolari dell'adenocarcinoma umano (A549) si traducono in grandi differenze nel stabilità di stoccaggio tra le diverse linee cellulari, che dovrebbe essere presa in considerazione quando si sceglie la sorgente EV21.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:933px;" width="933">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">1,2 dimyristoyl-sn glycero-3-phospho-choline (DMPC)</td>
			<td style="width:315px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P2663-25MG</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-choline (DPPC)</td>
			<td style="width:315px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4329-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">225 cm&#178; cell culture flasks</td>
			<td style="width:315px;">Corning</td>
			<td>431082</td>
			<td>Used with 25 ml of medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">30 kDa regenerated cellulose membrane</td>
			<td style="width:315px;">Wyatt Technology Europe</td>
			<td>1854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">350 &#181;m spacer</td>
			<td style="width:315px;">Wyatt Technology Europe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Automated fraction collector</td>
			<td style="width:315px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Beta-glucuronidase</td>
			<td style="width:315px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7646-100KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Chloroform</td>
			<td style="width:315px;">Fisher scientific</td>
			<td>C/4966/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Column oven</td>
			<td style="width:315px;">Hitachi High-Technologies Europe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">D-(+)-Trehalose dihydrate</td>
			<td style="width:315px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9531-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">DAWN HELEOS II, Multi-angle light scattering detector</td>
			<td style="width:315px;">&#160;Wyatt Technology Europe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Durapore Membrane filter, PVDF,&#160; 0,1&#160;&#181;m, 47&#160;mm</td>
			<td style="width:315px;">Merck</td>
			<td>VVLP04700</td>
			<td>Used for the preparation of buffers for AF4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">EBM-2</td>
			<td style="width:315px;">Lonza Verviers, S.p.r.</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td>Endothelial Cell Growth basal medium, used for the serum free culture of HUVEC cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Eclipse dualtec</td>
			<td style="width:315px;">Wyatt Technology Europe</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">EGM-2</td>
			<td style="width:315px;">Lonza Verviers, S.p.r.</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>Endothelial Cell Growth medium, used for the normal culture of HUVEC cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ELISA Plate Sealers</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>DY992</td>
			<td>used for sealing of 96-well plates for the glucuronidase assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Ethanol</td>
			<td style="width:315px;">Fisher scientific</td>
			<td>E/0665DF/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Extruder Set With Holder/Heating Block</td>
			<td style="width:315px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Filter support</td>
			<td style="width:315px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610014-1EA</td>
			<td>used for liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Fluorescein di-&#946;-D-glucoronide</td>
			<td style="width:315px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F2915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Gibco PBS-tablets+CA10:F36</td>
			<td style="width:315px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Hettich Universal 320 R</td>
			<td>Andreas Hettich GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used for pelleting cells at 300 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Hettich Rotina 420 R</td>
			<td style="width:315px;">Andreas Hettich GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used for pelleting larger debris at 3000 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">HUVEC cells</td>
			<td style="width:315px;">Lonza Verviers, S.p.r.</td>
			<td style="width:119px;">C2517A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Kimble&#160; FlexColumn 1X30CM</td>
			<td style="width:315px;">Kimble</td>
			<td>420401-1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Lyophilizer ALPHA 2-4 LSC</td>
			<td style="width:315px;">Christ</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge Tubes, Polypropylene</td>
			<td>VWR international</td>
			<td style="width:119px;">525-0255</td>
			<td>the tubes used for all EV-handling, found to be more favorable than comparable products from other suppliers regarding particle recovery</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Nanosight LM14 equipped with a green laser</td>
			<td style="width:315px;">Malvern Pananalytical</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Nanosight-software version 3.1</td>
			<td style="width:315px;">Malvern Pananalytical</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">Nucleopore 200 nm track-etch polycarbonate membranes</td>
			<td>Whatman/GE Healthcare</td>
			<td align="right">110406</td>
			<td>used for liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">PEEK Inline filter holder</td>
			<td style="width:315px;">Wyatt Technology Europe</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphotungstic acid hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>79690-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Polycarbonate bottles for ultracentrifugation</td>
			<td style="width:315px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">355622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QuantiPro BCA Assay Kit</td>
			<td style="width:315px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>QPBCA-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Saponin</td>
			<td style="width:315px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Scanning electron microscopy Zeiss EVO HD 15</td>
			<td style="width:315px;">Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Sepharose Cl-2b</td>
			<td style="width:315px;">GE Healthcare</td>
			<td>17014001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">SEM copper grids with carbon film</td>
			<td style="width:315px;">Plano</td>
			<td>S160-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Small AF4 channel</td>
			<td style="width:315px;">Wyatt Technology Europe</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Sputter-coater Q150R ES</td>
			<td style="width:315px;">Quorum Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">Transmission electron microscopy JEOL JEM 2011</td>
			<td style="width:315px;">Oxford Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Type 45 Ti ultracentrifugation rotor</td>
			<td style="width:315px;">Beckman Coulter</td>
			<td>339160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Ultimate 3000 Dionex autosampler</td>
			<td style="width:315px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Ultimate 3000 Dionex isocratic pump</td>
			<td style="width:315px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Ultimate 3000 Dionex online vacuum degasser</td>
			<td style="width:315px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Ultracentrifuge OptimaTM L-90 K</td>
			<td style="width:315px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">UV detector</td>
			<td style="width:315px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Whatman 0.2 &#181;m pore size mixed cellulose filter</td>
			<td>Whatman/GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">10401712</td>
			<td>Used for the filtration of all buffers used with the EVs and in SEC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of the storage stability of extracellular vesicles

Le vescicole extracellulari (EV) sono obiettivi promettenti nella ricerca corrente, da utilizzare come farmaci, portatori di droghe e biomarcatori. Per il loro sviluppo clinico, non solo la loro attività farmaceutica è importante, ma anche la loro produzione deve essere valutata. In questo contesto, la ricerca si concentra sull'isolamento degli EV, sulla loro caratterizzazione e sulla loro conservazione. Il presente manoscritto mira a fornire una facile procedura per la valutazione dell'effetto delle diverse condizioni di conservazione sugli EV, senza manipolazione genetica o saggi funzionali specifici. In questo modo è possibile ottenere rapidamente una prima impressione della stabilità dei veicoli elettrici in una determinata condizione di conservazione e i veicoli elettrici derivati da diverse fonti cellulari possono essere confrontati facilmente. La misurazione della stabilità si basa sui parametri fisico-chimici degli EV (dimensioni, concentrazione delle particelle e morfologia) e sulla conservazione dell'attività del loro carico. Quest'ultimo è valutato dall'incapsulamento mediato da saponina dell'enzima beta-glucuronidasi nel svi. La glucuronidasi agisce come surrogato e consente una facile quantificazione attraverso la scissione di una molecola reporter fluorescente. Il presente protocollo potrebbe essere uno strumento per i ricercatori nella ricerca di condizioni di conservazione che conservino in modo ottimale le proprietà EV per far avanzare la ricerca EV verso l'applicazione clinica.

Nella Figura 1 sono visualizzate le caratteristiche di memorizzazione degli EVS isolate da HUVECs. Gli EV sono stati isolati da UC, la glucuronidasi è stata incapsulata e, dopo la SEC, le EVs purificate sono state valutate per le loro proprietà fisico-chimiche da parte della NTA. Un campione delle vescicole è stato successivamente sottoposto a purificazione AF4 e l'attività glucuronidasi è stata misurata.
Le vescicole sono state poi conservate per 7 d a 4 ° c o-80 ° c e...

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Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Valutazione della stabilità di conservazione delle vescicole extracellulari

Qui presentiamo un protocollo prontamente applicabile per valutare la stabilità di stoccaggio delle vescicole extracellulari, un gruppo di nanoparticelle naturali prodotte dalle cellule. Le vescicole sono caricate con glucuronidasi come un enzima modello e immagazzinate in condizioni diverse. Dopo la conservazione, vengono valutati i loro parametri fisico-chimici e l'attività dell'enzima incapsulato.

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

La stabilità di conservazione delle vescicole cellulari extra è un parametro importante per il loro potenziale uso terapeutico. Il nostro protocollo fornisce uno strumento facilmente applicabile per valutare in che modo l'archiviazione ha effetti sulle vescicole. Il principale vantaggio della nostra tecnica è che introducendo la glucuronidasi come marcatore esogeno, le vescicole extracellulari derivate da diverse cellule madri possono essere facilmente confrontate per quanto riguarda la loro memorizzabilità.Il frazionamento asimmetrico del flusso del campo di flusso, o AF4, è una lieve alternativa alla purificazione cromatografica di esclusione delle dimensioni per composti molto sensibili. Perché i composti incontrano meno stress nel canale. Poiché la glucuronidasi è un enzima sensibile, la qualità delle residenze beneficia di una pianificazione approfondita e dell'esecuzione delle fasi di purificazione e analisi back-to-back.Dopo aver coltivato la linea cellulare di interesse secondo le condizioni standard per quelle cellule, sostituire il supernatante con mezzo impoverito di vescicola cellulare senza siero o extra e riportare le cellule nell'incubatrice di coltura cellulare per ulteriori 24-72 ore. Al termine dell'incubazione, raccogliere il super parto da ogni pallone e centrifugare i campioni per sedimentare le cellule. Raccogliere con cura il mezzo condizionato della cella senza disturbare il pellet.E centrifuga di nuovo il mezzo per rimuovere detriti cellulari e grandi aggregati. Quindi trasferire con cura i supernaganti in tubi ultracentrifugo. Se si utilizza un rotore ad angolo fisso, contrassegnare l'orientamento dei tubi nella centrifuga per facilitare il recupero del pellet di vescicola extracellulare dopo la centrifugazione.Al termine dell'ultracentrifugazione, utilizzare una pipetta sierologica per scartare con cura il supernatante senza disturbare il pellet di vescicola extracellulare. A 200 microlitri di 0,2 micrometri pori filtrato PBS al supernatante residuo del primo tubo ultracentrifugo. Dopo aver sospeso il pellet, trasferire la sospensione vescicolare extracellulare risultante al tubo successivo per la sospensione del pellet successivo fino a quando tutti i pellet di vescicola extracellulare non sono stati rimorsiditi.Aggiungere la beta glucuronidasi alla soluzione finale di pellet rimescolato a una concentrazione finale di 1,5 milligrammi per millilitro. E saponina ad una concentrazione finale di 0,1 milligrammi per millilitro. Quindi mescolare bene vortice per tre secondi e posizionare la reazione a temperatura ambiente per 10 minuti con flicking delicato intermittente.Una volta che la glucuronidasi è stata incapsulata, assicurarsi di eseguire tutte le successive fasi di valutazione della vescicola di purificazione lo stesso giorno per ottenere risultati imparziali di stabilità dello stoccaggio. Avere una colonna cromatografica di esclusione delle dimensioni equilibrata con almeno due volumi di colonna di PBS pronti a purificare il pellet immediatamente dopo l'incubazione di saponina. Per purificare, aggiungere fino a 400 microlitri di sospensione vescicolare extracellulare alla colonna.Quindi raccogliere una frazione millilitro dell'eluato. Per conformare la separazione delle vescicole extracellulari dalle proteine contaminanti e dalla glucuronidasi libera, misurare la concentrazione proteica mediante saggio di acido bicinchoninico secondo le istruzioni dei produttori. Utilizzando parametri ottimizzati per il rispettivo tipo di strumento e vescicola, utilizzare uno strumento di analisi di tracciamento delle nano particelle per misurare la dimensione e la concentrazione della vescicola extracellulare.Per misurare l'attività della glucuronidasi, aggiungere 25 microlitri di fluorescina di-beta-D-glucuronide appena preparata a 125 microlitri delle vescicole extracellulari purificate e aggiungere il campione a un pozzo di una piastra nera da 96 pozzetti. Misurare la produzione di fluorescina a zero volte su un lettore di lastre con un'eccitazione di 480 nanometri e un'emissione di 516 nanometri. Coprire saldamente la piastra con un foglio di plastica trasparente per ridurre l'evaporazione.Quindi incubare la piastra protetta dalla luce per 18 ore a 37 gradi Celsius. Misurare la produzione di fluorescina di 18 ore sul lettore di lastre come appena dimostrato. Per la litofilizzazione vescicolare extracellulare, aggiungere quattro milligrammi per millilitro di trealosio alle vescicole purificate.E congelare le vescicole a meno 80 gradi Celsius per almeno un'ora. Per lyophilizzare i campioni, impostare la temperatura di conservazione di un lyophilizer a 15 gradi Celsius e la pressione a 0,180 millibar. Asciugare le vescicole in queste condizioni per 46 ore.Alla fine della fase di asciugatura principale, impostare la temperatura dello scaffale a 25 gradi Celsius e la pressione a 0035 millibar e asciugare i campioni per due ore in queste condizioni. Quindi conservare i campioni liofilizzati a quattro gradi Celsius. Per reidratare i campioni dopo la conservazione, aggiungere un volume d'acqua pari al volume della sospensione vescicolare extracellulare prima della lyophilization.Per valutare l'attività enzimatica dopo lo stoccaggio, caricare uno strumento AF4 con PBS filtrato da 0,1 micrometri appena preparato per la fase mobile e inserire una membrana filtrante da 0,1 micrometri nel filtro di ingresso di picco dopo la pompa per ridurre il rumore delle particelle dal solvente. Dopo lo smontaggio, pulire il piccolo canale per AF4 con acqua millEq. Idratare una nuova membrana di cellulosa rigenerata con un peso molecolare tagliato da 30 kilodalton e posizionare la membrana sopra il fret con il lato lucido verso l'alto.Posizionare un ampio distanziale di 350 micrometri sotto la metà superiore del canale e assemblare le parti del canale. Utilizzando un cacciavite di coppia, stringere le viti prima a una coppia di cinque newtonmetri, quindi a una coppia di sette newtonmetri. Stringendo le viti intorno al blocco in un motivo incrociato.Collegare i canali di ingresso, uscita e porta di flusso incrociato all'eclissi. Quindi da almeno tre vecchi campioni per equilibrare la membrana. Programma un'esecuzione di frazionamento con il flusso del rivelatore e il flusso di messa a fuoco impostati su un millilitro al minuto e un flusso di iniezione di 0,2 millilitri al minuto.Dopo un minuto di pre-messa a fuoco, iniettare il campione per un periodo di 10 minuti nella messa a fuoco e iniettare il passaggio, prima di diminuire il flusso trasversale da due millilitri al minuto a 0,1 millilitri al minuto nel corso di otto minuti. Terminare la corsa di frazionamento con una fase di eluizione senza flusso incrociato per 10 minuti e aggiungere una fase di lavaggio di eluizione e iniezione, seguita da un'eluizione. Quindi equilibrare il canale per la corsa successiva con un flusso trasversale iniziale di due millilitri al minuto e impostare il rilevatore UV su 280 nanometri.Una volta impostati tutti i programmi, iniettare 300 microlitri del campione e registrare i segnali UV e di dispersione della luce nel software ASTRA. Dopo 12 minuti e mezzo, iniziare a raccogliere una frazione millilitro fino a 27 minuti dopo l'iniezione. Quindi eseguire un saggio di glucuronidasi e un'analisi di tracciamento delle nano particelle come dimostrato.Qui, il recupero delle particelle e la dimensione delle vescicole extracellulari isolate dalle cellule endoteliali vascolari umane dopo sette giorni di conservazione in condizioni diverse sono mostrate rispetto a un campione fresco. Le vescicole sono state successivamente sottoposte a purificazione AF4 ed è stata misurata l'attività della glucuronidasi per particella. Sia la cromatografia ad esclusione di dimensioni che l'AF4 sono riusciti a separare la vescicola extracellulare dalla glucuronidasi libera.A causa del più alto grado di separazione per AF4 tra particelle ed enzima libero, la contaminazione delle frazioni contenenti vescicole è meno probabile. La purificazione AF4 dopo lo stoccaggio rimuove l'enzima libero dai campioni e quindi riduce la quantità di attività enzimatica recuperata per particella. Questo effetto è più evidente dopo la conservazione a quattro gradi Celsius, per i quali si osserva una riduzione di 2/3.Omettere questo ulteriore passaggio di purificazione può portare a un presupposto errato sulla stabilità enzimatica. La microscopia elettronica a trasmissione non rivela grandi differenze di forma per le vescicole extracellulari lyophilized senza crioprotettivo. L'imaging a scansione di microscopia elettronica, tuttavia, rivela la presenza di aggregati all'interno dei campioni lyophilizzati che non si trovano nei campioni meno 80 gradi immagazzinati.È fondamentale che l'enzima libero venga rimosso dalle vescicole prima del saggio sulla glucuronidasi. Pertanto, la tecnica utilizzata per la purificazione della vescicola deve essere accuratamente valutata. Le particelle purificate potrebbero anche essere esaminate in termini di carica superficiale per scoprire se lo stoccaggio ha cambiato la composizione naturale delle proteine di membrana o degli zuccheri.Con la nostra tecnica, è possibile ottenere una prima indicazione sulla stabilità di conservazione della vescicola extracellulare, anche quando non ci sono marcatori o saggi specifici noti per l'attività disponibile.

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