Name: evaluation of the storage stability of extracellular vesicles
Uploaded: 2019-05-22T14:30:00
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ドイツ連邦教育研究省からの NanoMatFutur ジュニア研究プログラム (グラント番号 13XP5029A) は、この作業をサポートしました。マクシミリアン・リヒターは、Studienstiftung ・デ・ Deutschen Volkes (ドイツのアカデミック奨学財団) によって、博士課程のフェローシップを通じてサポートされました。

1. 細胞培養と細胞馴化培地の製造
<ol><li>一般に、それぞれの細胞株に必要な個々の条件下で細胞を培養する。</li>
	<li>無血清条件下または EV 枯渇胎児ウシ血清 (FBS) を含む培地中で24-72 の細胞を培養する。 注: EV 枯渇 FBS を使用する場合、血清を効率よく枯渇させることが証明された方法を採用し、ウシ血清由来 EVs26による汚染を防止する。</li>
	<li>フラスコから培地を回...

<ol>
	<li>Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+and+diagnostic+applications+of+extracellular+vesicles.">Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles.</a> Journal of Controlled Release. 244, 167-183 (2016).</li><li>Fuhrmann, G., Herrmann, I. K., Stevens, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-derived+vesicles+for+drug+therapy+and+diagnostics:+Opportunities+and+challenges.">Cell-derived vesicles for drug therapy and diagnostics: Opportunities and challenges.</a> Nano Today. 10 (3), 397-409 (2015).</li><li>Goes, A., Fuhrmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenic+and+Biomimetic+Carriers+as+Versatile+Transporters+To+Treat+Infections.">Biogenic and Biomimetic Carriers as Versatile Transporters To Treat Infections.</a> ACS Infectious Diseases. 4 (6), 881-892 (2018).</li><li>Gy&#246;rgy, B., Hung, M. E., Breakefield, X. O., Leonard, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+Applications+of+Extracellular+Vesicles:+Clinical+Promise+and+Open+Questions.">Therapeutic Applications of Extracellular Vesicles: Clinical Promise and Open Questions.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 439-464 (2015).</li><li>Schulz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatible+bacteria-derived+vesicles+show+inherent+antimicrobial+activity.">Biocompatible bacteria-derived vesicles show inherent antimicrobial activity.</a> Journal of Controlled Release. 290, 46-55 (2018).</li><li>Feng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+class+of+extracellular+vesicles+from+breast+cancer+cells+activates+VEGF+receptors+and+tumour+angiogenesis.">A class of extracellular vesicles from breast cancer cells activates VEGF receptors and tumour angiogenesis.</a> Nature Communications. 8, 14450 (2017).</li><li>Bewicke-Copley, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+released+following+heat+stress+induce+bystander+effect+in+unstressed+populations.">Extracellular vesicles released following heat stress induce bystander effect in unstressed populations.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1340746 (2017).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+transfer+antigens+to+dendritic+cells+by+releasing+exosomes+containing+dead-cell-associated+antigens+partially+through+a+ceramide-dependent+pathway+to+enhance+CD4(+)+T-cell+responses.">Macrophages transfer antigens to dendritic cells by releasing exosomes containing dead-cell-associated antigens partially through a ceramide-dependent pathway to enhance CD4(+) T-cell responses.</a> Immunology. 149 (2), 157-171 (2016).</li><li>Buzas, E. I., Gy&#246;rgy, B., Nagy, G., Falus, A., Gay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+extracellular+vesicles+in+inflammatory+diseases.">Emerging role of extracellular vesicles in inflammatory diseases.</a> Nature Reviews Rheumatology. 10, 356 (2014).</li><li>Rajappa, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+Astrocytic+Tumor+Progression+Potentiated+by+JAK-mediated+Recruitment+of+Myeloid+Cells.">Malignant Astrocytic Tumor Progression Potentiated by JAK-mediated Recruitment of Myeloid Cells.</a> Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 23 (12), 3109-3119 (2017).</li><li>Umezu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal+miR-135b+shed+from+hypoxic+multiple+myeloma+cells+enhances+angiogenesis+by+targeting+factor-inhibiting+HIF-1.">Exosomal miR-135b shed from hypoxic multiple myeloma cells enhances angiogenesis by targeting factor-inhibiting HIF-1.</a> Blood. 124 (25), 3748-3757 (2014).</li><li>Costa-Silva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer+exosomes+initiate+pre-metastatic+niche+formation+in+the+liver.">Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver.</a> Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).</li><li>Boulanger, C. M., Loyer, X., Rautou, P. -. E., Amabile, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+coronary+artery+disease.">Extracellular vesicles in coronary artery disease.</a> Nature Reviews Cardiology. 14, 259 (2017).</li><li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+toxicity+and+immunogenicity+studies+reveal+minimal+effects+in+mice+following+sustained+dosing+of+extracellular+vesicles+derived+from+HEK293T+cells.">Comprehensive toxicity and immunogenicity studies reveal minimal effects in mice following sustained dosing of extracellular vesicles derived from HEK293T cells.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324730 (2017).</li><li>Vader, P., Mol, E. A., Pasterkamp, G., Schiffelers, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+for+drug+delivery.">Extracellular vesicles for drug delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 106, 148-156 (2016).</li><li>Ingato, D., Lee, J. U., Sim, S. J., Kwon, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Good+things+come+in+small+packages:+Overcoming+challenges+to+harness+extracellular+vesicles+for+therapeutic+delivery.">Good things come in small packages: Overcoming challenges to harness extracellular vesicles for therapeutic delivery.</a> Journal of Controlled Release. 241, 174-185 (2016).</li><li>Gimona, M., Pachler, K., Laner-Plamberger, S., Schallmoser, K., Rohde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manufacturing+of+Human+Extracellular+Vesicle-Based+Therapeutics+for+Clinical+Use.">Manufacturing of Human Extracellular Vesicle-Based Therapeutics for Clinical Use.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1190 (2017).</li><li>Jeyaram, A., Jay, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+and+Storage+Stability+of+Extracellular+Vesicles+for+Therapeutic+Applications.">Preservation and Storage Stability of Extracellular Vesicles for Therapeutic Applications.</a> The AAPS Journal. 20 (1), 1 (2017).</li><li>L&#337;rincz, &. #. 1. 9. 3. ;. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+storage+on+physical+and+functional+properties+of+extracellular+vesicles+derived+from+neutrophilic+granulocytes.">Effect of storage on physical and functional properties of extracellular vesicles derived from neutrophilic granulocytes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 25465 (2014).</li><li>Kreke, M., Smith, R., Hanscome, P., Peck, K., Ibrahim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processes+for+producing+stable+exosome+formulations.">Processes for producing stable exosome formulations.</a> US patent. , (2016).</li><li>Frank, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+protect+glucuronidase+model+enzymes+during+freeze-drying.">Extracellular vesicles protect glucuronidase model enzymes during freeze-drying.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12377 (2018).</li><li>Charoenviriyakul, C., Takahashi, Y., Nishikawa, M., Takakura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+exosomes+at+room+temperature+using+lyophilization.">Preservation of exosomes at room temperature using lyophilization.</a> International Journal of Pharmaceutics. 553 (1), 1-7 (2018).</li><li>Kusuma, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+Protect+and+to+Preserve:+Novel+Preservation+Strategies+for+Extracellular+Vesicles.">To Protect and to Preserve: Novel Preservation Strategies for Extracellular Vesicles.</a> Frontiers in Pharmacology. 9 (1199), (2018).</li><li>Haney, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+as+drug+delivery+vehicles+for+Parkinson's+disease+therapy.">Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy.</a> Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).</li><li>Fuhrmann, G., Serio, A., Mazo, M., Nair, R., Stevens, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+loading+into+extracellular+vesicles+significantly+improves+the+cellular+uptake+and+photodynamic+effect+of+porphyrins.">Active loading into extracellular vesicles significantly improves the cellular uptake and photodynamic effect of porphyrins.</a> Journal of Controlled Release. 205, 35-44 (2015).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W. G., Sargent, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+sizing+and+enumeration+by+nanoparticle+tracking+analysis.">Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 19671 (2013).</li><li>Vestad, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+concentration+analyses+of+extracellular+vesicles+by+nanoparticle+tracking+analysis:+a+variation+study.">Size and concentration analyses of extracellular vesicles by nanoparticle tracking analysis: a variation study.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1344087 (2017).</li><li>Bosch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose+prevents+aggregation+of+exosomes+and+cryodamage.">Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage.</a> Scientific Reports. 6, 36162 (2016).</li><li>Bhattacharjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DLS+and+zeta+potential+-+What+they+are+and+what+they+are+not.">DLS and zeta potential - What they are and what they are not.</a> Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).</li><li>Van Deun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+disparate+isolation+methods+for+extracellular+vesicles+on+downstream+RNA+profiling.">The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24858 (2014).</li><li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes.">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li><li>Patel, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+cell+culture+parameters+on+production+and+vascularization+bioactivity+of+mesenchymal+stem+cell-derived+extracellular+vesicles.">Impact of cell culture parameters on production and vascularization bioactivity of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles.</a> Bioengineering &amp; Translational Medicine. 2 (2), 170-179 (2017).</li><li>Gardiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+used+for+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles:+results+of+a+worldwide+survey.">Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945 (2016).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+distinct+nanoparticles+and+subsets+of+extracellular+vesicles+by+asymmetric+flow+field-flow+fractionation.">Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation.</a> Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).</li><li>Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+centrifugation+induces+aggregation+of+extracellular+vesicles.">High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 29509 (2015).</li><li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma.">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).</li></ol>

本稿では、異なる貯蔵条件下での Ev の安定性を研究するための包括的なプロトコルを紹介する。機能読み出しと EVs の物理化学的なパラメータの評価としてカプセル化されたグルクロニダーゼの組み合わせにより、プロトコルは、EVs の簡単な保存安定性評価と異なるセルからの EVs の比較を可能にします行。SEM および TEM は相補的な方法として、単粒子レベルでの EVs の変化についての洞察?...

EVs は、ほぼすべてのセルタイプによって生成される膜結合ナノ粒子です。哺乳類細胞の場合、EVs は、異なる生産経路1、2を持つ2つの主要なグループに細分化することができます。膜小胞は、およそ100〜 1000 nm の大きさの範囲で、細胞膜からの直接出芽によって産生される。エキソソームは、サイズが 30-200 nm で、その後、細胞膜と融合して一度に複数のエキソソームを放出するエンドソームに、内側の出芽によって形成された多体に由来する。これらの小胞の主な機能は、細胞3間の情報の輸送である。この目的のために、RNA、DNA、タンパク質などの貨物が積極的に選別されます。EVs は、健康と病気の状態の両方の影響で、ターゲットにさまざまな効果を伝えることができます。一方では、組織再生、抗原提示、または抗生物質効果などのポジティブな効果を媒介し、治療薬としての開発の目標となります4,5.反対側では、EVs は、腫瘍血管新生6を促進し、ストレス応答7において傍観効果を誘発し、そして自己免疫疾患8および炎症性疾患9において役割を果たす可能性がある。したがって、彼らは多くの病理学的効果をよりよく理解するための重要なコンポーネントであるかもしれません。しかし、癌10、11、12および心血管障害13などのマニホールド疾患における変化した ev の存在、および血液および尿におけるそれらの容易なアクセス性は、それらを理想的にするバイオ マーカー。最後に、それらの良好な生体適合性14およびその固有のターゲティング能力は、薬物送達15についての EVs も興味深いものにする。本稿では、哺乳動物細胞由来の Ev の保存性を評価するためのプロトコールについて説明するが、未だ検討されていない重要な特性である。
Ev の臨床開発のために、彼らの治療効果、生産、精製、およびストレージ17の評価を含む16を乗り越えるために、まだ多くの障害があります。80° c は EV ストレージ18の金本位として広く見られているが、必要な冷凍庫は高価であり、生産から患者への要求されるコールドチェーンを維持することは困難である可能性がある。さらに、一部の報告では、-80 ° c のストレージはまだ最適に EVs を保持していないし、ev 機能19、20の損失を誘導することを示しています。凍結乾燥21、22 、または噴霧乾燥23などの他の方法が、ev の冷凍保存に潜在的な代替物として提案されている。
貯蔵安定性を評価する最適な方法は、機能アッセイまたは特定のマーカーの評価 (例えば、それらの抗菌活性19) で EVs をテストすることであろう。これは、小胞の所望の効果が知られており、EVs の1つの異なるグループが検討されるときに可能です。異なる細胞源からの EVs を比較する場合 (例えば、薬物封入のため)、または既知の機能的読み出しがない場合、ストレージによる変化を直接的に評価することはもはや不可能である。
一方、最近の特許20で示されているように、単にサイズ、粒子回収、タンパク質濃度などの物理化学的パラメータの変化を評価するだけでは、EV 活性の変化を予測するとは限らない。
ここでは、EVs の貨物のためのサロゲートとしてカプセル化されたβ-グルクロニダーゼ酵素の活性と組み合わせるそれらの物理化学的パラメータを評価することにより、EVs の保存安定性を測定するための容易に適用可能なプロトコルを提供します。酵素の装填はサポニンインキュベーションによって行われ、異なる供給源21、24、25から EVs を用いて確立される穏やかな方法である。サポニンは、EV 膜中の一過性の細孔を形成し、小胞への酵素取り込みを可能にする。不利な保管条件にさらされた場合、酵素はその活性を失う傾向があるので、それらは EVs の機能的な貨物の保存の評価のための理想的サロゲートです。
我々は、ヒト間葉幹細胞 (MSCs)、ヒト臍帯静脈内皮細胞 (HUVECs)、およびヒト腺癌肺胞上皮細胞 (A549) 由来の EVs へのこのプロトコルの適用が実際に大きな差異をもたらすことを実証した。異なる細胞株間の貯蔵安定性は、EV ソース21を選択する際に考慮されるべきである。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:933px;" width="933">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">1,2 dimyristoyl-sn glycero-3-phospho-choline (DMPC)</td>
			<td style="width:315px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P2663-25MG</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-choline (DPPC)</td>
			<td style="width:315px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4329-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">225 cm&#178; cell culture flasks</td>
			<td style="width:315px;">Corning</td>
			<td>431082</td>
			<td>Used with 25 ml of medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">30 kDa regenerated cellulose membrane</td>
			<td style="width:315px;">Wyatt Technology Europe</td>
			<td>1854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">350 &#181;m spacer</td>
			<td style="width:315px;">Wyatt Technology Europe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Automated fraction collector</td>
			<td style="width:315px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Beta-glucuronidase</td>
			<td style="width:315px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7646-100KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Chloroform</td>
			<td style="width:315px;">Fisher scientific</td>
			<td>C/4966/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Column oven</td>
			<td style="width:315px;">Hitachi High-Technologies Europe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">D-(+)-Trehalose dihydrate</td>
			<td style="width:315px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9531-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">DAWN HELEOS II, Multi-angle light scattering detector</td>
			<td style="width:315px;">&#160;Wyatt Technology Europe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Durapore Membrane filter, PVDF,&#160; 0,1&#160;&#181;m, 47&#160;mm</td>
			<td style="width:315px;">Merck</td>
			<td>VVLP04700</td>
			<td>Used for the preparation of buffers for AF4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">EBM-2</td>
			<td style="width:315px;">Lonza Verviers, S.p.r.</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td>Endothelial Cell Growth basal medium, used for the serum free culture of HUVEC cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Eclipse dualtec</td>
			<td style="width:315px;">Wyatt Technology Europe</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">EGM-2</td>
			<td style="width:315px;">Lonza Verviers, S.p.r.</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>Endothelial Cell Growth medium, used for the normal culture of HUVEC cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ELISA Plate Sealers</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>DY992</td>
			<td>used for sealing of 96-well plates for the glucuronidase assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Ethanol</td>
			<td style="width:315px;">Fisher scientific</td>
			<td>E/0665DF/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Extruder Set With Holder/Heating Block</td>
			<td style="width:315px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Filter support</td>
			<td style="width:315px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610014-1EA</td>
			<td>used for liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Fluorescein di-&#946;-D-glucoronide</td>
			<td style="width:315px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F2915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Gibco PBS-tablets+CA10:F36</td>
			<td style="width:315px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Hettich Universal 320 R</td>
			<td>Andreas Hettich GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used for pelleting cells at 300 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Hettich Rotina 420 R</td>
			<td style="width:315px;">Andreas Hettich GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used for pelleting larger debris at 3000 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">HUVEC cells</td>
			<td style="width:315px;">Lonza Verviers, S.p.r.</td>
			<td style="width:119px;">C2517A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Kimble&#160; FlexColumn 1X30CM</td>
			<td style="width:315px;">Kimble</td>
			<td>420401-1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Lyophilizer ALPHA 2-4 LSC</td>
			<td style="width:315px;">Christ</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge Tubes, Polypropylene</td>
			<td>VWR international</td>
			<td style="width:119px;">525-0255</td>
			<td>the tubes used for all EV-handling, found to be more favorable than comparable products from other suppliers regarding particle recovery</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Nanosight LM14 equipped with a green laser</td>
			<td style="width:315px;">Malvern Pananalytical</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Nanosight-software version 3.1</td>
			<td style="width:315px;">Malvern Pananalytical</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">Nucleopore 200 nm track-etch polycarbonate membranes</td>
			<td>Whatman/GE Healthcare</td>
			<td align="right">110406</td>
			<td>used for liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">PEEK Inline filter holder</td>
			<td style="width:315px;">Wyatt Technology Europe</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphotungstic acid hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>79690-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Polycarbonate bottles for ultracentrifugation</td>
			<td style="width:315px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">355622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QuantiPro BCA Assay Kit</td>
			<td style="width:315px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>QPBCA-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Saponin</td>
			<td style="width:315px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Scanning electron microscopy Zeiss EVO HD 15</td>
			<td style="width:315px;">Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Sepharose Cl-2b</td>
			<td style="width:315px;">GE Healthcare</td>
			<td>17014001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">SEM copper grids with carbon film</td>
			<td style="width:315px;">Plano</td>
			<td>S160-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Small AF4 channel</td>
			<td style="width:315px;">Wyatt Technology Europe</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Sputter-coater Q150R ES</td>
			<td style="width:315px;">Quorum Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">Transmission electron microscopy JEOL JEM 2011</td>
			<td style="width:315px;">Oxford Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Type 45 Ti ultracentrifugation rotor</td>
			<td style="width:315px;">Beckman Coulter</td>
			<td>339160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Ultimate 3000 Dionex autosampler</td>
			<td style="width:315px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Ultimate 3000 Dionex isocratic pump</td>
			<td style="width:315px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Ultimate 3000 Dionex online vacuum degasser</td>
			<td style="width:315px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Ultracentrifuge OptimaTM L-90 K</td>
			<td style="width:315px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">UV detector</td>
			<td style="width:315px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Whatman 0.2 &#181;m pore size mixed cellulose filter</td>
			<td>Whatman/GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">10401712</td>
			<td>Used for the filtration of all buffers used with the EVs and in SEC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of the storage stability of extracellular vesicles

現在の研究では、細胞外小胞 (Ev) が有望な標的であり、薬剤、薬剤、担体、バイオマーカーとして利用されている。臨床開発のためには、その医薬品の活動だけでなく、その生産を評価する必要があります。この文脈では、研究は、EVs の分離、その特徴付け、およびそれらのストレージに焦点を当てています。本稿では、遺伝子操作や特定の機能アッセイを行わずに、さまざまな貯蔵条件が EVs に及ぼす影響を評価するための容易な手順を提供することを目的としています。これにより、所定の貯蔵条件下での Ev の安定性の第一印象を迅速に得ることができ、異なるセル源に由来する EVs を容易に比較することができる。安定性の測定は EVs (サイズ、粒子の集中および形態) の物理化学的な変数および彼らの貨物の活動の保存に基づいている。後者は、Ev への酵素β-グルクロニダーゼのサポニン媒介封入によって評価される。グルクロニダーゼはサロゲートとして機能し、蛍光レポーター分子の切断によって容易に定量化することができます。本プロトコルは、臨床応用に向けた EV 研究を進めるために EV 特性を最適に保持する保存条件を探索する研究者のためのツールとなりうる。

図 1は、HUVECs から分離された EVs のストレージ特性を示しています。EVs は、UC によって単離され、グルクロニダーゼは封入され、SEC の後、精製された EVs は NTA による物理化学的特性の評価を受けました。小胞のサンプルをその後 AF4 精製に供し、グルクロニダーゼ活性を測定した。
次いで、小胞体を4° c または-80 ° c で 7 d、凍結乾燥形態で4° c で保存し、?...

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Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

細胞外小胞の保存性の評価

ここでは、細胞によって産生される天然ナノ粒子の群である細胞外小胞の貯蔵安定性を評価するために容易に適用可能なプロトコルを提示する。小胞は、モデル酵素としてグルクロニダーゼを搭載し、異なる条件下で保存されます。保存後、それらの物理化学的パラメータおよび封入酵素の活性が評価される。

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

細胞外小胞の貯蔵安定性は、その前向きの治療的使用のための重要なパラメータである。当社のプロトコルは、ストレージが小胞に与える影響を評価するための容易に適用可能なツールを提供します。我々の技術の主な利点は、外因性マーカーとしてグルクロニダーゼを導入することにより、異なる親細胞に由来する細胞外小胞がそれらの安定性に関して容易に比較されることである。非対称流量流分画(AF4)は、非常に感受性の高い化合物に対するサイズ排除クロマトグラフィー精製に対する軽度の代替物である。化合物は、チャネルで少ない純粋なストレスに遭遇するため.グルクロニダーゼは敏感な酵素であるため、居住する品質は、徹底的な計画を立て、精製と分析のステップを繰り返し実行することから利益を得ます。これらの細胞の標準的な条件に従って目的の細胞株を培養した後、上清を無血清または余分な細胞小胞枯渇培地に置き換え、細胞を細胞培養インキュベーターにさらに24〜72時間戻します。インキュベーションの終わりに、各フラスコからスーパーナタンを回収し、サンプルを遠心分離して細胞を沈降させる。ペレットを邪魔することなく、細胞調整培地を慎重に収集します。そして、再び遠心分離機を使用して、細胞の破片および大きな凝集物を除去する。その後、慎重に超遠心チューブに上清を転送します。固定角度ローターを使用する場合は、遠心分離機のチューブの向きをマークして、遠心分離後の細胞外小胞ペレットの検索を容易にします。超遠心分離の終わりに、細胞外小胞ペレットを乱すことなく慎重に上清を廃棄するために血清ピペットを使用してください。0.2マイクロメートルの200マイクロリットルで、第1の超遠心管の残留上清にPBSを濾過した。ペレットを再懸濁した後、得られた細胞外小胞懸濁液を次のチューブに移し、その後のペレットの再懸濁液を、全ての細胞外小胞ペレットが再懸濁されるまで行う。最終再懸濁ペレット溶液にβグルクロニダーゼを加え、1ミリリットル当たり1.5ミリグラムの最終濃度にします。そしてサポニンは1ミリリットル当たり0.1ミリグラムの最終濃度に。その後、3秒間ボルテックスでよく混ぜ、断続的に穏やかなフリックで10分間室温で反応を置きます。グルクロニダーゼが封入されたら、その後の精製ベシクル評価ステップをすべて同じ日に実行し、不偏な貯蔵安定性の結果を得るようにしてください。サイズ排除クロマトグラフィーカラムを、サポニンインキュベーションの直後にペレットを精製する準備ができてPBSの少なくとも2つのカラム容量と平衡化した。精製するには、最大400マイクロリットルの細胞外小胞懸濁液をカラムに加えます。その後、溶出物の1ミリリットル分を収集します。汚染タンパク質と遊離グルクロニダーゼからの細胞外小胞の分離を適合させるために、製造業者の指示に従ってビチンチオン酸アッセイによってタンパク質濃度を測定する。それぞれの装置と小胞の種類に最適化されたパラメータを使用して、ナノ粒子追跡分析装置を使用して細胞外小胞のサイズと濃度を測定します。グルクロニダーゼ活性を測定するには、精製された細胞外小胞の125マイクロリットルに作りたての蛍光を25マイクロリットルの蛍光体から25マイクロリットル加え、黒い96ウェルプレートの1つのウェルにサンプルを加えます。480ナノメートルの励起および516ナノメートルの放射で版の読者の時間ゼロの蛍光の生産を測定する。蒸発を減らすために透明なプラスチック箔でプレートをしっかりと覆います。その後、光から保護されたプレートを摂氏37度で18時間インキュベートします。実演したように、プレートリーダー上の18時間の蛍光量を測定します。細胞外小胞凍結乾燥のために、精製された小胞にトレハロース1ミリリットル当たり4ミリグラムを加える。そして、少なくとも1時間マイナス80度で小胞を凍結します。サンプルを凍結乾燥するには、凍結乾燥機の貯蔵温度を摂氏15度に、圧力を0.180ミリバールに設定します。これらの条件下で小胞を46時間乾燥させます。主乾燥工程の終わりに、棚温度を摂氏25度、圧力を0035ミリバールに設定し、これらの条件下でサンプルを2時間乾燥させます。その後、凍結乾燥したサンプルを摂氏4度で保存します。保存後にサンプルを水分補給するには、凍結乾燥前の細胞外小胞懸濁液の体積に等しい水量を加える。貯蔵後の酵素活性を評価するには、AF4機器に、可動相用に新たに調製した0.1マイクロメートルの濾過PBSをロードし、ポンプ後のピーク入口フィルターに0.1マイクロメートルのフィルター膜を挿入して、溶媒からの粒子騒音を低減します。分解した後、millEq水でAF4の小さなチャネルをきれいにしてください。30キロダルトンの分子量を遮断して新しい再生セルロース膜を水和し、光沢のある側面を上にしてフレットの上に膜を置きます。チャネルの上半分の下に広い350マイクロメートルスペーサーを配置し、チャネル部品を組み立てます。トルクドライバーを使用して、最初にネジを5ニュートンメートルのトルクに締め、次に7ニュートンメートルのトルクに締めます。十字架パターンでブロックの周りのネジを締めます。チャネルの入口、出口、およびクロスフローポートを日食に接続します。次に、少なくとも3つの古いサンプルから膜を平衡化する。検出器の流れとフォーカスフローを毎分1ミリリットルに設定し、1分あたり0.2ミリリットルの注入フローを使用して分画を実行するようにプログラムします。1分間の事前フォーカスステップの後、焦点で10分間にわたってサンプルを注入し、ステップを注入してから、8分間にわたって1分間に2ミリリットルから毎分0.1ミリリットルにクロスフローを減少させます。10分間クロスフローのない溶出ステップで分画実行を終了し、溶出と注入の洗浄ステップを追加し、溶出を続けます。次に、1 分間に 2 ミリリットルの初期のクロス フローで次の実行のチャネルを平衡化し、UV 検出器を 280 ナノメートルに設定します。すべてのプログラムが設定されたら、サンプルの300マイクロリットルを注入し、ASTRAソフトウェアでUVおよび光散乱信号を記録します。12分半後、注射後27分まで1ミリリットル分の採取を開始する。次に、グルクロニダーゼアッセイとナノ粒子追跡分析を実証したとおりに実行します。ここで、粒子回収と、異なる条件下での7日間の保存後にヒト血管内皮細胞から分離された細胞外小胞のサイズとが、新鮮なサンプルと比較して示されている。ベシクルは、その後AF4精製を行い、粒子当たりのグルクロニダーゼ活性を測定した。サイズ排除クロマトグラフィーとAF4はいずれも、遊離グルクロニダーゼから細胞外小胞を分離することに成功している。粒子と遊離酵素との間のAF4の分離度が高いため、小胞を含む分画の汚染は少ない。保存後のAF4精製は、サンプルから遊離酵素を除去し、粒子あたりの回収酵素活性を低下させます。この効果は摂氏4度で貯蔵した後に最も顕著であり、2/3の減少が観察される。この追加の精製ステップを省略すると、酵素安定性に関する誤った仮定につながる可能性があります。透過型電子顕微鏡は、凍結保護剤なしで凍結乾燥した細胞外小胞の形状に大きな違いは明らかにされていない。しかし、走査型電子顕微鏡イメージングは、保存されたサンプルのマイナス80度に見つからない凍結乾燥サンプル内の凝集体の存在を明らかにする。グルクロニダーゼアッセイの前に、遊離酵素を小胞から取り除くことが重要です。したがって、小胞精製に使用される技術を徹底的に評価する必要があります。精製粒子は、その表面電荷の観点から、貯蔵が膜タンパク質または糖の天然組成を変化させたかどうかを調べることもできます。我々の技術により、細胞外小胞の貯蔵安定性に関する最初の指標を得ることは可能であり、その活性に関する既知のマーカーまたはアッセイがない場合でも利用可能である。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

ティッシュエンジニアーコンストラクトの成長評価のための磁気共鳴エラストグラフィの方法論

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

ナノサイズの脂質小胞の調製のための一定の圧力制御押出法

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

セルラーミミックの構築のための小胞における無細胞転写および翻訳機構のカプセル化

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

調整可能な抵抗パルスセンシングを使用して定量化し、細胞外小胞の大きさ、プロファイリング

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

細胞内小胞の追跡への応用：変形二光子顕微鏡での3d軌道の追跡

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

細胞外小胞の単​​離および特徴のための紙ベースのデバイス

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

組織特異的細胞培養および配信プラットフォームとして、細胞外マトリックス由来のフォームおよびマイクロキャリアの作製

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

音響セパレータを用いたCHO採取細胞培養液の一次解明

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...

Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants

軟骨外植木における移動と取り込みモニタリングのための細胞外小胞の標識

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their ...

Platelet-Derived Extracellular Vesicle Functionalization of Ti Implants

Tiインプラントの血小板由来細胞外小胞機能化

Extracellular Vesicles (EVs) are biological nanovesicles that play a key role in cell communication. Their content includes active biomolecules such as ...