Name: evaluation of the storage stability of extracellular vesicles
Uploaded: 2019-05-22T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles at JoVE.com

Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı NanoMatFutur küçük araştırma programı, Almanya (Grant numarası 13XP5029A) bu işi destekliyor. Maximilian Richter, Doktora Bursu ile Studienstiftung des Deutschen Volkes (Alman Akademik Burs Vakfı) tarafından desteklenmektedir.

1. hücre kültürü ve hücre-Klima orta üretim
<ol><li>Genellikle, ilgili hücre hattı için gerekli bireysel koşullar altında hücreleri yetiştirmek.</li>
	<li>Serum-serbest koşullarda veya orta içeren EV-tükenmiş fetal sığır serumu (FBS) 24-72 h için hücreleri yetiştirmek. Not: EV-depleted FBS kullanılırsa, sığır serumu türeyen EVs26ile kontaminasyonu önlemek için serumu verimli bir şekilde arındırma konusunda kanıtlanmış bir yöntem kullanın.</li>
	<li>Flask...

<ol>
	<li>Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+and+diagnostic+applications+of+extracellular+vesicles.">Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles.</a> Journal of Controlled Release. 244, 167-183 (2016).</li><li>Fuhrmann, G., Herrmann, I. K., Stevens, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-derived+vesicles+for+drug+therapy+and+diagnostics:+Opportunities+and+challenges.">Cell-derived vesicles for drug therapy and diagnostics: Opportunities and challenges.</a> Nano Today. 10 (3), 397-409 (2015).</li><li>Goes, A., Fuhrmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenic+and+Biomimetic+Carriers+as+Versatile+Transporters+To+Treat+Infections.">Biogenic and Biomimetic Carriers as Versatile Transporters To Treat Infections.</a> ACS Infectious Diseases. 4 (6), 881-892 (2018).</li><li>Gy&#246;rgy, B., Hung, M. E., Breakefield, X. O., Leonard, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+Applications+of+Extracellular+Vesicles:+Clinical+Promise+and+Open+Questions.">Therapeutic Applications of Extracellular Vesicles: Clinical Promise and Open Questions.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 439-464 (2015).</li><li>Schulz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatible+bacteria-derived+vesicles+show+inherent+antimicrobial+activity.">Biocompatible bacteria-derived vesicles show inherent antimicrobial activity.</a> Journal of Controlled Release. 290, 46-55 (2018).</li><li>Feng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+class+of+extracellular+vesicles+from+breast+cancer+cells+activates+VEGF+receptors+and+tumour+angiogenesis.">A class of extracellular vesicles from breast cancer cells activates VEGF receptors and tumour angiogenesis.</a> Nature Communications. 8, 14450 (2017).</li><li>Bewicke-Copley, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+released+following+heat+stress+induce+bystander+effect+in+unstressed+populations.">Extracellular vesicles released following heat stress induce bystander effect in unstressed populations.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1340746 (2017).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+transfer+antigens+to+dendritic+cells+by+releasing+exosomes+containing+dead-cell-associated+antigens+partially+through+a+ceramide-dependent+pathway+to+enhance+CD4(+)+T-cell+responses.">Macrophages transfer antigens to dendritic cells by releasing exosomes containing dead-cell-associated antigens partially through a ceramide-dependent pathway to enhance CD4(+) T-cell responses.</a> Immunology. 149 (2), 157-171 (2016).</li><li>Buzas, E. I., Gy&#246;rgy, B., Nagy, G., Falus, A., Gay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+extracellular+vesicles+in+inflammatory+diseases.">Emerging role of extracellular vesicles in inflammatory diseases.</a> Nature Reviews Rheumatology. 10, 356 (2014).</li><li>Rajappa, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+Astrocytic+Tumor+Progression+Potentiated+by+JAK-mediated+Recruitment+of+Myeloid+Cells.">Malignant Astrocytic Tumor Progression Potentiated by JAK-mediated Recruitment of Myeloid Cells.</a> Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 23 (12), 3109-3119 (2017).</li><li>Umezu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal+miR-135b+shed+from+hypoxic+multiple+myeloma+cells+enhances+angiogenesis+by+targeting+factor-inhibiting+HIF-1.">Exosomal miR-135b shed from hypoxic multiple myeloma cells enhances angiogenesis by targeting factor-inhibiting HIF-1.</a> Blood. 124 (25), 3748-3757 (2014).</li><li>Costa-Silva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer+exosomes+initiate+pre-metastatic+niche+formation+in+the+liver.">Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver.</a> Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).</li><li>Boulanger, C. M., Loyer, X., Rautou, P. -. E., Amabile, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+coronary+artery+disease.">Extracellular vesicles in coronary artery disease.</a> Nature Reviews Cardiology. 14, 259 (2017).</li><li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+toxicity+and+immunogenicity+studies+reveal+minimal+effects+in+mice+following+sustained+dosing+of+extracellular+vesicles+derived+from+HEK293T+cells.">Comprehensive toxicity and immunogenicity studies reveal minimal effects in mice following sustained dosing of extracellular vesicles derived from HEK293T cells.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324730 (2017).</li><li>Vader, P., Mol, E. A., Pasterkamp, G., Schiffelers, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+for+drug+delivery.">Extracellular vesicles for drug delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 106, 148-156 (2016).</li><li>Ingato, D., Lee, J. U., Sim, S. J., Kwon, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Good+things+come+in+small+packages:+Overcoming+challenges+to+harness+extracellular+vesicles+for+therapeutic+delivery.">Good things come in small packages: Overcoming challenges to harness extracellular vesicles for therapeutic delivery.</a> Journal of Controlled Release. 241, 174-185 (2016).</li><li>Gimona, M., Pachler, K., Laner-Plamberger, S., Schallmoser, K., Rohde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manufacturing+of+Human+Extracellular+Vesicle-Based+Therapeutics+for+Clinical+Use.">Manufacturing of Human Extracellular Vesicle-Based Therapeutics for Clinical Use.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1190 (2017).</li><li>Jeyaram, A., Jay, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+and+Storage+Stability+of+Extracellular+Vesicles+for+Therapeutic+Applications.">Preservation and Storage Stability of Extracellular Vesicles for Therapeutic Applications.</a> The AAPS Journal. 20 (1), 1 (2017).</li><li>L&#337;rincz, &. #. 1. 9. 3. ;. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+storage+on+physical+and+functional+properties+of+extracellular+vesicles+derived+from+neutrophilic+granulocytes.">Effect of storage on physical and functional properties of extracellular vesicles derived from neutrophilic granulocytes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 25465 (2014).</li><li>Kreke, M., Smith, R., Hanscome, P., Peck, K., Ibrahim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processes+for+producing+stable+exosome+formulations.">Processes for producing stable exosome formulations.</a> US patent. , (2016).</li><li>Frank, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+protect+glucuronidase+model+enzymes+during+freeze-drying.">Extracellular vesicles protect glucuronidase model enzymes during freeze-drying.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12377 (2018).</li><li>Charoenviriyakul, C., Takahashi, Y., Nishikawa, M., Takakura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+exosomes+at+room+temperature+using+lyophilization.">Preservation of exosomes at room temperature using lyophilization.</a> International Journal of Pharmaceutics. 553 (1), 1-7 (2018).</li><li>Kusuma, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+Protect+and+to+Preserve:+Novel+Preservation+Strategies+for+Extracellular+Vesicles.">To Protect and to Preserve: Novel Preservation Strategies for Extracellular Vesicles.</a> Frontiers in Pharmacology. 9 (1199), (2018).</li><li>Haney, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+as+drug+delivery+vehicles+for+Parkinson's+disease+therapy.">Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy.</a> Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).</li><li>Fuhrmann, G., Serio, A., Mazo, M., Nair, R., Stevens, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+loading+into+extracellular+vesicles+significantly+improves+the+cellular+uptake+and+photodynamic+effect+of+porphyrins.">Active loading into extracellular vesicles significantly improves the cellular uptake and photodynamic effect of porphyrins.</a> Journal of Controlled Release. 205, 35-44 (2015).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W. G., Sargent, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+sizing+and+enumeration+by+nanoparticle+tracking+analysis.">Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 19671 (2013).</li><li>Vestad, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+concentration+analyses+of+extracellular+vesicles+by+nanoparticle+tracking+analysis:+a+variation+study.">Size and concentration analyses of extracellular vesicles by nanoparticle tracking analysis: a variation study.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1344087 (2017).</li><li>Bosch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose+prevents+aggregation+of+exosomes+and+cryodamage.">Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage.</a> Scientific Reports. 6, 36162 (2016).</li><li>Bhattacharjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DLS+and+zeta+potential+-+What+they+are+and+what+they+are+not.">DLS and zeta potential - What they are and what they are not.</a> Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).</li><li>Van Deun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+disparate+isolation+methods+for+extracellular+vesicles+on+downstream+RNA+profiling.">The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24858 (2014).</li><li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes.">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li><li>Patel, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+cell+culture+parameters+on+production+and+vascularization+bioactivity+of+mesenchymal+stem+cell-derived+extracellular+vesicles.">Impact of cell culture parameters on production and vascularization bioactivity of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles.</a> Bioengineering &amp; Translational Medicine. 2 (2), 170-179 (2017).</li><li>Gardiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+used+for+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles:+results+of+a+worldwide+survey.">Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945 (2016).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+distinct+nanoparticles+and+subsets+of+extracellular+vesicles+by+asymmetric+flow+field-flow+fractionation.">Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation.</a> Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).</li><li>Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+centrifugation+induces+aggregation+of+extracellular+vesicles.">High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 29509 (2015).</li><li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma.">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).</li></ol>

Bu yazıda, EVs 'in farklı depolama koşullarında istikrarını incelemek için kapsamlı bir protokol sunuyoruz. Fonksiyonel bir okuma ve EVs fizikokimyasal parametrelerin değerlendirilmesi olarak kapsüllenmiş glukuronidaz kombinasyonu ile, protokol EVs ve farklı hücreden EVs karşılaştırılması basit bir depolama stabilitesi değerlendirilmesi için izin verir Satır. SEM ve TEM, tamamlayıcı yöntemler olarak tek parçacık düzeyinde EVs değişikliklerine ilişkin bir anlayış sağlar. Burada sunulan so...

EVs membran bağlı nanopartiküller neredeyse tüm hücre türleri tarafından üretilmektedir. Memeli hücreler için, EVS farklı üretim yolları1,2ile iki ana gruba ayrılabilir. Membran veziküller, yaklaşık 100-1000 Nm boyutunda bir boyutla, hücre zarından doğrudan tomurcuklanma tarafından üretilmektedir. Exosomes, ölçekli 30-200 Nm, daha sonra aynı anda birden fazla exosomes serbest bırakmak için hücre membranı ile sigorta endosomes içine içeri tomurcuklanan tarafından oluşturulan multiveziküler organları türetilmiştir. Bu veziküllerin ana fonksiyonu hücreler arasında bilgi taşımacılığında3. Bu amaçla RNA, DNA ve proteinler gibi kargolar aktif olarak onlara sıralanmaktadır. EVs, hem sağlık hem de hastalık durumunun etkileri ile hedefleri üzerinde çeşitli efektler iletebilir. Bir tarafta, onlar tedavi olarak gelişimi için onları uğurlu hedefler kılan doku rejenerasyon, antijen sunumu veya antibiyotik etkileri gibi olumlu etkileri Arabulmak4,5. Diğer tarafta, EVs tümör vaskülarizasyonu teşvik edebilir6, stres tepkiler7seyirci etkileri, ve otoimmün hastalıklarda rol oynayabilir8 ve inflamatuar hastalıklar9. Böylece, birçok patolojik etkinin daha iyi anlaşılması için önemli bir bileşen olabilirler. Ancak, manifold hastalıklarında değiştirilmiş EVS varlığı, kanser gibi10,11,12 ve kardiyovasküler bozukluklar13, ve kan ve idrar kolay erişilebilirlik onları ideal hale getirir biyolojik. Son olarak, onların iyi biyouyumluluk14 ve onların içsel hedefleme yeteneği EVS de ilaç teslim15için ilginç hale. Bu yazıda, hala az incelenmiş önemli bir özellik olan memeliler hücrelerinden elde edilen EVs 'nin depolama kararlılığının değerlendirilmesi için bir protokol açıklanmaktadır.
EVs 'nin klinik gelişimi için, tedavi edici etkileri, üretim, arıtma ve depolama17' nin değerlendirilmesi de dahil olmak üzere16' nın üzerinde hala birçok engel vardır. Süre-80 ° c, EV depolama18için altın standart olarak yaygın olarak görülür, gerekli dondurucular pahalıdır ve üretim hasta için gerekli soğuk zincir korumak zor olabilir. Dahası, bazı raporlar, depolama-80 °c ' de hala en iyi şekilde EVS koruymaz ve ev işlevselliği19,20bir kayıp indükler gösterir. Freeze-kurutma21,22 veya sprey-kurutma23gibi diğer yöntemler, EVS dondurulmuş depolama için potansiyel alternatifler olarak önerilmiştir.
Depolama stabilitesini değerlendirmesinin en uygun yolu, EVs 'i fonksiyonel testlerle veya belirli bir işaretçinin değerlendirilmesiyle, örneğin antibakteriyel aktivitesi19' a test etmek olacaktır. Bu veziküller istenen etkisi bilindiğinde ve bir ayrı grup EVs incelenecek olduğunda mümkündür. Farklı hücre kaynaklarından EVs karşılaştırıldığında (örneğin, ilaç Kapsülleme için) veya bilinen işlevsel bir okuma yoksa, artık değişiklikleri doğrudan bir şekilde depolama nedeniyle değerlendirmek mümkün değildir.
Öte yandan, sadece kendi fizikokimyasal parametrelerinde değişiklikleri değerlendirmek, boyut gibi, parçacık kurtarma, ve protein konsantrasyonu, her zaman değişiklikler tahmin etmez EV aktivite, son patent gösterildiği gibi20.
Burada, EVS 'in kargo için bir vekil olarak bir kapsüllü Beta-glukuronidaz enziminin aktivitesi ile birlikte fizikokimyasal parametrelerini değerlendirerek, ailelerinin depolama kararlılığını ölçmek için kolayca uygulanabilir bir protokol sağlıyoruz. Enzim yükleme saponin inkübasyon tarafından yapılır, farklı kaynaklardan EVS ile kurulan hafif bir yöntem21,24,25. Saponin, EV membranında enzim alımı sağlayan geçici gözenekleri oluşturur. Enzimlerin etkinliğini kaybetmek eğilimli olduğu gibi olumsuz depolama koşullarına tabi, onlar EVs fonksiyonel kargoların korunması değerlendirilmesi için ideal bir vekil vardır.
Bu protokol uygulamasının insan mezenkimal kök hücrelerinden (MSCS), insan göbek ven endotel hücrelerinden (huvecs) ve insan adenokarsinoma alveolar epitelyal hücrelerden (A549) elde edilmesi, gerçekten de büyük farklılıklar ortaya koyduğunu göstermiştir EV kaynak21seçerken dikkate alınmalıdır farklı hücre hatları arasında depolama stabilitesi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:933px;" width="933">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">1,2 dimyristoyl-sn glycero-3-phospho-choline (DMPC)</td>
			<td style="width:315px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P2663-25MG</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-choline (DPPC)</td>
			<td style="width:315px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4329-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">225 cm&#178; cell culture flasks</td>
			<td style="width:315px;">Corning</td>
			<td>431082</td>
			<td>Used with 25 ml of medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">30 kDa regenerated cellulose membrane</td>
			<td style="width:315px;">Wyatt Technology Europe</td>
			<td>1854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">350 &#181;m spacer</td>
			<td style="width:315px;">Wyatt Technology Europe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Automated fraction collector</td>
			<td style="width:315px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Beta-glucuronidase</td>
			<td style="width:315px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7646-100KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Chloroform</td>
			<td style="width:315px;">Fisher scientific</td>
			<td>C/4966/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Column oven</td>
			<td style="width:315px;">Hitachi High-Technologies Europe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">D-(+)-Trehalose dihydrate</td>
			<td style="width:315px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9531-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">DAWN HELEOS II, Multi-angle light scattering detector</td>
			<td style="width:315px;">&#160;Wyatt Technology Europe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Durapore Membrane filter, PVDF,&#160; 0,1&#160;&#181;m, 47&#160;mm</td>
			<td style="width:315px;">Merck</td>
			<td>VVLP04700</td>
			<td>Used for the preparation of buffers for AF4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">EBM-2</td>
			<td style="width:315px;">Lonza Verviers, S.p.r.</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td>Endothelial Cell Growth basal medium, used for the serum free culture of HUVEC cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Eclipse dualtec</td>
			<td style="width:315px;">Wyatt Technology Europe</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">EGM-2</td>
			<td style="width:315px;">Lonza Verviers, S.p.r.</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>Endothelial Cell Growth medium, used for the normal culture of HUVEC cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ELISA Plate Sealers</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>DY992</td>
			<td>used for sealing of 96-well plates for the glucuronidase assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Ethanol</td>
			<td style="width:315px;">Fisher scientific</td>
			<td>E/0665DF/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Extruder Set With Holder/Heating Block</td>
			<td style="width:315px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Filter support</td>
			<td style="width:315px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610014-1EA</td>
			<td>used for liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Fluorescein di-&#946;-D-glucoronide</td>
			<td style="width:315px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F2915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Gibco PBS-tablets+CA10:F36</td>
			<td style="width:315px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Hettich Universal 320 R</td>
			<td>Andreas Hettich GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used for pelleting cells at 300 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Hettich Rotina 420 R</td>
			<td style="width:315px;">Andreas Hettich GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used for pelleting larger debris at 3000 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">HUVEC cells</td>
			<td style="width:315px;">Lonza Verviers, S.p.r.</td>
			<td style="width:119px;">C2517A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Kimble&#160; FlexColumn 1X30CM</td>
			<td style="width:315px;">Kimble</td>
			<td>420401-1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Lyophilizer ALPHA 2-4 LSC</td>
			<td style="width:315px;">Christ</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge Tubes, Polypropylene</td>
			<td>VWR international</td>
			<td style="width:119px;">525-0255</td>
			<td>the tubes used for all EV-handling, found to be more favorable than comparable products from other suppliers regarding particle recovery</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Nanosight LM14 equipped with a green laser</td>
			<td style="width:315px;">Malvern Pananalytical</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Nanosight-software version 3.1</td>
			<td style="width:315px;">Malvern Pananalytical</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">Nucleopore 200 nm track-etch polycarbonate membranes</td>
			<td>Whatman/GE Healthcare</td>
			<td align="right">110406</td>
			<td>used for liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">PEEK Inline filter holder</td>
			<td style="width:315px;">Wyatt Technology Europe</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphotungstic acid hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>79690-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Polycarbonate bottles for ultracentrifugation</td>
			<td style="width:315px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">355622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QuantiPro BCA Assay Kit</td>
			<td style="width:315px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>QPBCA-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Saponin</td>
			<td style="width:315px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Scanning electron microscopy Zeiss EVO HD 15</td>
			<td style="width:315px;">Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Sepharose Cl-2b</td>
			<td style="width:315px;">GE Healthcare</td>
			<td>17014001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">SEM copper grids with carbon film</td>
			<td style="width:315px;">Plano</td>
			<td>S160-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Small AF4 channel</td>
			<td style="width:315px;">Wyatt Technology Europe</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Sputter-coater Q150R ES</td>
			<td style="width:315px;">Quorum Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">Transmission electron microscopy JEOL JEM 2011</td>
			<td style="width:315px;">Oxford Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Type 45 Ti ultracentrifugation rotor</td>
			<td style="width:315px;">Beckman Coulter</td>
			<td>339160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Ultimate 3000 Dionex autosampler</td>
			<td style="width:315px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Ultimate 3000 Dionex isocratic pump</td>
			<td style="width:315px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Ultimate 3000 Dionex online vacuum degasser</td>
			<td style="width:315px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Ultracentrifuge OptimaTM L-90 K</td>
			<td style="width:315px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">UV detector</td>
			<td style="width:315px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Whatman 0.2 &#181;m pore size mixed cellulose filter</td>
			<td>Whatman/GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">10401712</td>
			<td>Used for the filtration of all buffers used with the EVs and in SEC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of the storage stability of extracellular vesicles

Ekstrelüler veziküller (EVs), ilaç, uyuşturucu taşıyıcıları ve Biyomarkörler olarak kullanılmak üzere mevcut araştırmalarda umut verici hedeflerdir. Onların klinik gelişimi için, sadece onların ilaç aktivitesi önemli değil, aynı zamanda üretim değerlendirilmesi gerekir. Bu bağlamda araştırma, EVs yalıtımına, onların karakterizasyonu ve depolarına odaklanır. Mevcut el yazısı, genetik manipülasyon veya spesifik fonksiyonel etkileri olmadan, EVs üzerinde farklı depolama koşullarının etkisini değerlendirmek için bir facile prosedürü sağlamayı amaçlamaktadır. Bu mümkün hızlı bir şekilde belirli bir depolama koşulu altında EVs istikrarı bir ilk izlenim almak için yapar, ve farklı hücre kaynaklarından türetilen EVs kolayca karşılaştırılabilir. Kararlılık ölçümü, EVs (boyut, parçacık konsantrasyonu ve morfoloji) ve onların kargo aktivitesinin korunması fizikokimyasal parametrelerine dayanır. İkincisi, EVS içine enzim Beta-glukuronidaz saponin-aracılı kapsülleme tarafından değerlendirilir. Glukuronidaz bir vekil olarak davranır ve bir floresan muhabir molekül bölünmesini ile kolay bir kantifikasyon sağlar. Mevcut protokol, klinik uygulamaya doğru EV araştırmalarını ilerletmek için EV özelliklerini en iyi şekilde korumak için depolama koşulları arayışında araştırmacılar için bir araç olabilir.

Şekil 1 , huvecs 'den Izole edilen EVS 'nin depolama özelliklerini görüntüler. EVs UC tarafından izole edildi, glukuronidaz kapsüllenmiş, ve SEC sonra, saflaştırılmış EVs NTA tarafından Fizikokimyasal özellikleri için değerlendirildi. Veziküllerin bir örneği daha sonra AF4 arıtılmasına maruz kalmıştır ve glukuronidaz aktivitesi ölçülmüştür.
Veziküller daha sonra 4 °C veya-80 °C ' de 7 d ve likofilize formda 4 °C ' de, ikinci durumda ise% 4 t...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles at JoVE.com

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Ekstrasellüler veziküllerin depolama Istikrarı değerlendirilmesi

Burada, hücre tarafından üretilen doğal Nano opartiküllerden oluşan bir grup olan ekstrüllüler veziküller için depolama kararlılığını değerlendirmek üzere kolayca uygulanabilir bir protokol sunuyoruz. Veziküller bir model enzim olarak glukuronidaz ile yüklenir ve farklı koşullarda saklanır. Depodan sonra, fizikokimyasal parametreleri ve kapsüllenmiş enzimin aktivitesi değerlendirilir.

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

Ekstra hücresel veziküllerin depolama stabilitesi, prospektif terapötik kullanımları için önemli bir parametredir. Protokolümüz, depolamanın vezikülleri nasıl etkilediğini değerlendirmek için kolayca uygulanabilir bir araç sağlar. Tekniğimizin en büyük avantajı, glukuronidaz'ı eksojen bir belirteç olarak tanıtarak, farklı ana hücrelerden elde edilen hücre dışı veziküllerin depolanabilirlik açısından kolayca karşılaştırılmasıdır.Asimetrik akış alanı akış fraksiyonu veya AF4, çok hassas bileşikler için boyut dışlama kromatografi saflaştırma hafif bir alternatiftir. Çünkü bileşikler kanalda daha az stresle karşılaşır. Glukuronidaz hassas bir enzim olduğu için, mevcut ların kalitesi kapsamlı planlama ve arınma ve analiz için arka arkaya adımların yürütülmesinden yararlanır.Bu hücreler için standart koşullara göre ilgi hücre hattı kültürlendikten sonra, serum ücretsiz veya ekstra hücresel vezikül tükenmiş orta ile supernatant değiştirin ve ek bir 24 ila 72 saat için hücre kültürü kuluçka hücreleri iade. Kuluçka sonunda, her şişeden süper natant toplamak ve hücreleri tortu örnekleri santrifüj. Peletrahatsız etmeden hücre klimalı orta dikkatle toplayın.Ve hücre enkaz ve büyük agregalar kaldırmak için tekrar orta santrifüj. Sonra dikkatle ultracentrifuge tüpler içine supernatants aktarın. Sabit bir açı rotoru kullanıyorsanız, santrifüj sonrası hücre dışı vezikül peletinin alınmasını kolaylaştırmak için tüplerin santrifüjdeki yönünü işaretleyin.Ultracentrifugation sonunda, dikkatle ekstrasellüler vezikül pelet rahatsız etmeden supernatant atmak için bir serolojik pipet kullanın. 0.2 mikrometre gözenek 200 mikrolitre ilk ultracentrifuge tüp artık supernatant PBS filtrelenmiş. Pelet imal edildikten sonra, tüm ekstrasellüler vezikül peletleri yeniden askıya alınana kadar sonraki peletin yeniden askıya alınması için ortaya çıkan ekstrasellüler vezikül süspansiyonunu bir sonraki tüpe aktarın.Mililitre başına 1,5 miligramlık son konsantrasyona son resuspended pelet çözeltisine beta glukuronidaz ekleyin. Ve saponin mililitre başına 0.1 miligram lık son konsantrasyona. Daha sonra üç saniye girdap ile iyice karıştırın ve aralıklı hafif flicking ile 10 dakika oda sıcaklığında reaksiyon yerleştirin.Glukuronidaz kapsüllendikten sonra, tarafsız depolama stabilitesi sonuçları elde etmek için sonraki tüm saflaştırma vezikül değerlendirme adımlarını aynı gün gerçekleştirdiğinden emin olun. Bir boyut dışlama kromatografi sütun pbs en az iki sütun hacimleri saponin kuluçka hemen sonra pelet arındırmak için hazır ile denge. Arındırmak için, kolona 400 mikrolitreye kadar hücre dışı vezikül süspansiyonu ekleyin.Sonra eluate bir mililitre fraksiyonları toplamak. Hücre dışı veziküllerin kontamine proteinlerden ve serbest glukuronidazlardan ayrılmasını sağlamak için, üreticilerin talimatlarına göre protein konsantrasyonunu bicinchoninic asit tsay ile ölçün. İlgili alet ve vezikül tipi için optimize edilmiş parametreleri kullanarak, hücre dışı vezikül boyutunu ve konsantrasyonunu ölçmek için bir nano parçacık izleme analiz cihazı kullanın.Glukuronidaz aktivitesini ölçmek için, saflaştırılmış ekstrasellüler 125 mikrolitre taze hazırlanmış floresan di-beta-D-glukuronit 25 mikrolitre ekleyin ve siyah 96-iyi plaka bir kuyu örnek ekleyin. 480 nanometre uyarma ve 516 nanometre emisyon bir plaka okuyucu üzerinde zaman sıfır floresan üretimini ölçün. Buharlaşmayı azaltmak için plakayı şeffaf plastik folyo ile sıkıca kapatın.Daha sonra 37 santigrat derecede 18 saat boyunca ışıktan korunan plakayı kuluçkaya yatırın. Sadece gösterildiği gibi plaka okuyucu üzerinde 18 saat floresan üretimini ölçün. Ekstrasellüler vezikül liyofilizasyonu için, saflaştırılmış veziküllere trehalose mililitre başına dört miligram ekleyin.Ve vezikülleri eksi 80 derecede en az bir saat dondurun. Numuneleri lizifleştirmek için, bir lyophilizer'ın raf sıcaklığını 15 dereceye, basıncı 0,180 milibara ayarlayın. Vezikülleri bu koşullar altında 46 saat kurutun.Ana kurutma adımının sonunda raf sıcaklığını 25 dereceye, basıncı 0035 milibar'a ayarlayın ve numuneleri bu koşullar altında iki saat kurutun. Sonra lyophilized örnekleri dört santigrat derecede saklayın. Depodan sonra numuneleri yeniden sulandırmak için, liyofilizizasyondan önce hücre dışı vezikül süspansiyonunun hacmine eşit bir su hacmi ekleyin.Depolamadan sonra enzim aktivitesini değerlendirmek için, bir AF4 cihazını mobil faz için yeni hazırlanmış 0,1 mikrometre filtrelenmiş PBS ile yükleyin ve çözücüden gelen parçacık gürültüsünü azaltmak için pompadan sonra pik giriş filtresine 0,1 mikrometre filtre membranı takın. Söküldükten sonra, AF4 için küçük kanalı millEq su ile temizleyin. Moleküler ağırlığı 30 kilodalton kesilmiş yeni bir rejenere selüloz membran hydrate ve parlak tarafı ile perde üstüne membran yerleştirin.Kanalın üst yarısının altına 350 mikrometrelik geniş bir boşluk yerleştirin ve kanal parçalarını birleştirin. Bir tork tornavida kullanarak, vidaları önce beş Newton metrelik bir torka, sonra da yedi Newton metrelik torka sıkın. Bir crisscross desen blok etrafında vida sıkma.Kanalları giriş, çıkış ve çapraz akış bağlantı noktasını tutulmaya bağlayın. Sonra membranı dengelemek için en az üç eski örnekten. Dakikada bir mililitreye ayarlanmış dedektör akışı ve odak akışı ve dakikada 0,2 mililitre lik bir enjekte akışı ile bir fraksiyon çalışması programlayın.Bir dakikalık ön odaklama adımından sonra, sekiz dakika boyunca dakikada iki mililitreden dakikada 0,1 mililitreye çapraz akışı azaltmadan önce, numuneyi odak ve enjekte adımında 10 dakikalık bir süre boyunca enjekte edin. 10 dakika çapraz akış olmadan bir elution adım ile kesirasyon çalıştırmak bitirmek ve elution ve enjeksiyon bir yıkama adım ekleyin, bir elüsiyon ardından. Daha sonra dakikada iki mililitrelik bir başlangıç çapraz akışı ile bir sonraki çalışma için kanal dengeleyin ve UV dedektörü 280 nanometre ayarlayın.Tüm programlar ayarlandığında, numunenin 300 mikrolitresini enjekte edin ve ASTRA yazılımına UV ve ışık saçılma sinyallerini kaydedin. 12 buçuk dakika sonra, enjeksiyon sonrası 27 dakika kadar bir mililitre fraksiyonları toplamaya başlar. Sonra bir glukuronidase tahlil ve gösterildiği gibi bir nano parçacık izleme analizi gerçekleştirin.Burada, farklı koşullar altında yedi gün depolandıktan sonra insan vasküler endotel hücrelerinden izole edilen hücre dışı veziküllerin boyutu ve hücre dışı veziküllerin boyutu taze bir örnekle karşılaştırıldığında gösterilmiştir. Veziküller daha sonra AF4 saflaştırmasına tabi tutuldu ve partikül başına glukuronidaz aktivitesi ölçüldü. Hem boyut dışlama kromatografisi hem de AF4 ekstrasellüler vezikülü serbest glukuronidazdan ayırmada başarılıdır.Parçacıklar ve serbest enzim arasında AF4 için daha yüksek ayrışma derecesi nedeniyle, vezikül içeren fraksiyonların kontaminasyonu daha az olasıdır. Depolama dan sonra AF4 saflaştırma numunelerden serbest enzim kaldırır ve böylece parçacık başına kurtarılan enzim aktivitesi miktarını düşürür. Bu etki en çok dört santigrat derecede depoedildikten sonra belirgindir ve bunun için 2/3 azalma gözlenir.Bu ek arıtma adımı atlayarak enzim stabilitesi hakkında yanlış varsayıma yol açabilir. İletim elektron mikroskobu, kriyoprotektif olmadan liyofilize edilen hücre dışı veziküller için büyük şekil farklılıkları göstermez. Taramalı elektron mikroskobu görüntülemesi ise eksi 80 derece depolanmış numunelerde bulunmayan liyofilize numunelerde agregaların varlığını ortaya koymaktadır.Glukuronidaz tsay'dan önce serbest enzimin veziküllerden uzaklaştırılması çok önemlidir. Bu nedenle vezikül arınması için kullanılan tekniğin iyice değerlendirilmesi gerekmektedir. Saflaştırılmış parçacıklar da depolama membran proteinleri veya şekerlerin doğal bileşimi değişti olup olmadığını öğrenmek için yüzey yükü açısından bakılabilir.Tekniğimiz ile, mevcut aktivite için bilinen belirli belirteçler veya tahliller olmasa bile, hücre dışı vezikül depolama stabilitesi hakkında ilk endikasyon elde etmek mümkündür.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Doku Değerlendirilmesinde Manyetik Rezonans Elastography Metodoloji Construct Büyüme Tasarlandı

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Nano ölçekli Lipid Vesiküller Hazırlanması için Sabit Basınç kontrollü Ekstrüzyon Yöntemi

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Hücresel Mimics İnşası için Veziküller Hücre-ücretsiz Transkripsiyon ve Çeviri Makine Sarma

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

Sayımı ve Ayarlanabilir Dirençli Darbe Algılama Yöntemi Ekstrasellüler Veziküller boyutu-profil

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

Modifiye İki foton mikroskop 3D Orbital Takip: Hücre içi veziküllerin İzlemeye Bir Uygulama

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

Ekstrasellüler Veziküller Yalıtım ve Karakterizasyonu için kağıt tabanlı cihazlar

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Doku spesifik Hücre Kültürü ve Delivery Platform olarak Ekstrasellüler Matriks kaynaklı Köpükler ve mikro Fabrikasyon

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Akustik Ayırıcı Kullanarak CHO Hasat Edilen Hücre Kültürü Sıvısının Birincil Netleştirilmesi

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...

Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants

Kıkırdak Eksplantlarında Göç ve Alımı İzlemek için Hücre Dışı Veziküllerin Etiketlenmesi

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their ...

Platelet-Derived Extracellular Vesicle Functionalization of Ti Implants

Ti İmplantların TrombositTen Türetilmiş Hücre Dışı Veziklin İşlevselleştirilmesi

Extracellular Vesicles (EVs) are biological nanovesicles that play a key role in cell communication. Their content includes active biomolecules such as ...