Name: looking outwards: isolation of cyanobacterial released carbohydrate polymers and proteins
Uploaded: 2019-05-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins at JoVE.com

تم تمويل هذا العمل من صناديق الصندوق الأوروبي للمشاريع الإقليمية من خلال برنامج COMPETE 2020 - Operacional للقدرة التنافسية والتدويل، البرتغال 2020، ومن الأموال البرتغالية من خلال FCT - Fundação para a Ciência e (أ) Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior in the framework of the project POCI-01-0145-FEDER-028779 and grant SFRH/BD/99715/2014 (CF).

1. السماوية أطلقت الكربوهيدرات البوليمر العزلة
<ol><li>
عزل البوليمر وإزالة الملوثات
	<ol>
<li>زراعة سلالة السيانوبكتيرية في ظل ظروف قياسية [على سبيل المثال، 30 درجة مئوية تحت ضوء 12 ساعة (50 درجة مئويةم −2ق −1)/12 ح نظام الظلام، مع اهتزاز المداري في 150 دورة في الدقيقة]. قياس النمو ...

<ol>
	<li>Pereira, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexity+of+cyanobacterial+exopolysaccharides:+composition,+structures,+inducing+factors+and+putative+genes+involved+in+their+biosynthesis+and+assembly.">Complexity of cyanobacterial exopolysaccharides: composition, structures, inducing factors and putative genes involved in their biosynthesis and assembly.</a> FEMS Microbiology Reviews. 33 (5), 917-941 (2009).</li><li>Kanekiyo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+an+Antiviral+Polysaccharide,+Nostoflan,+from+a+Terrestrial+Cyanobacterium,+Nostoc+flagelliforme.">Isolation of an Antiviral Polysaccharide, Nostoflan, from a Terrestrial Cyanobacterium, Nostoc flagelliforme.</a> Journal of Natural Products. 68 (7), 1037-1041 (2005).</li><li>L&#248;bner, M., Walsted, A., Larsen, R., Bendtzen, K., Nielsen, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+human+adaptive+immune+responses+by+administration+of+a+high-molecular-weight+polysaccharide+extract+from+the+cyanobacterium+Arthrospira+platensis.">Enhancement of human adaptive immune responses by administration of a high-molecular-weight polysaccharide extract from the cyanobacterium Arthrospira platensis.</a> Journal of Medicinal Food. 11 (2), 313-322 (2008).</li><li>Wang, H. B., Wu, S. J., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+polysaccharides+from+cyanobacteria+Nostoc+commune+and+their+antioxidant+activities.">Preparation of polysaccharides from cyanobacteria Nostoc commune and their antioxidant activities.</a> Carbohydrate Polymers. 99, 553-555 (2014).</li><li>Ozturk, S., Aslim, B., Suludere, Z., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+removal+of+cyanobacterial+exopolysaccharides+by+uronic+acid+content+and+monosaccharide+composition.">Metal removal of cyanobacterial exopolysaccharides by uronic acid content and monosaccharide composition.</a> Carbohydrate Polymers. 101, 265-271 (2014).</li><li>Han, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emulsifying,+flocculating,+and+physicochemical+properties+of+exopolysaccharide+produced+by+cyanobacterium+Nostoc+flagelliforme.">Emulsifying, flocculating, and physicochemical properties of exopolysaccharide produced by cyanobacterium Nostoc flagelliforme.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 172 (1), 36-49 (2014).</li><li>Leite, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterium&#8208;Derived+Extracellular+Carbohydrate+Polymer+for+the+Controlled+Delivery+of+Functional+Proteins.">Cyanobacterium&#8208;Derived Extracellular Carbohydrate Polymer for the Controlled Delivery of Functional Proteins.</a> Macromolecular Bioscience. 17 (2), 1600206 (2017).</li><li>Estevinho, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+cyanobacterial+extracellular+polymeric+substance+in+the+microencapsulation+of+vitamin+B12.">Application of a cyanobacterial extracellular polymeric substance in the microencapsulation of vitamin B12.</a> Powder Technology. 343, 644-651 (2019).</li><li>Klock, J. H., Wieland, A., Seifert, R., Michaelis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+polymeric+substances+(EPS)+from+cyanobacterial+mats:+characterisation+and+isolation+method+optimisation.">Extracellular polymeric substances (EPS) from cyanobacterial mats: characterisation and isolation method optimisation.</a> Marine Biology. 152 (5), 1077-1085 (2007).</li><li>Delattre, C., Pierre, G., Laroche, C., Michaud, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+extraction+and+characterization+of+microalgal+and+cyanobacterial+exopolysaccharides.">Production, extraction and characterization of microalgal and cyanobacterial exopolysaccharides.</a> Biotechnology Advances. 34 (7), 1159-1179 (2016).</li><li>Costa, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+systems+in+gram-negative+bacteria:+structural+and+mechanistic+insights.">Secretion systems in gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (6), 343-359 (2015).</li><li>Roier, S., Zingl, F. G., Cakar, F., Schild, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicle+biogenesis:+a+new+mechanism+and+its+implications.">Bacterial outer membrane vesicle biogenesis: a new mechanism and its implications.</a> Microbial Cell. 3 (6), 257-259 (2016).</li><li>Sergeyenko, T. V., Los, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+secreted+proteins+of+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+strain+PCC+6803.">Identification of secreted proteins of the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803.</a> FEMS Microbiology Letters. 193 (2), 213-216 (2000).</li><li>Oliveira, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatile+TolC-like+Slr1270+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">The versatile TolC-like Slr1270 in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Environmental Microbiology. 18 (2), 486-502 (2016).</li><li>Flores, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alternative+sigma+factor+SigF+is+a+key+player+in+the+control+of+secretion+mechanisms+in+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">The alternative sigma factor SigF is a key player in the control of secretion mechanisms in Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Environmental Microbiology. 21 (1), 343-359 (2018).</li><li>Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+method+for+determination+of+sugars+and+related+substances.">Colorimetric method for determination of sugars and related substances.</a> Analytical Chemistry. 28 (3), 350-356 (1956).</li><li>Parikh, A., Madamwar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+characterization+of+extracellular+polysaccharides+from+cyanobacteria.">Partial characterization of extracellular polysaccharides from cyanobacteria.</a> Bioresource Technology. 97 (15), 1822-1827 (2006).</li><li>R&#252;hmann, B., Schmid, J., Sieber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+identify+the+unexplored+diversity+of+microbial+exopolysaccharides.">Methods to identify the unexplored diversity of microbial exopolysaccharides.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 565 (2015).</li><li>Pathak, J., Rajneesh, R., Sonker, A. S., Kannaujiya, V. K., Sinha, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterial+extracellular+polysaccharide+sheath+pigment,+scytonemin:+A+novel+multipurpose+pharmacophore.">Cyanobacterial extracellular polysaccharide sheath pigment, scytonemin: A novel multipurpose pharmacophore.</a> Marine Glycobiology. , 343-358 (2016).</li><li>Nguyen, A. T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performances+of+different+protocols+for+exocellular+polysaccharides+extraction+from+milk+acid+gels:+Application+to+yogurt.">Performances of different protocols for exocellular polysaccharides extraction from milk acid gels: Application to yogurt.</a> Food Chemistry. 239, 742-750 (2018).</li><li>Jamshidian, H., Shojaosadati, S. A., Mousavi, S. M., Soudi, M. R., Vilaplana, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+of+recovery+procedures+on+structural+and+rheological+properties+of+schizophyllan+produced+from+date+syrup.">Implications of recovery procedures on structural and rheological properties of schizophyllan produced from date syrup.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 105, 36-44 (2017).</li><li>Couto, N., Schooling, S. R., Dutcher, J. R., Barber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+profiles+of+outer+membrane+vesicles+and+extracellular+matrix+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Proteome profiles of outer membrane vesicles and extracellular matrix of Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Journal of Proteome Research. 14 (10), 4207-4222 (2015).</li></ol>

لفهم آليات إفراز البكتيريا بشكل أفضل ودراسة المنتجات الصادرة، فمن الأهمية بمكان لإظهار العزلة الفعالة وتحليل الجزيئات الحيوية الموجودة في البيئة البكتيرية خارج الخلية (مثل الإفراج البوليمرات الكربوهيدرات والبروتينات).
البوليمرات الكربوهيدرات الخلوية خارج الخلية معقدة ...

ومن المسلم به على نطاق واسع البكتيريا السماوية كمصادر وافرة من المنتجات الطبيعية مع التطبيقات الواعدة للتكنولوجيا الحيوية / الطبية الحيوية. ولذلك، فهم آليات إفراز السيانوبكتيرية وتحسين أساليب الاستخراج / الاستعادة ضرورية لتنفيذ البكتيريا السماوية كمصانع الخلايا الميكروبية فعالة.
العديد من سلالات الخلايا القادرة على إنتاج المواد البوليمرية خارج الخلية (EPS)، التي شكلت أساسا من قبل السكريات heteropolysacrides، التي لا تزال مرتبطة سطح الخلية أو يتم تحريرها في المتوسط1. هذه البوليمرات الكربوهيدرات الصادرة لها ميزات متميزة بالمقارنة مع تلك التي من البكتيريا الأخرى، والتيتجعلها مناسبة لمجموعة واسعة من التطبيقات (على سبيل المثال، مضادات الفيروسات 2، المحفزات المناعية3،مضادات الأكسدة4، المعادن- تلاوة5،استحلاب6،ووكلاء تسليم المخدرات7،8). منهجية لعزل هذه البوليمرات يساهم إلى حد كبير ليس فقط لتحسين الغلة ولكن أيضا لزيادة النقاء والخصائص الفيزيائية المحددة للبوليمر التي تم الحصول عليها9. الغالبية العظمى من هذه الأساليب لعزل البوليمرات تعتمد على استراتيجيات هطول الأمطار من وسط الثقافة التي يتم إنجازها بسهولة بسبب طبيعة البوليمر الأيونية القوية9،10. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يتحقق بسرعة إزالة المذيبات المستخدمة في خطوة هطول الأمطار عن طريق التبخر و / أو الليونفيلية. اعتمادا على التطبيق المتوقع، يمكن أن يقترن خطوات مختلفة إما بعد أو قبل هطول الأمطار البوليمر من أجل تكييف المنتج النهائي، والتي تشمل حمض ثلاثي كلور والخليك (TCA) العلاج، والترشيح، أو حجم استبعاد اللونية (SEC) تنقية العمود10.
البكتيريا السماوية هي أيضا قادرة على إفراز مجموعة واسعة من البروتينات من خلال مسارات تعتمد على ناقلات الغشاء (الكلاسيكية)11 أو بوساطة الحويصلات (غير الكلاسيكية)12. ولذلك، فإن تحليل exoproteome سيانوبكتيريك يشكل أداة أساسية، سواء لفهم / التلاعب آليات إفراز البروتين السماوي وفهم وظيفة محددة خارج الخلية من هذه البروتينات. العزلة الموثوقة وتحليل exoproteomes تتطلب تركيز الوسط خارج الخلية، لأن وفرة البروتينات التفرز منخفضة نسبيا. بالإضافة إلى ذلك، قد تعمل الخطوات الفيزيائية أو الكيميائية الأخرى (مثل الطرد المركزي أو الترشيح أو هطول الأمطار البروتيني) على تحسين نوعية exoproteome التي تم الحصول عليها، مما يثري محتوى البروتين13،ويتجنب وجود الملوثات (على سبيل المثال، أصباغ، والكربوهيدرات،الخ.) 14 سنة , 15 أو غلبة البروتينات داخل الخلايا في العينات. ومع ذلك، قد تقيد بعض هذه الخطوات أيضًا مجموعة البروتينات التي يمكن اكتشافها، مما يؤدي إلى تحليل متحيز.
يصف هذا العمل بروتوكولات فعالة لعزل البوليمرات الكربوهيدرات الصادرة وexoproteomes من وسائل الإعلام ثقافة السيانوبكتريا. ويمكن تكييف هذه البروتوكولات بسهولة مع الأهداف المحددة للدراسة واحتياجات المستعملين، مع الحفاظ على الخطوات الأساسية المعروضة هنا.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1393px;" width="1392">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Dialysis membranes</td>
			<td style="width:191px;">Medicell Membranes Ltd&#160;</td>
			<td style="width:119px;">DTV.12000.07</td>
			<td style="width:777px;">Visking Tubing Size 7, Dia 23.8 mm, Width 39-41 mm 30m Roll&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Ethanol 96%</td>
			<td style="width:191px;">AGA - &#193;lcool e G&#233;neros Alimentares, S.A.</td>
			<td style="width:119px;">4.000.02.02.00</td>
			<td>Fermentation ethyl alcohol 96% AGA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">PES Filter 0.2 &#956;m</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific, Lda</td>
			<td style="width:119px;">15206869</td>
			<td>Syringe filter polystyrene 33MM 0.2&#181;M STR&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Amicon Ultra-15, Ultracel-3K</td>
			<td style="width:191px;">Merck Millipore Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">UFC900324</td>
			<td>Centrifugal filters with a nominal molecular weight cut-off of 3 kDa</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Thermo Scientific&#160;Pierce BCA Protein Assay</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific, Lda</td>
			<td style="width:119px;">10741395</td>
			<td>Green-to-blue, precise, detergent-compatible assay reagent to measure total protein concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Brillant Blue G Colloidal Concentrate&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Sigma Aldrich Qu&#237;mica SL</td>
			<td style="width:119px;">B2025-1EA</td>
			<td>Coomassie blue&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

looking outwards: isolation of cyanobacterial released carbohydrate polymers and proteins

يمكن أن تفرز البكتيريا السماوية بنشاط مجموعة واسعة من الجزيئات الحيوية في البيئة خارج الخلية، مثل السكريات غير المتجانسة والبروتينات. يمكن لتحديد وتوصيف هذه الجزيئات الحيوية تحسين المعرفة حول مسارات إفرازها وتساعد على التلاعب بها. وعلاوة على ذلك، فإن بعض هذه الجزيئات الحيوية مثيرة للاهتمام أيضا من حيث تطبيقات التكنولوجيا الحيوية. هنا اثنين من بروتوكولات العزل السهل والسريع للبوليمرات الكربوهيدرات المنكتيرية المفرج عنها والبروتينات. وتستند طريقة عزل البوليمرات الكربوهيدرات الصادرة على تقنيات هطول الأمطار التقليدية من السكريات في الحلول المائية باستخدام المذيبات العضوية. تحافظ هذه الطريقة على خصائص البوليمر وتتجنب في الوقت نفسه وجود الملوثات من حطام الخلايا والثقافة المتوسطة. في نهاية العملية، البوليمر الليوفيل على استعداد لاستخدامها أو وصفها أو يمكن أن تخضع لجولات أخرى من تنقية، اعتمادا على الاستخدام النهائي المقصود. وفيما يتعلق بعزل الإكسبروتيوم السيانوبكتيري، تقوم هذه التقنية على تركيز الوسيط الخالي من الخلايا بعد إزالة الملوثات الرئيسية عن طريق الطرد المركزي والترشيح. تسمح هذه الاستراتيجية لعزل موثوق بها من البروتينات التي تصل إلى الوسط خارج الخلية عن طريق ناقلات الغشاء أو الحويصلات الغشاء الخارجي. ويمكن تحديد هذه البروتينات في وقت لاحق باستخدام تقنيات قياس الطيف الكتلي القياسية. البروتوكولات المعروضة هنا يمكن تطبيقها ليس فقط على مجموعة واسعة من البكتيريا السماوية، ولكن أيضا على سلالات البكتيرية الأخرى. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تكون هذه الإجراءات مصممة بسهولة وفقا للاستخدام النهائي للمنتجات، ودرجة النقاء المطلوبة، والإجهاد البكتيري.

ويرد في الشكل 1تمثيل تخطيطي للطريقة الموصوفة لاستخراج البوليمرات الكربوهيدراتية الصادرة من الثقافات السماوية. البوليمرات المعجّلة من منتج EPS المعتدل سيانوباكتريوم سينشيوسيستينس sp. PCC 6803 ومنتج EPS الفعال Cyanothece sp. CCY 0110 مبين في الشكل 2. في ...

Watch this Scientific Journal Video about Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins at JoVE.com

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

يبحث إلى الخارج: عزل البوليمرات الكربوهيدرات السيانوبكتيرية المفرج عنها والبروتينات

هنا ، يتم وصف بروتوكولات لعزل البوليمرات الكربوهيدرات الطاردة السماوية وعزل exoproteomes الخاصة بهم. ويجسد كلا الإجراءين خطوات رئيسية للحصول على البوليمرات أو البروتينات ذات درجات النقاء العالية التي يمكن استخدامها لمزيد من التحليل أو التطبيقات. ويمكن أيضا تكييفها بسهولة وفقا لاحتياجات المستخدم محددة.

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

هذه البروتوكولات التي وضعناها مهمة لدراسة آليات إفراز في البكتيريا الزرقاء ومنتجاتها الصادرة، وهي بوليمرات الكربوهيدرات والبروتينات خارج الخلية. المعارف المتولدة سوف تسمح لنا لتخصيص هذه المنتجات لعدة تطبيقات، وهي تطبيقات التكنولوجيا الحيوية والطب الحيوي. هذه البروتوكولات واضحة جدا.ويمكن أن تكون مصممة وفقا للكائنات المنتجة ، واحتياجات المستخدم ، والتطبيق النهائي للمنتج. والميزة الرئيسية لهذه البروتوكولات هي أنها يمكن أن تتكيف بسهولة مع النظم الحية الأخرى، ولا سيما مع البكتيريا الأخرى. هذه البروتوكولات سهلة.ومع ذلك، قد يحتاج المرء لإدخال بعض التغييرات اعتمادا على سلالة بكتيرية أو درجة النقاء المطلوبة. للبدء ، زراعة سلالة البكتيريا الزرقاء في ظل الظروف القياسية. قياس النمو باستخدام بروتوكولات قياسية.بعد ذلك، نقل الثقافة إلى أغشية غسيل الكلى، و dialyze ضد ما لا يقل عن 10 كميات من المياه ديونسيد لمدة 24 ساعة مع اثارة مستمرة. جهاز طرد مركزي في الثقافة في 15،000 مرات ز في أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. نقل افرا إلى قارورة جديدة، والتخلص من بيليه.مرة أخرى في أجهزة الطرد المركزي في 20،000 مرات ز في أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة لإزالة الملوثات، مثل حطام جدار الخلية أو الدهون في الشوائب. بعد الطرد المركزي، نقل سوبرنانت إلى كوب زجاجي، والتخلص من بيليه. لتعجيل البوليمر، إضافة اثنين من وحدات التخزين من 96٪ الإيثانول إلى ناظر، واحتضان التعليق في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.بالنسبة للكميات الصغيرة أو غير المرئية من البوليمر المُعجَّل، فإن جهاز الطرد المركزي في التعليق 13,000 مرة ز عند أربع درجات مئوية لمدة 25 دقيقة. تجاهل بلطف عظمى، وإعادة فرض بيليه في ملليلتر واحد إلى اثنين من المياه ذات الايونية. نقل تعليق مائي إلى قارورة.لكميات مرئية، كميات كبيرة من البوليمر عجلت، وجمع البوليمر عجلت مع ملقط معدنية معقمة إلى قارورة. الضغط على البوليمر، والتخلص من الإيثانول الزائد. لتنفيذ عملية التجميل المعروفة باسم تجميد التجفيف، والحفاظ على قارورة مع البوليمر عجل في ناقص 80 درجة مئوية بين عشية وضحاها.lyophilize البوليمر لمدة 48 ساعة على الأقل. ثم، تخزين البوليمر المجفف في المجففات في درجة حرارة الغرفة حتى مزيد من الاستخدام. لتركيز المتوسطة، أولا زراعة البكتيريا الزرقاء في ظل الظروف القياسية.مراقبة نمو البكتيريا الزرقاء باستخدام الإجراءات القياسية. ثم، الطرد المركزي الثقافات في 4،000 مرات ز في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. نقل فائقة إلى قارورة، والتخلص من بيليه الخلية.بعد ذلك، قم بتصفية الوسيطة المُصفّدة من خلال مُصفّي حجم المسام 0.2 ميكرون. لتركيز المتوسط حوالي 500 مرة، استخدم المكثفات الطرد المركزي مع قطع الوزن الجزيئي الاسمي من ثلاثة كيلودالون إلى جهاز الطرد المركزي 4، 000 مرات ز و 15 درجة مئوية لمدة أقصاها ساعة واحدة في جولة الطرد المركزي. بعد الطرد المركزي، شطف جدران خزان عينة جهاز التصفية مع العينة المركزة، ونقل المحتوى إلى أنبوب microcentrifuge.قم بإجراء خطوة إضافية للغسيل في خزان عينة جهاز التصفية باستخدام الوسيطة الخاصة بالثقافة ذات التكفاميد لضمان استرداد إكستروتيم أقصى. ثم، تخزين عينات exoproteome في ناقص 20 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخدام. الإيثانول يجب أن يضاف بقوة لتحسين البوليمر هطول الأمطار والعائد.بعد الطرد المركزي للبوليمر المُعجل، ينبغي أن يتم التخلص من المُبالغ المُبالغ بعناية من أجل تجنب إعادة الارحام في البيليه التي قد تكون مُلصقة بشكل فضفاض على جدار القارورة. إذا تم إجراء الترشيح اليدوي، يجب أن يكون لطيفًا لتجنب كسر غشاء التصفية. بعض البوليمرات التي عجلت يمكن أن تكون مرئية إلا بعد الطرد المركزي، وأساسا على جدران القارورة، مثل حالة EPS من Synechocystis.في حالات أخرى، مثل البوليمر Cyanothece، فمن الممكن أن نرى كتل البوليمر العائمة في كوب الزجاج بعد هطول الأمطار. يمكن بسهولة الكشف عن بعض التلوث العيانية بعد البوليمر الlyophilization لأنها سوف تغير تصبغ البوليمر، وعادة بيضاء أو البني الفاتح. البوليمرات البرتقالية ملوثة بالكاروتينات أو الهياكل التي تحتوي على هذه الأصباغ.فعلى سبيل المثال، تكون البوليمرات الخضراء ملوثة بحطام الخلايا والكلورو. يمكن أن تختلف إكستريتيوم بشكل كبير اعتمادا على سلالة بكتيرية. انظر، على سبيل المثال، exoproteome من البكتيريا الزرقاء أحادية الخلية واحد من سلالة خيوطية.يمكن أن تعوق الكمية العالية من السكريات في العينات المركزة exoproteome تحليل اكسوبروتيوم. على سبيل المثال، يمكن أن يؤخر فصل البروتين وقناع البروتينات أقل وفرة. يمكن للمستخدم تحديد خصائص البوليمر من حيث التركيب ، والخصائص الفيزيائية / الكيميائية ، واختبار النشاط البيولوجي البوليمر ، أو مكونات البوليمر المعدلة.لتحديد البروتين، يمكن إجراء فصل البروتينات في هلام وقياس الطيف الشامل. و لفصل من vesicles، وينبغي تنفيذ الطرد فائقة المركزية من exoproteome. في مجموعتنا، مهدت هذه البروتوكولات بالفعل الطريق لكشف آليات إفراز البكتيريا الزرقاء أو تطبيقات البوليمرات الكربوهيدرات خارج الخلية في مجالات مختلفة، مثل في العلاج الحيوي أو كعوامل أنتيتومور أو توصيل المخدرات.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Biochemistry of the Cell

SCIENTISTS IN ACTION

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

فحص الإنتاجية العالية من الكربوهيدرات المهينة الانزيمات عن طريق رواية غير قابل للذوبان اللونية الركيزة الفحص أطقم

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

تحديد البروتينات النباتية الجليد ملزمة من خلال تقييم تثبيط الآيس التبلور وعزل عن طريق الآيس تقارب تنقية

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

عزل بروتينات الشعيرة المتوسطة من أنسجة الفئران المتعددة لدراسة التعديلات المرتبطة بالشيخوخة بعد الترجمة

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

وصف SP0092 الركيزة-ملزمة-بروتين النقل الكربوهيدرات البيوكيميائية والهيكلية

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

تحليل البروتين الحيوي المجمعات تجميعها على والإفراج عن بيوسينسور بيولايير قياس التداخل باستخدام الطيف الكتلي والمجهر الإلكتروني

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

عزل جلوميرولي و في فيفو وسم البروتينات السطحية خلية الكبيبي

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

تلوين الفضة الفلورسنت من البروتينات في المواد الهلامية Polyacrylamide

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Interfacial Molecular-level Structures of Polymers and Biomacromolecules Revealed via Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy

الهياكل على المستوى الجزيئي بين الوجهين من البوليمرات والجزيئات الحيوية التي تم الكشف عنها عن طريق التحليل الطيفي الاهتزازي لجيل التردد الكلي

As a second-order nonlinear optical spectroscopy, sum frequency generation (SFG) vibrational spectroscopy has widely been used in investigating various ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

توطين البروتينات المعدلة السومو باستخدام السومو الفلورسنت-البروتينات الملائمة

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Preparation of High-Quality Fermented Fish Product

إعداد منتجات الأسماك المخمرة عالية الجودة

This protocol provides a method for preparation of industrialized fermented fish product with sturgeon (Aquilaria sinensis) meat product. The procedures ...