Name: looking outwards: isolation of cyanobacterial released carbohydrate polymers and proteins
Uploaded: 2019-05-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret af Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) midler gennem konkurrence 2020-Operacional programmet for konkurrenceevne og internationalisering (POCI), Portugal 2020, og af portugisiske fonde gennem FCT-Fundação para a Ciência e a tecnologia/Ministério da Ciência, tecnologia e ensino Superior inden for rammerne af projektet POCI-01-0145-FEDER-028779 og Grant SFRH/BD/99715/2014 (CF).

1. cyanobakterial frigivet kulhydrat polymer isolation
<ol><li>
Polymer isolering og fjernelse af forurenende stoffer
	<ol>
<li>Den cyanobakteriale stamme dyrkes under standardbetingelser [f. eks. 30 °C under et 12 timer lys (50 μE m− 2s− 1)/12 h mørkt regime, med omrystning ved 150 rpm]. Mål vækst ved hjælp af standardprotokoller [f. eks. optisk tæthed ved 730 nm (OD730nm), klorofyl a, tørvægt osv.], og mål derefter produktionen af frigivne polys...

<ol>
	<li>Pereira, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexity+of+cyanobacterial+exopolysaccharides:+composition,+structures,+inducing+factors+and+putative+genes+involved+in+their+biosynthesis+and+assembly.">Complexity of cyanobacterial exopolysaccharides: composition, structures, inducing factors and putative genes involved in their biosynthesis and assembly.</a> FEMS Microbiology Reviews. 33 (5), 917-941 (2009).</li><li>Kanekiyo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+an+Antiviral+Polysaccharide,+Nostoflan,+from+a+Terrestrial+Cyanobacterium,+Nostoc+flagelliforme.">Isolation of an Antiviral Polysaccharide, Nostoflan, from a Terrestrial Cyanobacterium, Nostoc flagelliforme.</a> Journal of Natural Products. 68 (7), 1037-1041 (2005).</li><li>L&#248;bner, M., Walsted, A., Larsen, R., Bendtzen, K., Nielsen, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+human+adaptive+immune+responses+by+administration+of+a+high-molecular-weight+polysaccharide+extract+from+the+cyanobacterium+Arthrospira+platensis.">Enhancement of human adaptive immune responses by administration of a high-molecular-weight polysaccharide extract from the cyanobacterium Arthrospira platensis.</a> Journal of Medicinal Food. 11 (2), 313-322 (2008).</li><li>Wang, H. B., Wu, S. J., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+polysaccharides+from+cyanobacteria+Nostoc+commune+and+their+antioxidant+activities.">Preparation of polysaccharides from cyanobacteria Nostoc commune and their antioxidant activities.</a> Carbohydrate Polymers. 99, 553-555 (2014).</li><li>Ozturk, S., Aslim, B., Suludere, Z., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+removal+of+cyanobacterial+exopolysaccharides+by+uronic+acid+content+and+monosaccharide+composition.">Metal removal of cyanobacterial exopolysaccharides by uronic acid content and monosaccharide composition.</a> Carbohydrate Polymers. 101, 265-271 (2014).</li><li>Han, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emulsifying,+flocculating,+and+physicochemical+properties+of+exopolysaccharide+produced+by+cyanobacterium+Nostoc+flagelliforme.">Emulsifying, flocculating, and physicochemical properties of exopolysaccharide produced by cyanobacterium Nostoc flagelliforme.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 172 (1), 36-49 (2014).</li><li>Leite, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterium&#8208;Derived+Extracellular+Carbohydrate+Polymer+for+the+Controlled+Delivery+of+Functional+Proteins.">Cyanobacterium&#8208;Derived Extracellular Carbohydrate Polymer for the Controlled Delivery of Functional Proteins.</a> Macromolecular Bioscience. 17 (2), 1600206 (2017).</li><li>Estevinho, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+cyanobacterial+extracellular+polymeric+substance+in+the+microencapsulation+of+vitamin+B12.">Application of a cyanobacterial extracellular polymeric substance in the microencapsulation of vitamin B12.</a> Powder Technology. 343, 644-651 (2019).</li><li>Klock, J. H., Wieland, A., Seifert, R., Michaelis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+polymeric+substances+(EPS)+from+cyanobacterial+mats:+characterisation+and+isolation+method+optimisation.">Extracellular polymeric substances (EPS) from cyanobacterial mats: characterisation and isolation method optimisation.</a> Marine Biology. 152 (5), 1077-1085 (2007).</li><li>Delattre, C., Pierre, G., Laroche, C., Michaud, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+extraction+and+characterization+of+microalgal+and+cyanobacterial+exopolysaccharides.">Production, extraction and characterization of microalgal and cyanobacterial exopolysaccharides.</a> Biotechnology Advances. 34 (7), 1159-1179 (2016).</li><li>Costa, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+systems+in+gram-negative+bacteria:+structural+and+mechanistic+insights.">Secretion systems in gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (6), 343-359 (2015).</li><li>Roier, S., Zingl, F. G., Cakar, F., Schild, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicle+biogenesis:+a+new+mechanism+and+its+implications.">Bacterial outer membrane vesicle biogenesis: a new mechanism and its implications.</a> Microbial Cell. 3 (6), 257-259 (2016).</li><li>Sergeyenko, T. V., Los, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+secreted+proteins+of+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+strain+PCC+6803.">Identification of secreted proteins of the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803.</a> FEMS Microbiology Letters. 193 (2), 213-216 (2000).</li><li>Oliveira, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatile+TolC-like+Slr1270+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">The versatile TolC-like Slr1270 in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Environmental Microbiology. 18 (2), 486-502 (2016).</li><li>Flores, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alternative+sigma+factor+SigF+is+a+key+player+in+the+control+of+secretion+mechanisms+in+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">The alternative sigma factor SigF is a key player in the control of secretion mechanisms in Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Environmental Microbiology. 21 (1), 343-359 (2018).</li><li>Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+method+for+determination+of+sugars+and+related+substances.">Colorimetric method for determination of sugars and related substances.</a> Analytical Chemistry. 28 (3), 350-356 (1956).</li><li>Parikh, A., Madamwar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+characterization+of+extracellular+polysaccharides+from+cyanobacteria.">Partial characterization of extracellular polysaccharides from cyanobacteria.</a> Bioresource Technology. 97 (15), 1822-1827 (2006).</li><li>R&#252;hmann, B., Schmid, J., Sieber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+identify+the+unexplored+diversity+of+microbial+exopolysaccharides.">Methods to identify the unexplored diversity of microbial exopolysaccharides.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 565 (2015).</li><li>Pathak, J., Rajneesh, R., Sonker, A. S., Kannaujiya, V. K., Sinha, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterial+extracellular+polysaccharide+sheath+pigment,+scytonemin:+A+novel+multipurpose+pharmacophore.">Cyanobacterial extracellular polysaccharide sheath pigment, scytonemin: A novel multipurpose pharmacophore.</a> Marine Glycobiology. , 343-358 (2016).</li><li>Nguyen, A. T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performances+of+different+protocols+for+exocellular+polysaccharides+extraction+from+milk+acid+gels:+Application+to+yogurt.">Performances of different protocols for exocellular polysaccharides extraction from milk acid gels: Application to yogurt.</a> Food Chemistry. 239, 742-750 (2018).</li><li>Jamshidian, H., Shojaosadati, S. A., Mousavi, S. M., Soudi, M. R., Vilaplana, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+of+recovery+procedures+on+structural+and+rheological+properties+of+schizophyllan+produced+from+date+syrup.">Implications of recovery procedures on structural and rheological properties of schizophyllan produced from date syrup.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 105, 36-44 (2017).</li><li>Couto, N., Schooling, S. R., Dutcher, J. R., Barber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+profiles+of+outer+membrane+vesicles+and+extracellular+matrix+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Proteome profiles of outer membrane vesicles and extracellular matrix of Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Journal of Proteome Research. 14 (10), 4207-4222 (2015).</li></ol>

For bedre at forstå bakterielle sekretions mekanismer og studere de frigivne produkter er det af yderste vigtighed at påvise effektiv isolation og analyse af de biomolekyler, der findes i det ekstracellulære bakterie miljø (f. eks. frigivet carbohydratpolymerer og proteiner).
Cyanobakteriale ekstracellulære kulhydratpolymerer er ekstremt komplekse, hovedsagelig på grund af antallet og andelen af forskellige monosaccharider, der udgør deres sammensætning1. De kon...

Cyanobakterier er bredt anerkendt som produktive kilder til naturlige produkter med lovende bioteknologiske/biomedicinske applikationer. Derfor er forståelse cyanobakteriale sekretions mekanismer og optimering af udvinding/nyttiggørelse metoder afgørende for at gennemføre cyanobakterier som effektive mikrobielle cellefabrikker.
Mange cyanobakteriale stammer er i stand til at producere ekstracellulære polymere stoffer (EPS), hovedsagelig dannet af heteropolysaccharider, der forbliver forbundet til cellens overflade eller frigives til mediet1. Disse frigivne kulhydratpolymerer har forskellige egenskaber sammenlignet med dem fra andre bakterier, som gør dem egnede til en bred vifte af anvendelser (f. eks. antivirale2, immunostimulatorisk3, antioxidant4, metal-chelating5, emulgerende6, og Drug levering agenter7,8). Metode til isolering af disse polymerer bidrager i høj grad ikke kun til bedre udbytte, men også til øget renhed og de specifikke fysiske egenskaber af polymer opnået9. Et stort flertal af disse metoder til isolering af polymerer er afhængige af udfældnings strategier fra det dyrkningsmedium, der let opnås på grund af polymerens stærke anioniske natur9,10. Desuden kan fjernelse af opløsningsmidler, der anvendes i udfældnings trinnet, hurtigt opnås ved fordampning og/eller lyofilisering. Afhængigt af den planlagte applikation kan forskellige trin kobles enten efter eller før polymer nedbør for at skræddersy det endelige produkt, som omfatter behandling af trichloreddikesyre (TCA), filtrering eller størrelses ekskluderings kromatografi (SEC) kolonne rensning10.
Cyanobakterier kan også udskille en lang række proteiner gennem veje, der er afhængige af membran transportører (klassisk)11 eller medieret af vesikler (ikke-klassisk)12. Derfor er analyse af cyanobakteriel exoproteom et vigtigt redskab, både til at forstå/manipulere cyanobakteriale protein sekretions mekanismer og forstå den specifikke ekstracellulære funktion af disse proteiner. Pålidelig isolation og analyse af exoproteomer kræver koncentrationen af det ekstracellulære miljø, da forekomsten af udskilte proteiner er relativt lav. Desuden kan andre fysiske eller kemiske trin (f. eks. centrifugering, filtrering eller protein fældning) optimere kvaliteten af det opnåede exoproteome, berige proteinindholdet13og undgå tilstedeværelsen af forurenende stoffer (f. eks. pigmenter, kulhydrater osv.) 14 , 15 eller over vægten af intracellulære proteiner i prøverne. Men nogle af disse trin kan også begrænse det sæt af proteiner, der kan påvises, hvilket fører til en partisk analyse.
Dette arbejde beskriver effektive protokoller for isolering af frigivne kulhydratpolymerer og exoproteomer fra cyanobakterier kultur medier. Disse protokoller kan let tilpasses undersøgelsens specifikke mål og brugernes behov, samtidig med at de grundlæggende trin, der præsenteres her, bevares.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1393px;" width="1392">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Dialysis membranes</td>
			<td style="width:191px;">Medicell Membranes Ltd&#160;</td>
			<td style="width:119px;">DTV.12000.07</td>
			<td style="width:777px;">Visking Tubing Size 7, Dia 23.8 mm, Width 39-41 mm 30m Roll&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Ethanol 96%</td>
			<td style="width:191px;">AGA - &#193;lcool e G&#233;neros Alimentares, S.A.</td>
			<td style="width:119px;">4.000.02.02.00</td>
			<td>Fermentation ethyl alcohol 96% AGA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">PES Filter 0.2 &#956;m</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific, Lda</td>
			<td style="width:119px;">15206869</td>
			<td>Syringe filter polystyrene 33MM 0.2&#181;M STR&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Amicon Ultra-15, Ultracel-3K</td>
			<td style="width:191px;">Merck Millipore Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">UFC900324</td>
			<td>Centrifugal filters with a nominal molecular weight cut-off of 3 kDa</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Thermo Scientific&#160;Pierce BCA Protein Assay</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific, Lda</td>
			<td style="width:119px;">10741395</td>
			<td>Green-to-blue, precise, detergent-compatible assay reagent to measure total protein concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Brillant Blue G Colloidal Concentrate&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Sigma Aldrich Qu&#237;mica SL</td>
			<td style="width:119px;">B2025-1EA</td>
			<td>Coomassie blue&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

looking outwards: isolation of cyanobacterial released carbohydrate polymers and proteins

Cyanobakterier kan aktivt udskilte en bred vifte af biomolekyler i det ekstracellulære miljø, såsom heteropolysaccharider og proteiner. Identifikationen og karakteriseringen af disse biomolekyler kan forbedre kendskabet til deres udskillelsesveje og medvirke til at manipulere dem. Desuden er nogle af disse biomolekyler også interessante med hensyn til bioteknologiske anvendelser. Beskrevet her er to protokoller for nem og hurtig isolering af cyanobakteriale frigivne kulhydratpolymerer og proteiner. Metoden til isolering af frigivne kulhydratpolymerer er baseret på konventionelle udfældnings teknikker af polysaccharider i vandige opløsninger med organiske opløsningsmidler. Denne metode bevarer polymerens egenskaber og undgår samtidig tilstedeværelsen af forurenende stoffer fra cellerester og kulturmedium. Ved afslutningen af processen er den frysetørrede polymer klar til at blive brugt eller karakteriseret eller kan underkastes yderligere oprensnings runder afhængigt af den endelige tilsigtede anvendelse. Med hensyn til isolationen af cyanobakterial exoproteom er teknikken baseret på koncentrationen af det celle frie medium efter fjernelse af de vigtigste forurenende stoffer ved centrifugering og filtration. Denne strategi giver mulighed for pålidelig isolering af proteiner, der når frem til det ekstracellulære miljø via membran transportører eller ydre membran vesikler. Disse proteiner kan efterfølgende identificeres ved hjælp af standard massespektrometri teknikker. De protokoller, der præsenteres her, kan anvendes ikke kun til en bred vifte af cyanobakterier, men også til andre bakteriestammer. Desuden, disse procedurer kan let skræddersys i henhold til den endelige anvendelse af de produkter, renhedsgrad kræves, og bakteriel stamme.

Figur 1afbilder en skematisk gengivelse af den beskrevne metode til udpakning af frigivne kulhydratpolymerer fra cyanobakteriale kulturer. Udfældede polymerer fra den moderate EPS-producent cyanobacterium Synechocystis Sp. pcc 6803 og den effektive EPS-producent cyanothece sp. CCY 0110 er vist i figur 2. I figur 3vises lyofiliserede polymerer med forskellige grader af kontaminering, som fremhæver betydningen af C...

Watch this Scientific Journal Video about Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins at JoVE.com

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

Ser udad: isolering af Cyanobakteriale frigivne kulhydratpolymerer og proteiner

Her beskrives protokoller for isolering af Cyanobakterielle frigivne kulhydratpolymerer og isolering af deres exoproteomer. Begge procedurer legemliggøre vigtige skridt til at opnå polymerer eller proteiner med høj renhed grader, der kan anvendes til yderligere analyse eller applikationer. De kan også nemt tilpasses efter specifikke brugerbehov.

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Disse protokoller, som vi udviklede, er vigtige for at studere sekretionsmekanismerne i cyanobakterier og deres frigivne produkter, nemlig de ekstracellulære kulhydratpolymerer og proteiner. Den genererede viden vil give os mulighed for at tilpasse disse produkter til flere applikationer, nemlig bioteknologiske og biomedicinske anvendelser. Disse protokoller er meget ligetil.De kan skræddersys efter den producerende organisme, brugerens behov og den endelige anvendelse af produktet. Den største fordel ved disse protokoller er, at de let kan tilpasses andre levende systemer, især til andre bakterier. Disse protokoller er nemme.Men, man kan være nødvendigt at indføre nogle ændringer afhængigt af den bakterielle stamme eller graden af renhed kræves. Til at begynde, dyrke cyanobakterielle stamme under standard betingelser. Mål vækst ved hjælp af standardprotokoller.Dernæst overføre kulturen i dialysemembraner, og dialyze mod mindst 10 mængder deioniseret vand i 24 timer med kontinuerlig omrøring. Centrifuge kulturen på 15, 000 gange g ved fire grader Celsius i 15 minutter. Overfør supernatanten til et nyt hætteglas, og kassér pellet.Centrifuge igen ved 20, 000 gange g ved fire grader Celsius i 15 minutter for at fjerne forurenende stoffer, såsom cellevæg vragrester eller lipopolysaccharider. Efter centrifugering, overføre supernatant til et glas bægerglas, og kassér pellet. For at udfælde polymeren, tilsæt to mængder 96% ethanol til supernatanten, og inkuber suspensionen ved fire grader Celsius natten over.For små eller ikke synlige mængder af udfældet polymer centrifuger suspensionen ved 13.000 gange g ved fire grader Celsius i 25 minutter. Kassér forsigtigt supernatanten og opsvar pellet i en til to milliliter autoklaveret deioniseret vand. Overfør den vandige suspension til et hætteglas.For synlige, store mængder af udfældet polymer, indsamle den udfældede polymer med sterile metal kraftforklang til et hætteglas. Klem polymeren, og kassér den overskydende ethanol. For at udføre lyophilization proces ellers kendt som frysetørring, holde hætteglas med den udfældede polymer på minus 80 grader Celsius natten over.Lyophilize polymeren i mindst 48 timer. Derefter opbevares den tørrede polymer i en ekssiccator ved stuetemperatur indtil videre brug. For at koncentrere mediet dyrkes først cyanobakterier under standardbetingelser.Monitorer cyanobakterievæksten ved hjælp af standardprocedurer. Derefter centrifuge kulturerne på 4, 000 gange g ved stuetemperatur i 10 minutter. Supernatanten overføres til en kolbe, og cellepellet kasseres.Derefter filtreres det dekanterede medie gennem et 0,2-mikron porestørrelsesfilter. For at koncentrere mediet ca. 500 gange anvendes centrifugalkoncentratorer med en nominel molekylvægt afskæring på tre kilodalton til centrifuge 4, 000 gange g og 15 grader Celsius i højst en time pr. centrifugeringsrunde. Efter centrifugering skylles væggene i filterenhedens prøvebeholder med den koncentrerede prøve, og indholdet overføres til et mikrocentrifugerør.Udfør et ekstra vasketrin i filterenhedens prøvebeholder med det autoklaverede kulturmedium for at sikre maksimal exoproteomegenvinding. Derefter opbevares exoproteome prøverne ved minus 20 grader Celsius indtil videre brug. Ethanolen skal tilsættes kraftigt for at optimere polymerfældning og udbytte.Efter centrifugering af den udfældede polymer skal supernatanten kasseres omhyggeligt for at undgå resuspension af pellet, der kan være løst fastgjort på kolbens væg. Hvis der udføres manuel filtrering, skal det være skånsomt at undgå at bryde filtermembranen. Nogle udfældede polymerer kan kun ses efter centrifugering, hovedsagelig på kolberenes vægge, såsom tilfældet med EPS fra Synechocystis.I andre tilfælde, såsom Cyanothece polymer, er det muligt at se polymerklumper flyder i glasbægeret lige efter nedbør. Nogle forureninger kan let detekteres makroskopisk efter polymerlyophilization, da de vil ændre polymer pigmentering, normalt hvid eller lysebrun. Orange polymerer er forurenet med carotenoider eller strukturer, der indeholder disse pigmenter.For eksempel er grønne polymerer forurenet med cellerester og klorofyl. Exoproteomer kan variere betydeligt afhængigt af bakteriestammen. Se for eksempel exoproteomen fra et encellet cyanobakterie og det fra en filamenterende stamme.Den store mængde polysaccharider i exoproteome-koncentrerede prøver kan hindre eksoproteomanalysen. For eksempel kan det forsinke protein separation og maskere mindre rigelige proteiner. Brugeren kan karakterisere polymeren med hensyn til sammensætning, fysiske / kemiske egenskaber, test polymer biologisk aktivitet, eller modificerede polymer komponenter.Til proteinidentifikation kan der udføres adskillelse af proteiner i gel og massespektrometri. Og for adskillelse af vesikler, ultracentrifugering af exoproteome bør udføres. I vores gruppe har disse protokoller allerede banet vejen for at optrævle cyanobakterielle sekretionsmekanismer eller anvendelser af de ekstracellulære kulhydratpolymerer på forskellige områder, såsom i bioremediering eller som antitumor eller lægemiddelleveringsmidler.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Biochemistry of the Cell

SCIENTISTS IN ACTION

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

High-throughput screening af Carbohydrate-nedbrydende enzymer ved hjælp Novel Uopløseligt kromogene substrat Assay Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Identifikation af Plant Ice-bindende Proteiner Gennem Vurdering af Ice-omkrystallisation inhibering og isolering ved hjælp af is-affinitet Oprensning

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

Isolering af Intermediate Filament Proteiner fra Multiple Musvæv til Studie Aging-associerede Post-translationelle Modifikationer

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biokemiske og strukturel karakterisering af kulhydrat Transport substrat-bindende-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

Analysere dynamisk proteinkomplekser samles på og frigivet fra Biolayer interferometri Biosensor ved hjælp af massespektrometri og elektronmikroskopi

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolering af Glomeruli og In Vivo mærkning af glomerulær celle overflade proteiner

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Fluorescerende sølv farvning af proteinerne i polyacrylamidgeler

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Interfacial Molecular-level Structures of Polymers and Biomacromolecules Revealed via Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy

Interfacial molekyl niveau strukturer af polymerer og Biomakromolecules afsløret via sum frekvens generation Vibrational spektroskopi

As a second-order nonlinear optical spectroscopy, sum frequency generation (SFG) vibrational spectroscopy has widely been used in investigating various ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Lokalisering af SUMO-modificerede proteiner ved hjælp af fluorescerende Sumo-diffuse Rings proteiner

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Preparation of High-Quality Fermented Fish Product

Tilberedning af fermenteret fiskeprodukt af høj kvalitet

This protocol provides a method for preparation of industrialized fermented fish product with sturgeon (Aquilaria sinensis) meat product. The procedures ...