Name: looking outwards: isolation of cyanobacterial released carbohydrate polymers and proteins
Uploaded: 2019-05-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) fondsen via het wedstrijd 2020-Operacional programma voor concurrentievermogen en internationalisering (POCI), Portugal 2020, en door Portugese fondsen via FCT-Fundação para a Ciência e een Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e ensino superieur in het kader van het project POCI-01-0145-FEDER-028779 en de Grant SFRH/BD/99715/2014 (CF).

1. cyanobacteriële vrijgekomen koolhydraat polymeer isolatie
<ol><li>
Polymeer isolatie en verwijdering van verontreinigingen
	<ol>
<li>Cultiveer de cyanobacteriële stam onder standaardomstandigheden [bv. 30 °C onder een licht van 12 uur (50 μE m− 2s− 1)/12 h donker regime, met orbitaal schudden bij 150 rpm]. Meet de groei met behulp van standaardprotocollen [bv. optische dichtheid bij 730 nm (OD730nm), chlorofyl a, drooggewicht, enz.], en meet vervolge...

<ol>
	<li>Pereira, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexity+of+cyanobacterial+exopolysaccharides:+composition,+structures,+inducing+factors+and+putative+genes+involved+in+their+biosynthesis+and+assembly.">Complexity of cyanobacterial exopolysaccharides: composition, structures, inducing factors and putative genes involved in their biosynthesis and assembly.</a> FEMS Microbiology Reviews. 33 (5), 917-941 (2009).</li><li>Kanekiyo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+an+Antiviral+Polysaccharide,+Nostoflan,+from+a+Terrestrial+Cyanobacterium,+Nostoc+flagelliforme.">Isolation of an Antiviral Polysaccharide, Nostoflan, from a Terrestrial Cyanobacterium, Nostoc flagelliforme.</a> Journal of Natural Products. 68 (7), 1037-1041 (2005).</li><li>L&#248;bner, M., Walsted, A., Larsen, R., Bendtzen, K., Nielsen, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+human+adaptive+immune+responses+by+administration+of+a+high-molecular-weight+polysaccharide+extract+from+the+cyanobacterium+Arthrospira+platensis.">Enhancement of human adaptive immune responses by administration of a high-molecular-weight polysaccharide extract from the cyanobacterium Arthrospira platensis.</a> Journal of Medicinal Food. 11 (2), 313-322 (2008).</li><li>Wang, H. B., Wu, S. J., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+polysaccharides+from+cyanobacteria+Nostoc+commune+and+their+antioxidant+activities.">Preparation of polysaccharides from cyanobacteria Nostoc commune and their antioxidant activities.</a> Carbohydrate Polymers. 99, 553-555 (2014).</li><li>Ozturk, S., Aslim, B., Suludere, Z., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+removal+of+cyanobacterial+exopolysaccharides+by+uronic+acid+content+and+monosaccharide+composition.">Metal removal of cyanobacterial exopolysaccharides by uronic acid content and monosaccharide composition.</a> Carbohydrate Polymers. 101, 265-271 (2014).</li><li>Han, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emulsifying,+flocculating,+and+physicochemical+properties+of+exopolysaccharide+produced+by+cyanobacterium+Nostoc+flagelliforme.">Emulsifying, flocculating, and physicochemical properties of exopolysaccharide produced by cyanobacterium Nostoc flagelliforme.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 172 (1), 36-49 (2014).</li><li>Leite, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterium&#8208;Derived+Extracellular+Carbohydrate+Polymer+for+the+Controlled+Delivery+of+Functional+Proteins.">Cyanobacterium&#8208;Derived Extracellular Carbohydrate Polymer for the Controlled Delivery of Functional Proteins.</a> Macromolecular Bioscience. 17 (2), 1600206 (2017).</li><li>Estevinho, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+cyanobacterial+extracellular+polymeric+substance+in+the+microencapsulation+of+vitamin+B12.">Application of a cyanobacterial extracellular polymeric substance in the microencapsulation of vitamin B12.</a> Powder Technology. 343, 644-651 (2019).</li><li>Klock, J. H., Wieland, A., Seifert, R., Michaelis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+polymeric+substances+(EPS)+from+cyanobacterial+mats:+characterisation+and+isolation+method+optimisation.">Extracellular polymeric substances (EPS) from cyanobacterial mats: characterisation and isolation method optimisation.</a> Marine Biology. 152 (5), 1077-1085 (2007).</li><li>Delattre, C., Pierre, G., Laroche, C., Michaud, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+extraction+and+characterization+of+microalgal+and+cyanobacterial+exopolysaccharides.">Production, extraction and characterization of microalgal and cyanobacterial exopolysaccharides.</a> Biotechnology Advances. 34 (7), 1159-1179 (2016).</li><li>Costa, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+systems+in+gram-negative+bacteria:+structural+and+mechanistic+insights.">Secretion systems in gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (6), 343-359 (2015).</li><li>Roier, S., Zingl, F. G., Cakar, F., Schild, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicle+biogenesis:+a+new+mechanism+and+its+implications.">Bacterial outer membrane vesicle biogenesis: a new mechanism and its implications.</a> Microbial Cell. 3 (6), 257-259 (2016).</li><li>Sergeyenko, T. V., Los, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+secreted+proteins+of+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+strain+PCC+6803.">Identification of secreted proteins of the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803.</a> FEMS Microbiology Letters. 193 (2), 213-216 (2000).</li><li>Oliveira, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatile+TolC-like+Slr1270+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">The versatile TolC-like Slr1270 in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Environmental Microbiology. 18 (2), 486-502 (2016).</li><li>Flores, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alternative+sigma+factor+SigF+is+a+key+player+in+the+control+of+secretion+mechanisms+in+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">The alternative sigma factor SigF is a key player in the control of secretion mechanisms in Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Environmental Microbiology. 21 (1), 343-359 (2018).</li><li>Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+method+for+determination+of+sugars+and+related+substances.">Colorimetric method for determination of sugars and related substances.</a> Analytical Chemistry. 28 (3), 350-356 (1956).</li><li>Parikh, A., Madamwar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+characterization+of+extracellular+polysaccharides+from+cyanobacteria.">Partial characterization of extracellular polysaccharides from cyanobacteria.</a> Bioresource Technology. 97 (15), 1822-1827 (2006).</li><li>R&#252;hmann, B., Schmid, J., Sieber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+identify+the+unexplored+diversity+of+microbial+exopolysaccharides.">Methods to identify the unexplored diversity of microbial exopolysaccharides.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 565 (2015).</li><li>Pathak, J., Rajneesh, R., Sonker, A. S., Kannaujiya, V. K., Sinha, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterial+extracellular+polysaccharide+sheath+pigment,+scytonemin:+A+novel+multipurpose+pharmacophore.">Cyanobacterial extracellular polysaccharide sheath pigment, scytonemin: A novel multipurpose pharmacophore.</a> Marine Glycobiology. , 343-358 (2016).</li><li>Nguyen, A. T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performances+of+different+protocols+for+exocellular+polysaccharides+extraction+from+milk+acid+gels:+Application+to+yogurt.">Performances of different protocols for exocellular polysaccharides extraction from milk acid gels: Application to yogurt.</a> Food Chemistry. 239, 742-750 (2018).</li><li>Jamshidian, H., Shojaosadati, S. A., Mousavi, S. M., Soudi, M. R., Vilaplana, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+of+recovery+procedures+on+structural+and+rheological+properties+of+schizophyllan+produced+from+date+syrup.">Implications of recovery procedures on structural and rheological properties of schizophyllan produced from date syrup.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 105, 36-44 (2017).</li><li>Couto, N., Schooling, S. R., Dutcher, J. R., Barber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+profiles+of+outer+membrane+vesicles+and+extracellular+matrix+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Proteome profiles of outer membrane vesicles and extracellular matrix of Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Journal of Proteome Research. 14 (10), 4207-4222 (2015).</li></ol>

Om de bacteriële secretie mechanismen beter te begrijpen en de vrijgegeven producten te bestuderen, is het van extreem belang om de efficiënte isolatie en analyse van de in de extracellulaire bacteriële omgeving aanwezige biomoleules te demonstreren (zoals vrijgegeven koolhydraatpolymeren en eiwitten).
Cyanobacteriële extracellulaire koolhydraatpolymeren zijn uiterst complex, voornamelijk als gevolg van het aantal en de proportie van verschillende monosacchariden die samenstelling<sup clas...

Cyanobacteriën worden alom erkend als productieve bronnen van natuurlijke producten met veelbelovende biotechnologische/biomedische toepassingen. Daarom zijn het begrijpen van cyanobacteriële secretie mechanismen en optimalisatie van de extractie/herstelmethoden essentieel om cyanobacteriën te implementeren als efficiënte microbiële celfabrieken.
Veel cyanobacteriële stammen zijn in staat om extracellulaire polymere stoffen (EPS) te produceren, voornamelijk gevormd door heteropolysacchariden, die verbonden blijven met het celoppervlak of vrijkomen in het medium1. Deze vrijgegeven koolhydraatpolymeren hebben verschillende kenmerken in vergelijking met die van andere bacteriën, die ze geschikt maken voor een breed scala aan toepassingen (bijv. antivirale middelen2, immunostimulerende3, antioxidant4, metaal-chelating5, emulgerende6, en drug delivery agenten7,8). Methodologie voor de isolatie van deze polymeren draagt niet alleen bij tot een betere opbrengst, maar ook tot meer zuiverheid en de specifieke fysische eigenschappen van het verkregen polymeer9. Een overgrote meerderheid van deze methoden voor isolatie van de polymeren is afhankelijk van neerslag strategieën uit het cultuurmedium die gemakkelijk kunnen worden bereikt door de sterke anionische natuur van het polymeer9,10. Bovendien kan het verwijderen van de oplosmiddelen die in de precipitatie stap worden gebruikt, snel worden bereikt door verdamping en/of lyofilisatie. Afhankelijk van de voorziene toepassing, kunnen verschillende stappen worden gekoppeld, hetzij na of vóór polymeer precipitatie om het eindproduct af te stemmen, waaronder Trichloorazijnzuur (TCA) behandeling, filtratie of grootte uitsluitings chromatografie (SEC) kolom zuivering10.
Cyanobacteriën kunnen ook een breed scala aan eiwitten afscheiden door middel van trajecten die afhankelijk zijn van membraan transporteurs (klassiek)11 of gemedieerd door blaasjes (niet-klassiek)12. Daarom vormt de analyse van het cyanobacteriële exoproteome een essentieel hulpmiddel om de cyanobacteriële eiwit secretie mechanismen te begrijpen/manipuleren en de specifieke extracellulaire functie van deze eiwitten te begrijpen. Betrouwbare isolatie en analyse van exoproteomes vereisen de concentratie van de extracellulaire milieu, omdat de overvloed van uitgescheiden eiwitten relatief laag is. Daarnaast kunnen andere fysische of chemische stappen (bijv. centrifugeren, filtratie of eiwit precipitatie) de kwaliteit van het verkregen exoproteome optimaliseren, het eiwitgehalte13verrijken en de aanwezigheid van verontreinigingen vermijden (bijv. pigmenten, koolhydraten, enz.) 14 , 15 of het overwicht van intracellulaire eiwitten in de monsters. Echter, sommige van deze stappen kunnen ook beperken de set van eiwitten die kunnen worden gedetecteerd, leidt tot een bevooroordeelde analyse.
Dit werk beschrijft efficiënte protocollen voor de isolatie van vrijgekomen koolhydraatpolymeren en exoproteomes van cyanobacteriën culture media. Deze protocollen kunnen eenvoudig worden aangepast aan de specifieke doelstellingen van de studie en de behoeften van de gebruiker, met behoud van de basisstappen die hier worden gepresenteerd.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1393px;" width="1392">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Dialysis membranes</td>
			<td style="width:191px;">Medicell Membranes Ltd&#160;</td>
			<td style="width:119px;">DTV.12000.07</td>
			<td style="width:777px;">Visking Tubing Size 7, Dia 23.8 mm, Width 39-41 mm 30m Roll&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Ethanol 96%</td>
			<td style="width:191px;">AGA - &#193;lcool e G&#233;neros Alimentares, S.A.</td>
			<td style="width:119px;">4.000.02.02.00</td>
			<td>Fermentation ethyl alcohol 96% AGA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">PES Filter 0.2 &#956;m</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific, Lda</td>
			<td style="width:119px;">15206869</td>
			<td>Syringe filter polystyrene 33MM 0.2&#181;M STR&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Amicon Ultra-15, Ultracel-3K</td>
			<td style="width:191px;">Merck Millipore Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">UFC900324</td>
			<td>Centrifugal filters with a nominal molecular weight cut-off of 3 kDa</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Thermo Scientific&#160;Pierce BCA Protein Assay</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific, Lda</td>
			<td style="width:119px;">10741395</td>
			<td>Green-to-blue, precise, detergent-compatible assay reagent to measure total protein concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Brillant Blue G Colloidal Concentrate&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Sigma Aldrich Qu&#237;mica SL</td>
			<td style="width:119px;">B2025-1EA</td>
			<td>Coomassie blue&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

looking outwards: isolation of cyanobacterial released carbohydrate polymers and proteins

Cyanobacteriën kunnen een breed scala van biomoleules actief afscheiden in de extracellulaire omgeving, zoals heteropolysacchariden en eiwitten. De identificatie en karakterisering van deze biomoleules kan de kennis over hun secretie trajecten verbeteren en helpen om ze te manipuleren. Bovendien zijn sommige van deze biomoleules ook interessant in termen van biotechnologische toepassingen. Hier beschreven zijn twee protocollen voor eenvoudige en snelle isolatie van cyanobacteriële vrijgekomen koolhydraatpolymeren en eiwitten. De methode voor isolatie van vrijgekomen koolhydraatpolymeren is gebaseerd op conventionele precipitatie technieken van polysacchariden in waterige oplossingen met behulp van organische oplosmiddelen. Deze methode behoudt de eigenschappen van het polymeer en vermijdt tegelijkertijd de aanwezigheid van verontreinigingen uit celvuil en kweekmedium. Aan het einde van het proces is het gelyofiliseerd polymeer klaar om te worden gebruikt of gekarakteriseerd of kan het worden onderworpen aan verdere zuiverings rondes, afhankelijk van het uiteindelijke beoogde gebruik. Met betrekking tot de isolatie van het cyanobacteriële exoproteome, is de techniek gebaseerd op de concentratie van het cel vrije medium na verwijdering van de grote verontreinigingen door centrifugeren en filtratie. Deze strategie zorgt voor een betrouwbare isolatie van eiwitten die de extracellulaire milieu bereiken via membraan transporteurs of buitenste membraan blaasjes. Deze eiwitten kunnen vervolgens worden geïdentificeerd met behulp van standaard massaspectrometrie technieken. De hier gepresenteerde protocollen kunnen niet alleen worden toegepast op een breed scala aan cyanobacteriën, maar ook op andere bacteriële stammen. Bovendien kunnen deze procedures eenvoudig worden aangepast aan het uiteindelijke gebruik van de producten, de vereiste zuiverheid en de bacteriestam.

Een schematische weergave van de methode die wordt beschreven om vrijgekomen koolhydraatpolymeren uit cyanobacteriële culturen te halen, wordt afgebeeld in Figuur 1. Geprecipiteerde polymeren van de gematigde EPS-producent cyanobacterium Synechocystis SP. pcc 6803 en de efficiënte EPS-producent cyanothece sp. ccy 0110 worden weergegeven in Figuur 2. In Figuur 3worden gelyofiliseerde polymeren met verschillende ma...

Watch this Scientific Journal Video about Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins at JoVE.com

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

Naar buiten kijken: isolatie van Cyanobacteriële vrijgekomen Koolhydraatpolymeren en eiwitten

Hier worden protocollen voor de isolatie van cyanobacteriële vrijkomende koolhydraatpolymeren en isolatie van hun exoproteomes beschreven. Beide procedures belichamen belangrijke stappen voor het verkrijgen van polymeren of eiwitten met hoge zuiverheids graden die kunnen worden gebruikt voor verdere analyse of toepassingen. Ze kunnen ook eenvoudig worden aangepast aan de specifieke behoeften van de gebruiker.

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Deze protocollen die we ontwikkelden zijn belangrijk om de afscheidingsmechanismen in cyanobacteriën en hun vrijgekomen producten te bestuderen, namelijk de extracellulaire koolhydraatpolymeren en eiwitten. De geproduceerde kennis stelt ons in staat om deze producten aan te passen voor verschillende toepassingen, namelijk biotechnologische en biomedische toepassingen. Deze protocollen zijn zeer eenvoudig.Ze kunnen worden afgestemd op het producerende organisme, de behoeften van de gebruiker en de uiteindelijke toepassing van het product. Het belangrijkste voordeel van deze protocollen is dat ze gemakkelijk kunnen worden aangepast aan andere levende systemen, met name aan andere bacteriën. Deze protocollen zijn eenvoudig.Echter, men kan nodig zijn om een aantal veranderingen in te voeren, afhankelijk van de bacteriële stam of de mate van zuiverheid vereist. Om te beginnen cultiveren de cyanobacteriële stam onder standaard omstandigheden. Groei meten met behulp van standaardprotocollen.Breng vervolgens de cultuur over in dialysemembranen en dialyseren tegen een minimum van 10 volumes gedeïïmiseerd water gedurende 24 uur met continu roeren. Centrifuge de cultuur op 15.000 keer g bij vier graden Celsius gedurende 15 minuten. Breng de supernatant naar een nieuwe flacon, en gooi de pellet.Centrifuge opnieuw op 20.000 keer g bij vier graden Celsius gedurende 15 minuten om verontreinigingen te verwijderen, zoals celwandpuin of lipopolysacchariden. Na de centrifugatie, breng de supernatant naar een glazen beker, en gooi de pellet. Om het polymeer te neerslaan, voeg twee volumes van 96% ethanol toe aan de supernatant en broed de suspensie 's nachts bij vier graden Celsius uit.Voor kleine of niet zichtbare hoeveelheden neergeslagen polymeer, centrifugeren de suspensie op 13.000 keer g bij vier graden Celsius gedurende 25 minuten. Gooi voorzichtig de supernatant, en resuspend de pellet in een tot twee milliliter van autoclaved gedeïnseerd water. Breng de waterige schorsing over naar een flacon.Voor zichtbare, grote hoeveelheden neergeslagen polymeer, verzamel het neergeslagen polymeer met steriele metalen tangen op een flacon. Knijp in het polymeer en gooi de overtollige ethanol weg. Om het lyophilisatieproces uit te voeren dat ook wel bekend staat als vriesdrogen, houdt u de flesjes met het neergeslagen polymeer 's nachts op min 80 graden Celsius.Lyophilize het polymeer voor ten minste 48 uur. Bewaar het gedroogde polymeer vervolgens in een desiccator bij kamertemperatuur tot verder gebruik. Om het medium te concentreren, moet u eerst cyanobacteriën kweken onder standaardomstandigheden.Controleer de groei van cyanobacterium met behulp van standaardprocedures. Dan, centrifuge de culturen op 4,000 keer g bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Breng de supernatant naar een kolf en gooi de celkorrel weg.Vervolgens filtert u het gedecanteerde medium door een filter van 0,2 micron poriegrootte. Om het medium ongeveer 500 keer te concentreren, gebruikt u centrifugale concentrators met een nominaal moleculair gewichtssnede van drie kilodaltons om 4, 000 keer g en 15 graden Celsius te centrifugeren voor een maximum van een uur per percentrifugatieronde. Na centrifugatie, spoel de wanden van het monsterreservoir van het filterapparaat met het geconcentreerde monster en breng het de inhoud over naar een microcentrifugebuis.Voer een extra wasstap uit van het monsterreservoir van het filterapparaat met het automatisch cullaved kweekmedium om een maximaal onteigeningsherstel te garanderen. Bewaar vervolgens de exoproteoommonsters bij min 20 graden Celsius tot verder gebruik. De ethanol moet krachtig worden toegevoegd om het polymeer neerslag en opbrengst te optimaliseren.Na het centrifugeren van het neergeslagen polymeer moet het weggooien van het supernatant zorgvuldig worden gemaakt om resuspensie van de pellet te voorkomen die losjes op de kolfwand kan worden bevestigd. Als handmatige filtratie wordt uitgevoerd, moet het zacht zijn om te voorkomen dat het filtermembraan wordt gebroken. Sommige neergeslagen polymeren kunnen alleen zichtbaar zijn na centrifugatie, voornamelijk op de wanden van de kolven, zoals het geval van EPS van Synechocystis.In andere gevallen, zoals Cyanothece polymeer, is het mogelijk om de polymeerklonten te zien drijven in het glazen bekerglas net na neerslag. Sommige verontreinigingen kunnen macroscopisch na polymeerlyophilization gemakkelijk worden ontdekt aangezien zij polymeerpigmentatie, gewoonlijk wit of lichtbruin zullen veranderen. Oranje polymeren zijn besmet met carotenoïden of structuren die deze pigmenten bevatten.Groene polymeren zijn bijvoorbeeld verontreinigd met celafval en chlorofyl. Exoproteomen kunnen aanzienlijk variëren, afhankelijk van de bacteriestam. Zie bijvoorbeeld het exoproteoom van een eencellig cyanobacterium en een van een filamenteuze stam.De hoge hoeveelheid polysaccharides in exoproteome-geconcentreerde monsters kan de analyse van het onteproteoom belemmeren. Het kan bijvoorbeeld de eiwitscheiding vertragen en minder overvloedige eiwitten maskeren. De gebruiker kan het polymeer karakteriseren in termen van samenstelling, fysische /chemische eigenschappen, testpolymeer biologische activiteit, of gemodificeerde polymeer componenten.Voor eiwitidentificatie kan scheiding van eiwitten in gel en massaspectrometrie worden uitgevoerd. En voor de scheiding van vesicles moet ultracentrifugatie van het onteigendmiddel worden uitgevoerd. In onze groep hebben deze protocollen al de weg vrijgemaakt om cyanobacteriële afscheidingsmechanismen of toepassingen van de extracellulaire koolhydraatpolymeren op verschillende gebieden te ontrafelen, zoals in bioremediatie of als antitumor of drugbezorgers.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Biochemistry of the Cell

SCIENTISTS IN ACTION

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

High-throughput screening van Carbohydrate-afbrekende enzymen via innovatieve Onoplosbare chromogeen substraat Assay Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Identificatie van Plant Ice-bindende eiwitten Through Beoordeling van Ice-herkristallisatie inhibitie en isolatie met behulp van Ice-affiniteitszuivering

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

Isolatie van intermediaire filamentproteïnen uit meerdere muisweefsels om te bestuderen veroudering-geassocieerde post-translationele modificaties

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biochemische en structurele karakterisatie van de koolhydraten vervoer substraat-bindend-proteïne SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

Analyseren van de dynamische eiwitcomplexen op gemonteerd en vrijgelaten uit Biolayer interferometrie Biosensor met behulp van spectrometrie van de massa en elektronenmicroscopie

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolatie van de Glomeruli en In Vivo Labeling van glomerulaire cel oppervlakte-eiwitten

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Fluorescerende zilveren kleuring van eiwitten in Polyacrylamide Gels

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Interfacial Molecular-level Structures of Polymers and Biomacromolecules Revealed via Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy

Interfaciale moleculaire-niveau structuren van polymeren en biomacromoleculen onthuld via Sum frequentie generatie Vibrationele spectroscopie

As a second-order nonlinear optical spectroscopy, sum frequency generation (SFG) vibrational spectroscopy has widely been used in investigating various ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Lokalisatie van SUMO-gemodificeerde eiwitten met behulp van fluorescerende Sumo-trapping eiwitten

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Preparation of High-Quality Fermented Fish Product

Bereiding van kwalitatief hoogwaardig gefermenteerd visproduct

This protocol provides a method for preparation of industrialized fermented fish product with sturgeon (Aquilaria sinensis) meat product. The procedures ...