Name: looking outwards: isolation of cyanobacterial released carbohydrate polymers and proteins
Uploaded: 2019-05-27T13:00:00
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Ces travaux ont été financés par les fonds fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) par le biais du PROGRAMME competecional pour la compétitivité et l'internationalisation (POCI), Portugal 2020, et par des fonds portugais par l'intermédiaire de la FCT - Fundaço para a Ciência e a Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior dans le cadre du projet POCI-01-0145-FEDER-028779 et de la subvention SFRH/BD/99715/2014 (CF).

1. Isolement de polymère de hydrate de carbone libéré de cyanobactérien
<ol><li>
Isolement des polymères et élimination des contaminants
	<ol>
<li>Cultiver la souche cyanobactérienne dans des conditions standard [p. ex., 30 oC sous une lumière de 12 h (50 e m2s1)/12 h de régime foncé, avec une secousse orbitale à 150 tr/min]. Mesurer la croissance à l'aide de protocoles standard [p. ex., densité optique à 730 nm (OD730nm),chlorophylle a, poids sec...

<ol>
	<li>Pereira, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexity+of+cyanobacterial+exopolysaccharides:+composition,+structures,+inducing+factors+and+putative+genes+involved+in+their+biosynthesis+and+assembly.">Complexity of cyanobacterial exopolysaccharides: composition, structures, inducing factors and putative genes involved in their biosynthesis and assembly.</a> FEMS Microbiology Reviews. 33 (5), 917-941 (2009).</li><li>Kanekiyo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+an+Antiviral+Polysaccharide,+Nostoflan,+from+a+Terrestrial+Cyanobacterium,+Nostoc+flagelliforme.">Isolation of an Antiviral Polysaccharide, Nostoflan, from a Terrestrial Cyanobacterium, Nostoc flagelliforme.</a> Journal of Natural Products. 68 (7), 1037-1041 (2005).</li><li>L&#248;bner, M., Walsted, A., Larsen, R., Bendtzen, K., Nielsen, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+human+adaptive+immune+responses+by+administration+of+a+high-molecular-weight+polysaccharide+extract+from+the+cyanobacterium+Arthrospira+platensis.">Enhancement of human adaptive immune responses by administration of a high-molecular-weight polysaccharide extract from the cyanobacterium Arthrospira platensis.</a> Journal of Medicinal Food. 11 (2), 313-322 (2008).</li><li>Wang, H. B., Wu, S. J., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+polysaccharides+from+cyanobacteria+Nostoc+commune+and+their+antioxidant+activities.">Preparation of polysaccharides from cyanobacteria Nostoc commune and their antioxidant activities.</a> Carbohydrate Polymers. 99, 553-555 (2014).</li><li>Ozturk, S., Aslim, B., Suludere, Z., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+removal+of+cyanobacterial+exopolysaccharides+by+uronic+acid+content+and+monosaccharide+composition.">Metal removal of cyanobacterial exopolysaccharides by uronic acid content and monosaccharide composition.</a> Carbohydrate Polymers. 101, 265-271 (2014).</li><li>Han, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emulsifying,+flocculating,+and+physicochemical+properties+of+exopolysaccharide+produced+by+cyanobacterium+Nostoc+flagelliforme.">Emulsifying, flocculating, and physicochemical properties of exopolysaccharide produced by cyanobacterium Nostoc flagelliforme.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 172 (1), 36-49 (2014).</li><li>Leite, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterium&#8208;Derived+Extracellular+Carbohydrate+Polymer+for+the+Controlled+Delivery+of+Functional+Proteins.">Cyanobacterium&#8208;Derived Extracellular Carbohydrate Polymer for the Controlled Delivery of Functional Proteins.</a> Macromolecular Bioscience. 17 (2), 1600206 (2017).</li><li>Estevinho, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+cyanobacterial+extracellular+polymeric+substance+in+the+microencapsulation+of+vitamin+B12.">Application of a cyanobacterial extracellular polymeric substance in the microencapsulation of vitamin B12.</a> Powder Technology. 343, 644-651 (2019).</li><li>Klock, J. H., Wieland, A., Seifert, R., Michaelis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+polymeric+substances+(EPS)+from+cyanobacterial+mats:+characterisation+and+isolation+method+optimisation.">Extracellular polymeric substances (EPS) from cyanobacterial mats: characterisation and isolation method optimisation.</a> Marine Biology. 152 (5), 1077-1085 (2007).</li><li>Delattre, C., Pierre, G., Laroche, C., Michaud, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+extraction+and+characterization+of+microalgal+and+cyanobacterial+exopolysaccharides.">Production, extraction and characterization of microalgal and cyanobacterial exopolysaccharides.</a> Biotechnology Advances. 34 (7), 1159-1179 (2016).</li><li>Costa, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+systems+in+gram-negative+bacteria:+structural+and+mechanistic+insights.">Secretion systems in gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (6), 343-359 (2015).</li><li>Roier, S., Zingl, F. G., Cakar, F., Schild, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicle+biogenesis:+a+new+mechanism+and+its+implications.">Bacterial outer membrane vesicle biogenesis: a new mechanism and its implications.</a> Microbial Cell. 3 (6), 257-259 (2016).</li><li>Sergeyenko, T. V., Los, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+secreted+proteins+of+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+strain+PCC+6803.">Identification of secreted proteins of the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803.</a> FEMS Microbiology Letters. 193 (2), 213-216 (2000).</li><li>Oliveira, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatile+TolC-like+Slr1270+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">The versatile TolC-like Slr1270 in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Environmental Microbiology. 18 (2), 486-502 (2016).</li><li>Flores, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alternative+sigma+factor+SigF+is+a+key+player+in+the+control+of+secretion+mechanisms+in+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">The alternative sigma factor SigF is a key player in the control of secretion mechanisms in Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Environmental Microbiology. 21 (1), 343-359 (2018).</li><li>Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+method+for+determination+of+sugars+and+related+substances.">Colorimetric method for determination of sugars and related substances.</a> Analytical Chemistry. 28 (3), 350-356 (1956).</li><li>Parikh, A., Madamwar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+characterization+of+extracellular+polysaccharides+from+cyanobacteria.">Partial characterization of extracellular polysaccharides from cyanobacteria.</a> Bioresource Technology. 97 (15), 1822-1827 (2006).</li><li>R&#252;hmann, B., Schmid, J., Sieber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+identify+the+unexplored+diversity+of+microbial+exopolysaccharides.">Methods to identify the unexplored diversity of microbial exopolysaccharides.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 565 (2015).</li><li>Pathak, J., Rajneesh, R., Sonker, A. S., Kannaujiya, V. K., Sinha, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterial+extracellular+polysaccharide+sheath+pigment,+scytonemin:+A+novel+multipurpose+pharmacophore.">Cyanobacterial extracellular polysaccharide sheath pigment, scytonemin: A novel multipurpose pharmacophore.</a> Marine Glycobiology. , 343-358 (2016).</li><li>Nguyen, A. T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performances+of+different+protocols+for+exocellular+polysaccharides+extraction+from+milk+acid+gels:+Application+to+yogurt.">Performances of different protocols for exocellular polysaccharides extraction from milk acid gels: Application to yogurt.</a> Food Chemistry. 239, 742-750 (2018).</li><li>Jamshidian, H., Shojaosadati, S. A., Mousavi, S. M., Soudi, M. R., Vilaplana, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+of+recovery+procedures+on+structural+and+rheological+properties+of+schizophyllan+produced+from+date+syrup.">Implications of recovery procedures on structural and rheological properties of schizophyllan produced from date syrup.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 105, 36-44 (2017).</li><li>Couto, N., Schooling, S. R., Dutcher, J. R., Barber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+profiles+of+outer+membrane+vesicles+and+extracellular+matrix+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Proteome profiles of outer membrane vesicles and extracellular matrix of Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Journal of Proteome Research. 14 (10), 4207-4222 (2015).</li></ol>

Pour mieux comprendre les mécanismes de sécrétion bactérienne et étudier les produits libérés, il est d'une extrême importance de démontrer l'isolement efficace et l'analyse des biomolécules présentes dans l'environnement bactérien extracellulaire (tels que libérés polymères et protéines).
Les polymères de glucides extracellulaires cyanobactériens sont extrêmement complexes, principalement en raison du nombre et de la proportion de différents monosaccharides qui constituent...

Les cyanobactéries sont largement reconnues comme des sources prolifiques de produits naturels avec des applications biotechnologiques/biomédicales prometteuses. Par conséquent, la compréhension des mécanismes de sécrétion cyanobactérienne et l'optimisation des méthodes d'extraction/récupération sont essentielles pour mettre en œuvre des cyanobactéries en tant qu'usines efficaces de cellules microbiennes.
De nombreuses souches cyanobactériennes sont capables de produire des substances polymères extracellulaires (EPS), principalement formées par des hétéropolysaccharides, qui restent associées à la surface cellulaire ou sont libérées dans le milieu1. Ces polymères de glucides libérés ont des caractéristiques distinctes par rapport à ceux d'autres bactéries, qui les rendent appropriés pour un large éventail d'applications (par exemple, les antiviraux2, immunostimulatoire3, antioxydant4, métal-chéating5, émulsionnant6, et les agents de livraison de médicaments7,8). La méthodologie pour l'isolement de ces polymères contribue en grande partie non seulement à l'amélioration du rendement, mais aussi à l'augmentation de la pureté et les propriétés physiques spécifiques du polymère obtenu9. Une grande majorité de ces méthodes d'isolement des polymères s'appuient sur des stratégies de précipitation du milieu de culture qui sont facilement réalisées en raison de la forte nature anionique du polymère9,10. En outre, l'élimination des solvants utilisés dans l'étape de précipitation peut être rapidement réalisée par évaporation et/ou lyophilisation. Selon l'application prévue, différentes étapes peuvent être couplées après ou avant la précipitation de polymère afin d'adapter le produit final, qui incluent le traitement d'acide trichloroacétique (TCA), la filtration, ou la chromatographie d'exclusion de taille (SEC) la purification de colonne10.
Les cyanobactéries sont également capables de sécrétiser un large éventail de protéines à travers des voies dépendantes des transporteurs membranaires (classiques)11 ou médiées par des vésicules (non classiques)12. Par conséquent, l'analyse de l'exoprotéome cyanobactérien constitue un outil essentiel, à la fois pour comprendre / manipuler les mécanismes de sécrétion de protéines cyanobactériennes et de comprendre la fonction extracellulaire spécifique de ces protéines. L'isolement et l'analyse fiables des exoprotéméomes exigent la concentration du milieu extracellulaire, puisque l'abondance des protéines sécrétées est relativement faible. En outre, d'autres étapes physiques ou chimiques (p. ex. centrifugation, filtration ou précipitation sinique) peuvent optimiser la qualité de l'exoprotémome obtenu, enrichir la teneur en protéines13et éviter la présence de contaminants (p. ex., pigments, glucides, etc. ) 14 (en) , 15 ou la prédominance des protéines intracellulaires dans les échantillons. Cependant, certaines de ces étapes peuvent également restreindre l'ensemble de protéines qui peuvent être détectées, conduisant à une analyse biaisée.
Ce travail décrit des protocoles efficaces pour l'isolement des polymères et exoprotéomes de glucides libérés des médias de culture de cyanobactéries. Ces protocoles peuvent être facilement adaptés aux objectifs spécifiques de l'étude et aux besoins des utilisateurs, tout en maintenant les étapes de base présentées ici.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1393px;" width="1392">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Dialysis membranes</td>
			<td style="width:191px;">Medicell Membranes Ltd&#160;</td>
			<td style="width:119px;">DTV.12000.07</td>
			<td style="width:777px;">Visking Tubing Size 7, Dia 23.8 mm, Width 39-41 mm 30m Roll&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Ethanol 96%</td>
			<td style="width:191px;">AGA - &#193;lcool e G&#233;neros Alimentares, S.A.</td>
			<td style="width:119px;">4.000.02.02.00</td>
			<td>Fermentation ethyl alcohol 96% AGA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">PES Filter 0.2 &#956;m</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific, Lda</td>
			<td style="width:119px;">15206869</td>
			<td>Syringe filter polystyrene 33MM 0.2&#181;M STR&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Amicon Ultra-15, Ultracel-3K</td>
			<td style="width:191px;">Merck Millipore Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">UFC900324</td>
			<td>Centrifugal filters with a nominal molecular weight cut-off of 3 kDa</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Thermo Scientific&#160;Pierce BCA Protein Assay</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific, Lda</td>
			<td style="width:119px;">10741395</td>
			<td>Green-to-blue, precise, detergent-compatible assay reagent to measure total protein concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Brillant Blue G Colloidal Concentrate&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Sigma Aldrich Qu&#237;mica SL</td>
			<td style="width:119px;">B2025-1EA</td>
			<td>Coomassie blue&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

looking outwards: isolation of cyanobacterial released carbohydrate polymers and proteins

Les cyanobactéries peuvent sécréter activement un large éventail de biomolécules dans l'environnement extracellulaire, comme les hétéropolysaccharides et les protéines. L'identification et la caractérisation de ces biomolécules peuvent améliorer les connaissances sur leurs voies de sécrétion et aider à les manipuler. En outre, certaines de ces biomolécules sont également intéressantes en termes d'applications biotechnologiques. Décrit ici sont deux protocoles pour l'isolement facile et rapide des polymères et des protéines de hydrate de carbone libérés de cyanobacterial. La méthode d'isolement des polymères de glucides libérés est basée sur les techniques conventionnelles de précipitation des polysaccharides dans des solutions aqueuses utilisant des solvants organiques. Cette méthode préserve les caractéristiques du polymère et évite simultanément la présence de contaminants provenant des débris cellulaires et du milieu de culture. À la fin du processus, le polymère lyophilisé est prêt à être utilisé ou caractérisé ou peut être soumis à d'autres tours de purification, selon l'utilisation finale prévue. En ce qui concerne l'isolement de l'exoprotéome cyanobactérien, la technique est basée sur la concentration du milieu sans cellules après l'élimination des principaux contaminants par centrifugation et filtration. Cette stratégie permet un isolement fiable des protéines qui atteignent le milieu extracellulaire par l'intermédiaire de transporteurs membranaires ou de vésicules de membrane externe. Ces protéines peuvent être identifiées par la suite à l'aide de techniques standard de spectrométrie de masse. Les protocoles présentés ici peuvent être appliqués non seulement à un large éventail de cyanobactéries, mais aussi à d'autres souches bactériennes. En outre, ces procédures peuvent être facilement adaptées en fonction de l'utilisation finale des produits, degré de pureté requis, et souche bactérienne.

Une représentation schématique de la méthode décrite pour extraire les polymères de glucides libérés des cultures cyanobactériennes est représentée dans la figure 1. Les polymères précipités du producteur modéré d'EPS cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 et l'efficace producteur d'EPS Cyanothece sp. CCY 0110 sont présentés à la figure 2. Dans la figure 3, les polymères lyophilisés avec diff...

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Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

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Ici, des protocoles pour l'isolement des polymères de glucides libérés de cyanobactérien et l'isolement de leurs exoprotémomes sont décrits. Les deux procédures incarnent des étapes clés pour obtenir des polymères ou des protéines avec des degrés de haute pureté qui peuvent être utilisés pour une analyse ou des applications plus approfondies. Ils peuvent également être facilement adaptés en fonction des besoins spécifiques de l'utilisateur.

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Ces protocoles que nous avons développés sont importants pour étudier les mécanismes de sécrétion dans les cyanobactéries et leurs produits libérés, à savoir les polymères et les protéines extracellulaires de glucides. Les connaissances générées nous permettront de personnaliser ces produits pour plusieurs applications, à savoir les applications biotechnologiques et biomédicales. Ces protocoles sont très simples.Ils peuvent être adaptés en fonction de l’organisme producteur, des besoins de l’utilisateur et de l’application finale du produit. Le principal avantage de ces protocoles est qu’ils peuvent facilement être adaptés à d’autres systèmes vivants, en particulier à d’autres bactéries. Ces protocoles sont faciles.Cependant, on peut avoir besoin d’introduire quelques changements en fonction de la souche bactérienne ou le degré de pureté requis. Pour commencer, cultivez la souche cyanobactérienne dans des conditions standard. Mesurer la croissance à l’aide de protocoles standard.Ensuite, transférez la culture dans des membranes de dialyse, et dialysez contre un minimum de 10 volumes d’eau déionisée pendant 24 heures avec agitation continue. Centrifuger la culture à 15 000 fois g à 4 degrés Celsius pendant 15 minutes. Transférer le supernatant dans un nouveau flacon et jeter la pastille.Centrifugeuse à nouveau à 20 000 fois g à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes pour éliminer les contaminants, comme les débris de la paroi cellulaire ou les lipopolysaccharides. Après la centrifugation, transférer le supernatant dans un bécher en verre et jeter la pastille. Pour précipiter le polymère, ajouter deux volumes de 96% d’éthanol au supernatant, et incuber la suspension à quatre degrés Celsius pendant la nuit.Pour les petites quantités ou non visibles de polymère précipité, centrifugeuse la suspension à 13 000 fois g à quatre degrés Celsius pendant 25 minutes. Jetez doucement le supernatant et resuspendez la pastille en un à deux millilitres d’eau déionisée autoclavée. Transférer la suspension aqueuse sur un flacon.Pour les grandes quantités visibles de polymère précipité, recueillir le polymère précipité avec des forceps métalliques stériles à un flacon. Presser le polymère et jeter l’excès d’éthanol. Pour effectuer le processus de lyophilisation autrement connu sous le nom de gel-séchage, gardez les flacons avec le polymère précipité à moins 80 degrés Celsius pendant la nuit.Lyophiliser le polymère pendant au moins 48 heures. Ensuite, conservez le polymère séché dans un dessiccateur à température ambiante jusqu’à nouvel usage. Pour concentrer le milieu, cultivez d’abord des cyanobactéries dans des conditions standard.Surveiller la croissance de la cyanobactérie à l’aide de procédures standard. Ensuite, centrifugez les cultures à 4000 fois g à température ambiante pendant 10 minutes. Transférer le surnatant dans un flacon et jeter la pastille cellulaire.Ensuite, filtrez le milieu décanté à travers un filtre de taille pore de 0,2 micron. Pour concentrer le milieu environ 500 fois, utilisez des concentrateurs centrifuges avec un poids moléculaire nominal de trois kilodaltons à centrifugeuse 4000 fois g et 15 degrés Celsius pour un maximum d’une heure par centrifugation ronde. Après centrifugation, rincer les parois du réservoir d’échantillon de l’appareil filtrant avec l’échantillon concentré et transférer le contenu dans un tube de microcentrifugeuse.Effectuez une étape de lavage supplémentaire du réservoir d’échantillon de dispositif de filtre avec le milieu autoclavé de culture pour assurer la récupération maximale d’exoproteome. Ensuite, conservez les échantillons d’exoprotéome à moins 20 degrés Celsius jusqu’à nouvel usage. L’éthanol doit être ajouté vigoureusement pour optimiser les précipitations et le rendement des polymères.Après avoir centrifugé le polymère précipité, le rejet du supernatant doit être fait avec soin afin d’éviter la résuspension de la pastille qui peut être lâchement fixée sur le mur de flacon. Si la filtration manuelle est effectuée, il doit être doux pour éviter de casser la membrane du filtre. Certains polymères précipités ne peuvent être visibles qu’après centrifugation, principalement sur les parois des flacons, comme le cas de l’EPS de Synechocystis.Dans d’autres cas, comme le polymère Cyanothece, il est possible de voir les touffes de polymères flotter dans le bécher de verre juste après les précipitations. Certaines contaminations peuvent être facilement détectées macroscopiquement après la lyophilisation des polymères puisqu’elles modifieront la pigmentation des polymères, généralement blanc ou brun clair. Les polymères oranges sont contaminés par des caroténoïdes ou des structures contenant ces pigments.Par exemple, les polymères verts sont contaminés par des débris cellulaires et de la chlorophylle. Les exoprotéomes peuvent varier considérablement selon la souche bactérienne. Voir, par exemple, l’exoprotéome d’une cyanobactérie unicellulaire et celui d’une souche filamenteuse.La quantité élevée de polysaccharides dans les échantillons concentrés d’exoprotéome peut entraver l’analyse de l’exoprotéome. Par exemple, il peut retarder la séparation des protéines et masquer des protéines moins abondantes. L’utilisateur peut caractériser le polymère en termes de composition, de propriétés physiques/chimiques, d’activité biologique des polymères d’essai ou de composants polymères modifiés.Pour l’identification des protéines, la séparation des protéines dans le gel et la spectrométrie de masse peut être effectuée. Et pour la séparation des vésicules, l’ultracentrifugation de l’exoproteome doit être effectuée. Dans notre groupe, ces protocoles ont déjà ouvert la voie à démêler les mécanismes de sécrétion cyanobactérienne ou les applications des polymères extracellulaires de glucides dans différents domaines, comme dans la biorémédiation ou comme antitumoraux ou agents d’administration de médicaments.

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Fluorescent coloration à l’argent des protéines dans les Gels de Polyacrylamide

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Interfacial Molecular-level Structures of Polymers and Biomacromolecules Revealed via Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy

Structures moléculaires interfaciales de polymères et de biomacromolécules révélées par spectroscopie vibratoire de génération de fréquence de somme

As a second-order nonlinear optical spectroscopy, sum frequency generation (SFG) vibrational spectroscopy has widely been used in investigating various ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Localisation des protéines modifiées par SUMO à l’aide de protéines de piégeage du sumo fluorescent

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Preparation of High-Quality Fermented Fish Product

Préparation d'un produit de poisson fermenté de haute qualité

This protocol provides a method for preparation of industrialized fermented fish product with sturgeon (Aquilaria sinensis) meat product. The procedures ...