Name: looking outwards: isolation of cyanobacterial released carbohydrate polymers and proteins
Uploaded: 2019-05-27T13:00:00
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Diese Arbeit wurde aus Fondso Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) Mitteln über das COMPETE 2020 - Operacional Programme for Competitiveness and Internationalisation (POCI), Portugal 2020, und aus portugiesischen Fonds über FCT - Fundaéo para a Ciéncia e finanziert. ein Tecnologia/Ministério da Ciéncia, Tecnologia e Ensino Superior im Rahmen des Projekts POCI-01-0145-FEDER-028779 und des Zuschusses SFRH/BD/99715/2014 (CF).

1. Cyanobacterial freigesetzte Kohlenhydrat-Polymer-Isolierung
<ol><li>
Polymerisolierung und Entfernung von Verunreinigungen
	<ol>
<li>Kultivieren Sie den cyanobakteriellen Stamm unter Standardbedingungen [z. B. 30 °C unter einem 12-h-Licht (50 'E m'2s '1)/12 h dunkles Regime, mit Orbitalschütteln bei 150 U/min]. Messen Sie das Wachstum mit Standardprotokollen [z.B. optische Dichte bei 730 nm (OD730nm), Chlorophyll a, Trockengewicht, etc.], und messen Sie da...

<ol>
	<li>Pereira, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexity+of+cyanobacterial+exopolysaccharides:+composition,+structures,+inducing+factors+and+putative+genes+involved+in+their+biosynthesis+and+assembly.">Complexity of cyanobacterial exopolysaccharides: composition, structures, inducing factors and putative genes involved in their biosynthesis and assembly.</a> FEMS Microbiology Reviews. 33 (5), 917-941 (2009).</li><li>Kanekiyo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+an+Antiviral+Polysaccharide,+Nostoflan,+from+a+Terrestrial+Cyanobacterium,+Nostoc+flagelliforme.">Isolation of an Antiviral Polysaccharide, Nostoflan, from a Terrestrial Cyanobacterium, Nostoc flagelliforme.</a> Journal of Natural Products. 68 (7), 1037-1041 (2005).</li><li>L&#248;bner, M., Walsted, A., Larsen, R., Bendtzen, K., Nielsen, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+human+adaptive+immune+responses+by+administration+of+a+high-molecular-weight+polysaccharide+extract+from+the+cyanobacterium+Arthrospira+platensis.">Enhancement of human adaptive immune responses by administration of a high-molecular-weight polysaccharide extract from the cyanobacterium Arthrospira platensis.</a> Journal of Medicinal Food. 11 (2), 313-322 (2008).</li><li>Wang, H. B., Wu, S. J., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+polysaccharides+from+cyanobacteria+Nostoc+commune+and+their+antioxidant+activities.">Preparation of polysaccharides from cyanobacteria Nostoc commune and their antioxidant activities.</a> Carbohydrate Polymers. 99, 553-555 (2014).</li><li>Ozturk, S., Aslim, B., Suludere, Z., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+removal+of+cyanobacterial+exopolysaccharides+by+uronic+acid+content+and+monosaccharide+composition.">Metal removal of cyanobacterial exopolysaccharides by uronic acid content and monosaccharide composition.</a> Carbohydrate Polymers. 101, 265-271 (2014).</li><li>Han, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emulsifying,+flocculating,+and+physicochemical+properties+of+exopolysaccharide+produced+by+cyanobacterium+Nostoc+flagelliforme.">Emulsifying, flocculating, and physicochemical properties of exopolysaccharide produced by cyanobacterium Nostoc flagelliforme.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 172 (1), 36-49 (2014).</li><li>Leite, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterium&#8208;Derived+Extracellular+Carbohydrate+Polymer+for+the+Controlled+Delivery+of+Functional+Proteins.">Cyanobacterium&#8208;Derived Extracellular Carbohydrate Polymer for the Controlled Delivery of Functional Proteins.</a> Macromolecular Bioscience. 17 (2), 1600206 (2017).</li><li>Estevinho, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+cyanobacterial+extracellular+polymeric+substance+in+the+microencapsulation+of+vitamin+B12.">Application of a cyanobacterial extracellular polymeric substance in the microencapsulation of vitamin B12.</a> Powder Technology. 343, 644-651 (2019).</li><li>Klock, J. H., Wieland, A., Seifert, R., Michaelis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+polymeric+substances+(EPS)+from+cyanobacterial+mats:+characterisation+and+isolation+method+optimisation.">Extracellular polymeric substances (EPS) from cyanobacterial mats: characterisation and isolation method optimisation.</a> Marine Biology. 152 (5), 1077-1085 (2007).</li><li>Delattre, C., Pierre, G., Laroche, C., Michaud, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+extraction+and+characterization+of+microalgal+and+cyanobacterial+exopolysaccharides.">Production, extraction and characterization of microalgal and cyanobacterial exopolysaccharides.</a> Biotechnology Advances. 34 (7), 1159-1179 (2016).</li><li>Costa, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+systems+in+gram-negative+bacteria:+structural+and+mechanistic+insights.">Secretion systems in gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (6), 343-359 (2015).</li><li>Roier, S., Zingl, F. G., Cakar, F., Schild, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicle+biogenesis:+a+new+mechanism+and+its+implications.">Bacterial outer membrane vesicle biogenesis: a new mechanism and its implications.</a> Microbial Cell. 3 (6), 257-259 (2016).</li><li>Sergeyenko, T. V., Los, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+secreted+proteins+of+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+strain+PCC+6803.">Identification of secreted proteins of the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803.</a> FEMS Microbiology Letters. 193 (2), 213-216 (2000).</li><li>Oliveira, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatile+TolC-like+Slr1270+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">The versatile TolC-like Slr1270 in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Environmental Microbiology. 18 (2), 486-502 (2016).</li><li>Flores, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alternative+sigma+factor+SigF+is+a+key+player+in+the+control+of+secretion+mechanisms+in+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">The alternative sigma factor SigF is a key player in the control of secretion mechanisms in Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Environmental Microbiology. 21 (1), 343-359 (2018).</li><li>Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+method+for+determination+of+sugars+and+related+substances.">Colorimetric method for determination of sugars and related substances.</a> Analytical Chemistry. 28 (3), 350-356 (1956).</li><li>Parikh, A., Madamwar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+characterization+of+extracellular+polysaccharides+from+cyanobacteria.">Partial characterization of extracellular polysaccharides from cyanobacteria.</a> Bioresource Technology. 97 (15), 1822-1827 (2006).</li><li>R&#252;hmann, B., Schmid, J., Sieber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+identify+the+unexplored+diversity+of+microbial+exopolysaccharides.">Methods to identify the unexplored diversity of microbial exopolysaccharides.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 565 (2015).</li><li>Pathak, J., Rajneesh, R., Sonker, A. S., Kannaujiya, V. K., Sinha, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterial+extracellular+polysaccharide+sheath+pigment,+scytonemin:+A+novel+multipurpose+pharmacophore.">Cyanobacterial extracellular polysaccharide sheath pigment, scytonemin: A novel multipurpose pharmacophore.</a> Marine Glycobiology. , 343-358 (2016).</li><li>Nguyen, A. T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performances+of+different+protocols+for+exocellular+polysaccharides+extraction+from+milk+acid+gels:+Application+to+yogurt.">Performances of different protocols for exocellular polysaccharides extraction from milk acid gels: Application to yogurt.</a> Food Chemistry. 239, 742-750 (2018).</li><li>Jamshidian, H., Shojaosadati, S. A., Mousavi, S. M., Soudi, M. R., Vilaplana, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+of+recovery+procedures+on+structural+and+rheological+properties+of+schizophyllan+produced+from+date+syrup.">Implications of recovery procedures on structural and rheological properties of schizophyllan produced from date syrup.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 105, 36-44 (2017).</li><li>Couto, N., Schooling, S. R., Dutcher, J. R., Barber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+profiles+of+outer+membrane+vesicles+and+extracellular+matrix+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Proteome profiles of outer membrane vesicles and extracellular matrix of Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Journal of Proteome Research. 14 (10), 4207-4222 (2015).</li></ol>

Um bakterielle Sekretionsmechanismen besser zu verstehen und die freigesetzten Produkte zu untersuchen, ist es von größter Bedeutung, die effiziente Isolierung und Analyse der Biomoleküle in der extrazellulären bakteriellen Umgebung (z. B. freigesetzte Kohlenhydratpolymere und Proteine).
Cyanobakterielle extrazelluläre Kohlenhydratpolymere sind extrem komplex, vor allem aufgrund der Anzahl und des Anteils verschiedener Monosaccharide, die ihre Zusammensetzung bilden1</su...

Cyanobakterien sind weithin als produktive Quellen von Naturprodukten mit vielversprechenden biotechnologischen/biomedizinischen Anwendungen anerkannt. Daher sind das Verständnis von cyanobakteriellen Sekretionsmechanismen und die Optimierung der Extraktions-/Wiederherstellungsmethoden unerlässlich, um Cyanobakterien als effiziente mikrobielle Zellfabriken zu implementieren.
Viele cyanobakterielle Stämme sind in der Lage, extrazelluläre polymere Substanzen (EPS) herzustellen, die hauptsächlich durch Heteropolysaccharide gebildet werden, die mit der Zelloberfläche assoziiert bleiben oder in das Medium1freigesetzt werden. Diese freigesetzten Kohlenhydratpolymere haben im Vergleich zu anderen Bakterien deutliche Eigenschaften, die sie für eine Vielzahl von Anwendungen (z. B. antivirale Mittel2, immunstimulierend3, Antioxidans4, Metall-Chelatierung5, emulgierend6, und Drogen-Liefermittel7,8). Die Methodik zur Isolierung dieser Polymere trägt nicht nur zu einer verbesserten Ausbeute bei, sondern auch zu erhöhter Reinheit und den spezifischen physikalischen Eigenschaften des erhaltenen Polymers9. Ein Großteil dieser Verfahren zur Isolierung der Polymere stützt sich auf Niederschlagsstrategien aus dem Kulturmedium, die aufgrund der starken anionischen Natur des Polymers leicht zu erreichen sind9,10. Darüber hinaus kann die Entfernung der im Niederschlagsschritt verwendeten Lösungsmittel durch Verdunstung und/oder Lyophilisierung schnell erreicht werden. Je nach vorgesehener Anwendung können verschiedene Schritte nach oder vor der Polymerfällung gekoppelt werden, um das Endprodukt zuzuschneiden, einschließlich Trichloressigsäure (TCA) Behandlung, Filtration oder Größenausschlusschromatographie (SEC) Säulenreinigung10.
Cyanobakterien sind auch in der Lage, eine breite Palette von Proteinen durch Wege abhängig von Membrantransportern (klassisch)11 oder vermittelt durch Vesikel (nicht-klassische)12zu sezernieren. Daher stellt die Analyse des cyanobakteriellen Exproteoms ein wesentliches Werkzeug dar, um sowohl cyanobakterielle Proteinsekretionsmechanismen zu verstehen/manipulieren als auch die spezifische extrazelluläre Funktion dieser Proteine zu verstehen. Zuverlässige Isolierung und Analyse von Exoproteomen erfordern die Konzentration des extrazellulären Milieus, da der Überfluss an abgesonderten Proteinen relativ gering ist. Darüber hinaus können andere physikalische oder chemische Schritte (z. B. Zentrifugation, Filtration oder Proteinfällung) die Qualität des erhaltenen Exoproteoms optimieren, den Proteingehalt13anreichern und das Vorhandensein von Verunreinigungen (z. B. Pigmente, Kohlenhydrate, etc.) 14 , 15 oder die Dominanz intrazellulärer Proteine in den Proben. Einige dieser Schritte können jedoch auch die Gruppe von Proteinen einschränken, die nachgewiesen werden können, was zu einer voreingenommenen Analyse führt.
Diese Arbeit beschreibt effiziente Protokolle zur Isolierung von freigesetzten Kohlenhydratpolymeren und Exoproteomen aus Cyanobakterien-Kulturmedien. Diese Protokolle können leicht an die spezifischen Ziele und Benutzerbedürfnisse der Studie angepasst werden, wobei die hier vorgestellten grundlegenden Schritte beibehalten werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1393px;" width="1392">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Dialysis membranes</td>
			<td style="width:191px;">Medicell Membranes Ltd&#160;</td>
			<td style="width:119px;">DTV.12000.07</td>
			<td style="width:777px;">Visking Tubing Size 7, Dia 23.8 mm, Width 39-41 mm 30m Roll&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Ethanol 96%</td>
			<td style="width:191px;">AGA - &#193;lcool e G&#233;neros Alimentares, S.A.</td>
			<td style="width:119px;">4.000.02.02.00</td>
			<td>Fermentation ethyl alcohol 96% AGA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">PES Filter 0.2 &#956;m</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific, Lda</td>
			<td style="width:119px;">15206869</td>
			<td>Syringe filter polystyrene 33MM 0.2&#181;M STR&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Amicon Ultra-15, Ultracel-3K</td>
			<td style="width:191px;">Merck Millipore Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">UFC900324</td>
			<td>Centrifugal filters with a nominal molecular weight cut-off of 3 kDa</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Thermo Scientific&#160;Pierce BCA Protein Assay</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific, Lda</td>
			<td style="width:119px;">10741395</td>
			<td>Green-to-blue, precise, detergent-compatible assay reagent to measure total protein concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Brillant Blue G Colloidal Concentrate&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Sigma Aldrich Qu&#237;mica SL</td>
			<td style="width:119px;">B2025-1EA</td>
			<td>Coomassie blue&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

looking outwards: isolation of cyanobacterial released carbohydrate polymers and proteins

Cyanobakterien können aktiv eine Breite von Biomolekülen in die extrazelluläre Umgebung absondern, wie Heteropolysaccharide und Proteine. Die Identifizierung und Charakterisierung dieser Biomoleküle kann das Wissen über ihre Sekretionswege verbessern und helfen, sie zu manipulieren. Darüber hinaus sind einige dieser Biomoleküle auch im Hinblick auf biotechnologische Anwendungen interessant. Hier sind zwei Protokolle für eine einfache und schnelle Isolierung von cyanobakteriell freigesetzten Kohlenhydratpolymeren und Proteinen beschrieben. Das Verfahren zur Isolierung freigesetzter Kohlenhydratpolymere basiert auf konventionellen Fällungstechniken von Polysacchariden in wässrigen Lösungen mit organischen Lösungsmitteln. Dieses Verfahren bewahrt die Eigenschaften des Polymers und vermeidet gleichzeitig das Vorhandensein von Verunreinigungen aus Zellablagerungen und Kulturmedium. Am Ende des Prozesses ist das lyophilisierte Polymer einsatzbereit oder charakterisiert oder kann je nach Endverwendung weiteren Reinigungsrunden unterzogen werden. In Bezug auf die Isolierung des cyanobakteriellen Exproteoms basiert die Technik auf der Konzentration des zellfreien Mediums nach Entfernung der Hauptverunreinigungen durch Zentrifugation und Filtration. Diese Strategie ermöglicht eine zuverlässige Isolierung von Proteinen, die über Membrantransporter oder äußere Membranbläschen ins extrazelluläre Milieu gelangen. Diese Proteine können anschließend mit Standard-Massenspektrometrie-Techniken identifiziert werden. Die hier vorgestellten Protokolle können nicht nur auf eine breite Palette von Cyanobakterien angewendet werden, sondern auch auf andere Bakterienstämme. Darüber hinaus können diese Verfahren leicht auf die endgültige Verwendung der Produkte, den erforderlichen Reinheitsgrad und die Bakterienstämme zugeschnitten werden.

Eine schematische Darstellung des beschriebenen Verfahrens zur Extraktion freigesetzter Kohlenhydratpolymere aus cyanobakteriellen Kulturen ist in Abbildung 1dargestellt. Gefällte Polymere des moderaten EPS-Herstellers Cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 und des effizienten EPS-Herstellers Cyanothece sp. CCY 0110 sind in Abbildung 2dargestellt. In Abbildung 3sind lyophilisierte Polymere mit unterschiedlichen...

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Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

Blick nach außen: Isolierung von cyanobakteriellen freigesetzten Kohlenhydratpolymeren und Proteinen

Hier werden Protokolle zur Isolierung von cyanobakteriell freigesetzten Kohlenhydratpolymeren und zur Isolierung ihrer Exoproteome beschrieben. Beide Verfahren verkörpern wichtige Schritte zur Gewinnung von Polymeren oder Proteinen mit hohen Reinheitsgraden, die für weitere Analysen oder Anwendungen verwendet werden können. Sie können auch einfach an die spezifischen Benutzerbedürfnisse angepasst werden.

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Diese Protokolle, die wir entwickelt haben, sind wichtig, um die Sekretionsmechanismen in Cyanobakterien und deren freigesetzten Produkten zu untersuchen, nämlich die extrazellulären Kohlenhydratpolymere und Proteine. Das gewonnene Wissen wird es uns ermöglichen, diese Produkte für verschiedene Anwendungen anzupassen, nämlich für biotechnologische und biomedizinische Anwendungen. Diese Protokolle sind sehr einfach.Sie können auf den produzierenden Organismus, die Bedürfnisse des Anwenders und die endgültige Anwendung des Produkts zugeschnitten werden. Der Hauptvorteil dieser Protokolle besteht darin, dass sie leicht an andere lebende Systeme, insbesondere an andere Bakterien, angepasst werden können. Diese Protokolle sind einfach.Allerdings kann es sein, dass man einige Änderungen in Abhängigkeit von der bakteriellen Belastung oder dem erforderlichen Reinheitsgrad vornehmen muss. Zunächst kultivieren Sie den cyanobakteriellen Stamm unter Standardbedingungen. Messen Sie das Wachstum mithilfe von Standardprotokollen.Als nächstes übertragen Sie die Kultur in Dialysemembranen, und dialysieren gegen mindestens 10 Volumen von entionisiertem Wasser für 24 Stunden mit kontinuierlichem Rühren. Zentrifugieren Sie die Kultur bei 15.000 mal g bei vier Grad Celsius für 15 Minuten. Den Überstand in eine neue Durchstechflasche geben und das Pellet entsorgen.Zentrifugieren Sie wieder bei 20.000 mal g bei vier Grad Celsius für 15 Minuten, um Verunreinigungen wie Zellwandablagerungen oder Lipopolysaccharide zu entfernen. Nach der Zentrifugation den Überstand in ein Glasbecher geben und das Pellet entsorgen. Um das Polymer auszufällen, fügen Sie dem Überstand zwei Volumina von 96% Ethanol hinzu und inkubieren Sie die Suspension bei vier Grad Celsius über Nacht.Zentrifugieren Sie bei kleinen oder nicht sichtbaren Mengen niederschlagsmittelem Polymer die Suspension bei 13.000 mal g bei vier Grad Celsius für 25 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig und setzen Sie das Pellet in ein bis zwei Milliliter autoklaviertem entionisiertem Wasser wieder auf. Übertragen Sie die wässrige Aufhängung auf eine Durchstechflasche.Für sichtbare, große Mengen von gefälltem Polymer, sammeln Sie das gefällte Polymer mit sterilen Metallzangen zu einer Durchstechflasche. Drücken Sie das Polymer, und entsorgen Sie das überschüssige Ethanol. Um den Lyophilisierungsprozess durchzuführen, der auch als Gefriertrocknung bekannt ist, halten Sie die Fläschchen mit dem gefällten Polymer über Nacht bei minus 80 Grad Celsius.Lyophilisieren Sie das Polymer für mindestens 48 Stunden. Dann das getrocknete Polymer in einem Trockenschrank bei Raumtemperatur bis zur weiteren Verwendung aufbewahren. Um das Medium zu konzentrieren, kultivieren Sie zunächst Cyanobakterien unter Standardbedingungen.Überwachen Sie das Cyanobacterium-Wachstum mit Standardverfahren. Dann zentrifugieren Sie die Kulturen bei 4.000 mal g bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Übertragen Sie den Überstand in einen Kolben, und entsorgen Sie das Zellpellet.Filtern Sie anschließend das dekantierte Medium durch einen 0,2-Mikron-Poren-Filter. Um das Medium etwa 500 Mal zu konzentrieren, verwenden Sie Zentrifugalkonzentratoren mit einer nominalen Molekulargewichtsabschaltung von drei Kilodaltonen zur Zentrifuge 4.000 mal g und 15 Grad Celsius für maximal eine Stunde pro Zentrifugation. Nach der Zentrifugation die Wände des Filtergeräteprobenreservoirs mit der konzentrierten Probe abspülen und den Inhalt in ein Mikrozentrifugenrohr übertragen.Führen Sie einen zusätzlichen Waschschritt des Filtergeräte-Probenreservoirs mit dem autoklavierten Kulturmedium durch, um eine maximale Exoproteom-Wiederherstellung zu gewährleisten. Dann lagern Sie die Exoproteom-Proben bei minus 20 Grad Celsius bis zur weiteren Verwendung. Das Ethanol muss kräftig zugesetzt werden, um die Polymerausfällung und Ausbeute zu optimieren.Nach der Zentrifugierung des gefällten Polymers sollte der Rückwurf des Überstandes sorgfältig erfolgen, um eine erneute Aufhängung des Pellets zu vermeiden, das lose an der Kolbenwand befestigt werden kann. Wenn eine manuelle Filtration durchgeführt wird, sollte es schonend sein, um ein Bruch der Filtermembran zu vermeiden. Einige gefällte Polymere können nur nach der Zentrifugation sichtbar sein, hauptsächlich an den Wänden der Kolben, wie im Fall von EPS von Synechocystis.In anderen Fällen, wie Cyanothece Polymer, ist es möglich, die Polymerklumpen im Glasbecher kurz nach dem Niederschlag schwimmen zu sehen. Einige Verunreinigungen können nach der Polymerlyophilisierung makroskopisch leicht erkannt werden, da sie die Polymerpigmentierung verändern, in der Regel weiß oder hellbraun. Orange Polymere sind mit Carotinoiden oder Strukturen kontaminiert, die diese Pigmente enthalten.Beispielsweise sind grüne Polymere mit Zellablagerungen und Chlorophyll kontaminiert. Exoproteome können je nach Bakterienstamm erheblich variieren. Siehe z. B. das Exoproteom aus einem einzelligen Cyanobakterium und das aus einem fadenförmigen Stamm.Die hohe Menge an Polysacchariden in Exoproteom-konzentrierten Proben kann die Exoproteom-Analyse behindern. Zum Beispiel kann es die Proteintrennung verzögern und weniger reichlich eiterne Proteine maskieren. Der Anwender kann das Polymer in Bezug auf Zusammensetzung, physikalische/chemische Eigenschaften, biologische Aktivität des Prüfpolymers oder modifizierte Polymerkomponenten charakterisieren.Zur Proteinidentifikation kann die Trennung von Proteinen in der Gel- und Massenspektrometrie durchgeführt werden. Und zur Trennung der Vesikel sollte eine Ultrazentrifugation des Exoproteoms durchgeführt werden. In unserer Gruppe haben diese Protokolle bereits den Weg geebnet, cyanobakterielle Sekretionsmechanismen oder Anwendungen der extrazellulären Kohlenhydratpolymere in verschiedenen Bereichen zu entwirren, z. B. in der Biosanierung oder als Antitumor- oder Arzneimittelabgabemittel.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Biochemistry of the Cell

SCIENTISTS IN ACTION

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Hochdurchsatz-Screening von Kohlenhydrat-abbauenden Enzymen Neuartige Unlöslich chromogenen Assays Kits

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Forschung

Biochemie

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Isolierung von Zwischenfilamentproteinen aus mehreren Mausgeweben zur Untersuchung von altern-assoziierten posttranslationalen Modifikationen

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Biochemische und strukturelle Charakterisierung von Kohlenhydrat Transport Substrat-Bindeprotein SP0092

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Preparation of High-Quality Fermented Fish Product

Herstellung von hochwertigem fermentiertem Fischprodukt

This protocol provides a method for preparation of industrialized fermented fish product with sturgeon (Aquilaria sinensis) meat product. The procedures ...