Name: looking outwards: isolation of cyanobacterial released carbohydrate polymers and proteins
Uploaded: 2019-05-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins at JoVE.com

עבודה זו היתה ממומנת על ידי Fundo אירופu de Desenvolvimento האזורית (פדר) קרנות באמצעות 2020 להתחרות-תוכנית Operacional לתחרותיות ובאינטראלליזציה (POCI), פורטוגל 2020, ועל ידי כספים פורטוגזית דרך FCT-Funda, הסדרה האלקטרונית e Tecnoלוג/Ministério da Ciência, Tecnoלוגיה e Ensino מעולה במסגרת הפרויקט POCI-01-0145-פדר-028779 והענק SFRH/BD/99715/2014 (CF).

1. בידוד פולימר משוחרר פחמימות
<ol><li>
בידוד פולימרי והסרת מזהמים
	<ol>
<li>לטפח את המתח cyanobacterial תחת תנאים סטנדרטיים [למשל, 30 ° צ' תחת אור 12 h (50 μE m-2-1)/12 h משטר כהה, עם טלטול מסלולית ב 150 rpm]. למדוד צמיחה באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים [למשל, צפיפות אופטית ב 730 ננומטר (OD730nm), כלור?...

<ol>
	<li>Pereira, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexity+of+cyanobacterial+exopolysaccharides:+composition,+structures,+inducing+factors+and+putative+genes+involved+in+their+biosynthesis+and+assembly.">Complexity of cyanobacterial exopolysaccharides: composition, structures, inducing factors and putative genes involved in their biosynthesis and assembly.</a> FEMS Microbiology Reviews. 33 (5), 917-941 (2009).</li><li>Kanekiyo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+an+Antiviral+Polysaccharide,+Nostoflan,+from+a+Terrestrial+Cyanobacterium,+Nostoc+flagelliforme.">Isolation of an Antiviral Polysaccharide, Nostoflan, from a Terrestrial Cyanobacterium, Nostoc flagelliforme.</a> Journal of Natural Products. 68 (7), 1037-1041 (2005).</li><li>L&#248;bner, M., Walsted, A., Larsen, R., Bendtzen, K., Nielsen, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+human+adaptive+immune+responses+by+administration+of+a+high-molecular-weight+polysaccharide+extract+from+the+cyanobacterium+Arthrospira+platensis.">Enhancement of human adaptive immune responses by administration of a high-molecular-weight polysaccharide extract from the cyanobacterium Arthrospira platensis.</a> Journal of Medicinal Food. 11 (2), 313-322 (2008).</li><li>Wang, H. B., Wu, S. J., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+polysaccharides+from+cyanobacteria+Nostoc+commune+and+their+antioxidant+activities.">Preparation of polysaccharides from cyanobacteria Nostoc commune and their antioxidant activities.</a> Carbohydrate Polymers. 99, 553-555 (2014).</li><li>Ozturk, S., Aslim, B., Suludere, Z., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+removal+of+cyanobacterial+exopolysaccharides+by+uronic+acid+content+and+monosaccharide+composition.">Metal removal of cyanobacterial exopolysaccharides by uronic acid content and monosaccharide composition.</a> Carbohydrate Polymers. 101, 265-271 (2014).</li><li>Han, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emulsifying,+flocculating,+and+physicochemical+properties+of+exopolysaccharide+produced+by+cyanobacterium+Nostoc+flagelliforme.">Emulsifying, flocculating, and physicochemical properties of exopolysaccharide produced by cyanobacterium Nostoc flagelliforme.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 172 (1), 36-49 (2014).</li><li>Leite, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterium&#8208;Derived+Extracellular+Carbohydrate+Polymer+for+the+Controlled+Delivery+of+Functional+Proteins.">Cyanobacterium&#8208;Derived Extracellular Carbohydrate Polymer for the Controlled Delivery of Functional Proteins.</a> Macromolecular Bioscience. 17 (2), 1600206 (2017).</li><li>Estevinho, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+cyanobacterial+extracellular+polymeric+substance+in+the+microencapsulation+of+vitamin+B12.">Application of a cyanobacterial extracellular polymeric substance in the microencapsulation of vitamin B12.</a> Powder Technology. 343, 644-651 (2019).</li><li>Klock, J. H., Wieland, A., Seifert, R., Michaelis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+polymeric+substances+(EPS)+from+cyanobacterial+mats:+characterisation+and+isolation+method+optimisation.">Extracellular polymeric substances (EPS) from cyanobacterial mats: characterisation and isolation method optimisation.</a> Marine Biology. 152 (5), 1077-1085 (2007).</li><li>Delattre, C., Pierre, G., Laroche, C., Michaud, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+extraction+and+characterization+of+microalgal+and+cyanobacterial+exopolysaccharides.">Production, extraction and characterization of microalgal and cyanobacterial exopolysaccharides.</a> Biotechnology Advances. 34 (7), 1159-1179 (2016).</li><li>Costa, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+systems+in+gram-negative+bacteria:+structural+and+mechanistic+insights.">Secretion systems in gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (6), 343-359 (2015).</li><li>Roier, S., Zingl, F. G., Cakar, F., Schild, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicle+biogenesis:+a+new+mechanism+and+its+implications.">Bacterial outer membrane vesicle biogenesis: a new mechanism and its implications.</a> Microbial Cell. 3 (6), 257-259 (2016).</li><li>Sergeyenko, T. V., Los, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+secreted+proteins+of+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+strain+PCC+6803.">Identification of secreted proteins of the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803.</a> FEMS Microbiology Letters. 193 (2), 213-216 (2000).</li><li>Oliveira, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatile+TolC-like+Slr1270+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">The versatile TolC-like Slr1270 in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Environmental Microbiology. 18 (2), 486-502 (2016).</li><li>Flores, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alternative+sigma+factor+SigF+is+a+key+player+in+the+control+of+secretion+mechanisms+in+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">The alternative sigma factor SigF is a key player in the control of secretion mechanisms in Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Environmental Microbiology. 21 (1), 343-359 (2018).</li><li>Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+method+for+determination+of+sugars+and+related+substances.">Colorimetric method for determination of sugars and related substances.</a> Analytical Chemistry. 28 (3), 350-356 (1956).</li><li>Parikh, A., Madamwar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+characterization+of+extracellular+polysaccharides+from+cyanobacteria.">Partial characterization of extracellular polysaccharides from cyanobacteria.</a> Bioresource Technology. 97 (15), 1822-1827 (2006).</li><li>R&#252;hmann, B., Schmid, J., Sieber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+identify+the+unexplored+diversity+of+microbial+exopolysaccharides.">Methods to identify the unexplored diversity of microbial exopolysaccharides.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 565 (2015).</li><li>Pathak, J., Rajneesh, R., Sonker, A. S., Kannaujiya, V. K., Sinha, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterial+extracellular+polysaccharide+sheath+pigment,+scytonemin:+A+novel+multipurpose+pharmacophore.">Cyanobacterial extracellular polysaccharide sheath pigment, scytonemin: A novel multipurpose pharmacophore.</a> Marine Glycobiology. , 343-358 (2016).</li><li>Nguyen, A. T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performances+of+different+protocols+for+exocellular+polysaccharides+extraction+from+milk+acid+gels:+Application+to+yogurt.">Performances of different protocols for exocellular polysaccharides extraction from milk acid gels: Application to yogurt.</a> Food Chemistry. 239, 742-750 (2018).</li><li>Jamshidian, H., Shojaosadati, S. A., Mousavi, S. M., Soudi, M. R., Vilaplana, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+of+recovery+procedures+on+structural+and+rheological+properties+of+schizophyllan+produced+from+date+syrup.">Implications of recovery procedures on structural and rheological properties of schizophyllan produced from date syrup.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 105, 36-44 (2017).</li><li>Couto, N., Schooling, S. R., Dutcher, J. R., Barber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+profiles+of+outer+membrane+vesicles+and+extracellular+matrix+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Proteome profiles of outer membrane vesicles and extracellular matrix of Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Journal of Proteome Research. 14 (10), 4207-4222 (2015).</li></ol>

כדי להבין טוב יותר מנגנוני הפרשה חיידקיים וללמוד את המוצרים שפורסמו, זה חשוב ביותר כדי להדגים את הבידוד יעיל וניתוח של הbiomolecules הנוכחי בסביבה חיידקי החילוץ (כגון שוחרר פולימרים של פחמימות וחלבונים).
מסחטות cyanobacterial פולימרים פחמימות מורכבים מאוד, בעיקר בשל מספר ופרופורציה של ...

כחוליות מוכרות באופן נרחב כמקורות פורה של מוצרים טבעיים עם יישומים מבטיחים ביו-טכנולוגיים/ביו-רפואיים. לכן, הבנת מנגנוני הפרשה cyanobacterial ואופטימיזציה של שיטות החילוץ/שחזור חיוניים כדי ליישם cyanחיידקים יעילים מפעלים תאים מיקרוביאלית.
זנים cyanobacterial רבים מסוגלים לייצר חומרים פולימריים מסחטות (EPS), שנוצרו בעיקר על ידי הפשפשים, כי להישאר משויך משטח התא או משתחררים לתוך המדיום1. אלה פולימרים פחמימות שפורסמו יש תכונות נפרדות לעומת אלה של חיידקים אחרים, אשר להפוך אותם מתאימים עבור מגוון רחב של יישומים (למשל, נוגדנים2, מגירוי חיסוני3, נוגד חמצון4, מתכת-הכלפת5, אמולסיה6, וסוכני משלוח הסמים7,8). מתודולוגיה לבידוד של פולימרים אלה תורמת בעיקר לא רק כדי לשפר את התשואה אלא גם להגדיל את הטוהר ואת התכונות הפיזיות הספציפיות של הפולימר השיג9. רוב עצום של שיטות אלה לבידוד של פולימרים להסתמך על אסטרטגיות משקעים מתוך מדיום התרבות כי הם מושגת בקלות בשל הטבע האנייוני חזק של הפולימר9,10. בנוסף, הסרת ממיסים המשמשים בשלב המשקעים יכולה להיות מושגת במהירות על ידי אידוי ו/או ליזוליזציה. בהתאם ליישום מיוצג, שלבים שונים יכולים להיות ביחד או לאחר או לפני משקעים פולימריים על מנת להתאים את המוצר הסופי, הכוללים חומצת חומץ triכלור (TCA) טיפול, סינון, או כרומטוגרפיה הדרה (SEC) הטור טיהור10.
כחוליות מסוגלות גם להפריש מגוון רחב של חלבונים באמצעות מסלולים התלויים בטרנספורטי קרום (קלאסי)11 או בתיווך על ידי שלפוחיות (לא קלאסית)12. לכן, ניתוח של cyanexoproteome terial מהווה כלי חיוני, הן כדי להבין/לתמרן הפרשת חלבון cyanobacterial מנגנונים ולהבין את הפונקציה החילוץ ספציפיים של חלבונים אלה. הבידוד האמין והניתוח של הexoproteomes דורשים את הריכוז של הסביבה המועטה, שכן השפע של החלבונים מופרש נמוך יחסית. בנוסף, צעדים פיזיים או כימיים אחרים (למשל, צנטריפוגה, סינון או משקעים בחלבון) עשויים למטב את איכות הexoproteome המתקבלת, להעשיר את תוכן החלבון13, ולהימנע מנוכחות מזהמים (למשל, פיגמנטים, פחמימות, וכו') מיכל בן 14 , 15 או שליטה מראש של חלבונים תאיים בדגימות. עם זאת, חלק מהשלבים הללו עשויים גם להגביל את ערכת החלבונים שניתן לאתרם, המובילה לניתוח מוטה.
עבודה זו מתארת פרוטוקולים יעילים לבידוד של פולימרים משוחררים של פחמימות וexoproteomes מתוך מדיה של התרבות הקיאנקטריה. פרוטוקולים אלה ניתן להתאים בקלות את המטרות הספציפיות של המחקר ואת צורכי המשתמש, תוך שמירה על הצעדים הבסיסיים המוצגים כאן.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1393px;" width="1392">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Dialysis membranes</td>
			<td style="width:191px;">Medicell Membranes Ltd&#160;</td>
			<td style="width:119px;">DTV.12000.07</td>
			<td style="width:777px;">Visking Tubing Size 7, Dia 23.8 mm, Width 39-41 mm 30m Roll&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Ethanol 96%</td>
			<td style="width:191px;">AGA - &#193;lcool e G&#233;neros Alimentares, S.A.</td>
			<td style="width:119px;">4.000.02.02.00</td>
			<td>Fermentation ethyl alcohol 96% AGA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">PES Filter 0.2 &#956;m</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific, Lda</td>
			<td style="width:119px;">15206869</td>
			<td>Syringe filter polystyrene 33MM 0.2&#181;M STR&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Amicon Ultra-15, Ultracel-3K</td>
			<td style="width:191px;">Merck Millipore Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">UFC900324</td>
			<td>Centrifugal filters with a nominal molecular weight cut-off of 3 kDa</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Thermo Scientific&#160;Pierce BCA Protein Assay</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific, Lda</td>
			<td style="width:119px;">10741395</td>
			<td>Green-to-blue, precise, detergent-compatible assay reagent to measure total protein concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Brillant Blue G Colloidal Concentrate&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Sigma Aldrich Qu&#237;mica SL</td>
			<td style="width:119px;">B2025-1EA</td>
			<td>Coomassie blue&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

looking outwards: isolation of cyanobacterial released carbohydrate polymers and proteins

כחוליות יכול להפריש באופן פעיל מגוון רחב של biomolecules לתוך הסביבה החילוץ, כגון הפשפשים וחלבונים. ההזדהות והאפיון של biomolecules אלה יכולים לשפר את הידע על משעולים הפרשה שלהם ולעזור לתמרן אותם. יתרה מזאת, חלק מbiomolecules הללו מעניינים גם במונחים של יישומים ביו-טכנולוגיים. המתואר כאן הם שני פרוטוקולים עבור בידוד קל ומהיר של cyanobacterial שוחרר פולימרים פחמימות וחלבונים. השיטה לבידוד של פולימרים שפורסמו מבוססת על טכניקות משקעים קונבנציונליים של פוליסכרידים בפתרונות מימית באמצעות ממיסים אורגניים. שיטה זו משמרת את מאפייני הפולימר ובמקביל נמנעת מנוכחותם של מזהמים מפסולת התא וממדיום תרבותי. בסופו של התהליך, פולימר ליאופהיזה מוכן לשמש או מאופיין או יכול להיות נתון לסיבובים נוספים של טיהור, בהתאם לשימוש סופי מיועד. בנוגע לבידוד של cyanobacterial exoproteome, הטכניקה מבוססת על ריכוז של מדיום ללא תא לאחר הסרת המזהמים העיקריים על ידי צנטריפוגה וסינון. אסטרטגיה זו מאפשרת בידוד אמין של חלבונים המגיעים לתחומי החילוץ באמצעות מובילי הממברנה או שלפוחיות הקרום החיצוני. חלבונים אלה יכולים להיות מזוהים לאחר מכן באמצעות טכניקות המסה סטנדרטי ספקטרומטריה. הפרוטוקולים המוצגים כאן ניתן להחיל לא רק על מגוון רחב של כחוליות, אלא גם על זנים חיידקיים אחרים. יתר על כן, הליכים אלה יכולים להיות מותאמים בקלות על פי השימוש הסופי של המוצרים, תואר הטוהר הנדרש, והזן חיידקי.

ייצוג סכמטי של השיטה תיאר לחלץ פולימרים פחמימות שפורסמו מתוך התרבויות cyanobacterial מתוארת באיור 1. פולימרים של מפיקת ה-EPS המתונות cyanobacterium sy, מפיק מסוג היצרן. pcc 6803 ומפיק ה-eps היעיל המפיק השני של ccy 0110 מוצגים באיור 2. באיור 3, מוצגים פולימרים...

Watch this Scientific Journal Video about Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins at JoVE.com

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

מבט כלפי חוץ: בידוד של Cyanobacterial שוחרר פולימרים פחמימות וחלבונים

כאן, פרוטוקולים עבור בידוד של cyanobacterial שוחרר פולימרים פחמימות ובידוד של exoproteomes שלהם מתוארים. שני ההליכים לגלם שלבים מרכזיים כדי להשיג פולימרים או חלבונים עם דרגות טוהר גבוהה, כי ניתן להשתמש לניתוח נוסף או יישומים. הם יכולים גם להיות מותאמים בקלות בהתאם לצרכים ספציפיים של המשתמש.

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

פרוטוקולים אלה שפיתחנו חשובים ללמוד את מנגנוני הפרשת ציאנובקטריה ואת המוצרים המשוחררים שלהם, כלומר פולימרים וחלבונים פחמימות חוץ תאיים. הידע שנוצר יאפשר לנו להתאים אישית מוצרים אלה עבור מספר יישומים, כלומר יישומים ביוטכנולוגיים וביו-רפואיים. הפרוטוקולים האלה מאוד פשוטים.הם יכולים להיות מותאמים על פי האורגניזם המייצר, צרכי המשתמש, ואת היישום הסופי של המוצר. היתרון העיקרי של פרוטוקולים אלה הוא שהם יכולים בקלות להיות מותאמים למערכות חיים אחרות, במיוחד חיידקים אחרים. הפרוטוקולים האלה קלים.עם זאת, ייתכן שיהיה צורך להציג כמה שינויים בהתאם לזן חיידקי או מידת הטוהר הנדרש. כדי להתחיל, לטפח את הזן ציאנובקטריאלי בתנאים סטנדרטיים. למדוד צמיחה באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים.לאחר מכן, להעביר את התרבות לתוך קרום דיאליזה, דיאליזה נגד מינימום של 10 כרכים של מים deionized במשך 24 שעות עם ערבוב מתמשך. צנטריפוגה התרבות ב 15, 000 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. מעבירים את העל-טבעי לבקבוקון חדש, ומשליכים את גלולת הבקבוקון.צנטריפוגה שוב ב 20, 000 פעמים g בארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי להסיר מזהמים, כגון פסולת קיר התא או lipopolysaccharides. לאחר הצנטריפוגה, מעבירים את העל-טבעי לסק זכוכית, ומשליכים את גלולה. כדי לזרז את הפולימר, מוסיפים שני כרכים של 96% אתנול לעל-טבעי, ומטמיעים את ההשעיה בארבע מעלות צלזיוס במהלך הלילה.עבור כמויות קטנות או לא נראות לעין של פולימר מזרז, צנטריפוגה ההשעיה ב 13, 000 פעמים g בארבע מעלות צלזיוס במשך 25 דקות. השליכו בעדינות את העל-טבעי, והתינו מחדש את גלולת הכדור באחד עד שני מיליליטר של מים אוטו-סלאביים. מעבירים את ההשעיה המים לבקבוקון.עבור גלוי, כמויות גדולות של פולימר זירז, לאסוף את הפולימר זירז עם מטלות מתכת סטרילית לבקבוקון. לסחוט את הפולימר, ולהשליך את האתנול העודף. כדי לבצע את תהליך lyophilization הידוע גם בשם הקפאה ייבוש, לשמור את הבקבוקונים עם פולימר זירז במינוס 80 מעלות צלזיוס לילה.ליופיליזציה פולימר לפחות 48 שעות. לאחר מכן, לאחסן את הפולימר מיובש ב desiccator בטמפרטורת החדר עד לשימוש נוסף. כדי לרכז את המדיום, ראשית לטפח ציאנובקטריה בתנאים סטנדרטיים.לפקח על צמיחת ציאנובקטריום באמצעות הליכים סטנדרטיים. לאחר מכן, צנטריפוגה התרבויות ב 4, 000 פעמים גרם בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. מעבירים את העל-טבעי לבקבוקון, ומשליכים את גלולת התא.לאחר מכן, סנן את המדיום המודק באמצעות מסנן גודל נקבוביות של 0.2 מיקרון. כדי לרכז את המדיום כ 500 פעמים, להשתמש concentrators צנטריפוגלי עם ניתוק משקל מולקולרי נומינלי של שלושה קילודלטונים צנטריפוגה 4, 000 פעמים גרם ו 15 מעלות צלזיוס לכל היותר שעה אחת סיבוב צנטריפוגה. לאחר צנטריפוגה, לשטוף את הקירות של מאגר מדגם התקן המסנן עם מדגם מרוכז, ולהעביר את התוכן צינור microcentrifuge.בצע שלב כביסה נוסף של מאגר הדגימה של התקן הסינון עם מדיום התרבות autoclaved כדי להבטיח התאוששות אקסופרוטומה מקסימלית. לאחר מכן, לאחסן את דגימות exoproteome במינוס 20 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. אתנול יש להוסיף במרץ כדי לייעל את משקעים פולימר ותפוקה.לאחר צנטריפוגה פולימר זירז, להשליך את supernatant צריך להיעשות בזהירות על מנת למנוע הפוגה של גלולה שעשוי להיות מחובר באופן רופף על הקיר של בקבוקון. אם סינון ידני מבוצע, זה צריך להיות עדין כדי למנוע שבירת קרום המסנן. כמה פולימרים זירז יכול להיות גלוי רק לאחר צנטריפוגה, בעיקר על הקירות של flasks, כגון במקרה של EPS מ Synechocystis.במקרים אחרים, כגון פולימר Cyanothece, ניתן לראות את גושי פולימר צף ב זכוכית רק לאחר משקעים. זיהומים מסוימים ניתן לזהות בקלות מקרוסקופית לאחר ליופיליזציה פולימרית שכן הם ישנו פיגמנטציה פולימרית, בדרך כלל לבן או חום בהיר. פולימרים כתומים מזוהמים עם קרוטנואידים או מבנים המכילים פיגמנטים אלה.לדוגמה, פולימרים ירוקים מזוהמים עם פסולת תאים וכלורופיל. Exoproteomes יכול להשתנות באופן משמעותי בהתאם לזן חיידקי. ראה, למשל, האקסופרוטאום של ציאנובקטריום חד תאי וזה מזן filamentous.הכמות הגבוהה של פוליסכרידים בדגימות מרוכזות exoproteome יכול לעכב את ניתוח exoproteome. לדוגמה, זה יכול לעכב את הפרדת החלבון ולהסוות חלבונים פחות בשפע. המשתמש יכול לאפיין את הפולימר במונחים של הרכב, תכונות פיזיקליות /כימיות, בדיקת פעילות ביולוגית פולימרית, או רכיבי פולימר שונה.לזיהוי חלבונים, ניתן לבצע הפרדת חלבונים בג'ל ובספקטרומטריית מסה. ועל הפרדת זרזים, יש לבצע אולטרה-מרכז של האקסופרוטום. בקבוצה שלנו, פרוטוקולים אלה כבר סללו את הדרך לפענח מנגנוני הפרשת ציאנובקטריאליים או יישומים של פולימרים פחמימות חוץ תאיים בתחומים שונים, כגון ביו-שיקום או כסוכני אנטיטומור או אספקת תרופות.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Biochemistry of the Cell

SCIENTISTS IN ACTION

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

הקרנת תפוקה גבוהה של אנזימים פחמימות-משפיל שימוש רומן מסיסים chromogenic המצע Assay ערכות

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

זיהוי של הצמח קרח מחייב חלבונים באמצעות הערכה של עיכוב קרח-recrystallization ובידוד באמצעות טיהור קרח-זיקה

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

בידוד של חלבונים ביניים חלבונים מ רקמות עכבר מרובות לחקר ההזדקנות הקשורים שינויים טרנסלוציוניים

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

אפיון הביוכימי ומבניים של SP0092 המצע-מחייב-חלבון פחמימות תחבורה

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

ניתוח דינאמי חלבון מתחמי נאסף בנושא ושוחרר מן Biolayer אינטרפרומטריה ביוסנסור באמצעות ספקטרומטר מסה ואלקטרון

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

בידוד של Glomeruli, In Vivo תיוג של חלבונים פני שטח התא Glomerular

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

צביעת כסף פלורסנט של חלבונים בג'לים לזיהוי

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Interfacial Molecular-level Structures of Polymers and Biomacromolecules Revealed via Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy

מבנים ברמת הפנים המולקולריים של פולימרים וBiomacromolecules מתגלים דרך תדר סיכום הדור ספקטרוסקופיה ויברtional

As a second-order nonlinear optical spectroscopy, sum frequency generation (SFG) vibrational spectroscopy has widely been used in investigating various ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

לוקליזציה של חלבונים ששונו באמצעות סומו פלורסנט-השמנה חלבונים

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Preparation of High-Quality Fermented Fish Product

הכנת מוצר מוצרי הדגים התוססים באיכות גבוהה

This protocol provides a method for preparation of industrialized fermented fish product with sturgeon (Aquilaria sinensis) meat product. The procedures ...