Name: looking outwards: isolation of cyanobacterial released carbohydrate polymers and proteins
Uploaded: 2019-05-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins at JoVE.com

この作品は、コンペ2020-競争力と国際化のためのオペラプログラム(POCI)、ポルトガル2020、FCTを通じてポルトガルのファンドによって資金提供されたフンド・ヨーロッパ・デ・デセンボルヴィメント地域(FEDER)ファンドによって資金提供されました - フンダサン・パラ・シエンシアeテクノロジア/ミニステリオ・ダ・シエンシア、テクノロジア・エ・エンシノ・スーペリアは、プロジェクトPOCI-01-0145-FEDER-028779および助成金SFRH/BD/99715/2014(CF)の枠組みの中でスーペリア。

1. シアノバクテリア放出炭水化物ポリマー分離
<ol><li>
ポリマーの単離と汚染物質の除去
	<ol>
<li>標準的な条件下でシアノバクテリア株を栽培する[例えば、12h光の下で30°C(50 μE m-2s -1)/12 h暗いレジメン、150 rpmで軌道揺さぶりで]。標準プロトコル(例えば、730nm(OD730nm)の光学密度、クロロフィルa、乾燥重量等を用いて増殖を測定し、フェノール硫酸法...

<ol>
	<li>Pereira, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexity+of+cyanobacterial+exopolysaccharides:+composition,+structures,+inducing+factors+and+putative+genes+involved+in+their+biosynthesis+and+assembly.">Complexity of cyanobacterial exopolysaccharides: composition, structures, inducing factors and putative genes involved in their biosynthesis and assembly.</a> FEMS Microbiology Reviews. 33 (5), 917-941 (2009).</li><li>Kanekiyo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+an+Antiviral+Polysaccharide,+Nostoflan,+from+a+Terrestrial+Cyanobacterium,+Nostoc+flagelliforme.">Isolation of an Antiviral Polysaccharide, Nostoflan, from a Terrestrial Cyanobacterium, Nostoc flagelliforme.</a> Journal of Natural Products. 68 (7), 1037-1041 (2005).</li><li>L&#248;bner, M., Walsted, A., Larsen, R., Bendtzen, K., Nielsen, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+human+adaptive+immune+responses+by+administration+of+a+high-molecular-weight+polysaccharide+extract+from+the+cyanobacterium+Arthrospira+platensis.">Enhancement of human adaptive immune responses by administration of a high-molecular-weight polysaccharide extract from the cyanobacterium Arthrospira platensis.</a> Journal of Medicinal Food. 11 (2), 313-322 (2008).</li><li>Wang, H. B., Wu, S. J., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+polysaccharides+from+cyanobacteria+Nostoc+commune+and+their+antioxidant+activities.">Preparation of polysaccharides from cyanobacteria Nostoc commune and their antioxidant activities.</a> Carbohydrate Polymers. 99, 553-555 (2014).</li><li>Ozturk, S., Aslim, B., Suludere, Z., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+removal+of+cyanobacterial+exopolysaccharides+by+uronic+acid+content+and+monosaccharide+composition.">Metal removal of cyanobacterial exopolysaccharides by uronic acid content and monosaccharide composition.</a> Carbohydrate Polymers. 101, 265-271 (2014).</li><li>Han, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emulsifying,+flocculating,+and+physicochemical+properties+of+exopolysaccharide+produced+by+cyanobacterium+Nostoc+flagelliforme.">Emulsifying, flocculating, and physicochemical properties of exopolysaccharide produced by cyanobacterium Nostoc flagelliforme.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 172 (1), 36-49 (2014).</li><li>Leite, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterium&#8208;Derived+Extracellular+Carbohydrate+Polymer+for+the+Controlled+Delivery+of+Functional+Proteins.">Cyanobacterium&#8208;Derived Extracellular Carbohydrate Polymer for the Controlled Delivery of Functional Proteins.</a> Macromolecular Bioscience. 17 (2), 1600206 (2017).</li><li>Estevinho, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+cyanobacterial+extracellular+polymeric+substance+in+the+microencapsulation+of+vitamin+B12.">Application of a cyanobacterial extracellular polymeric substance in the microencapsulation of vitamin B12.</a> Powder Technology. 343, 644-651 (2019).</li><li>Klock, J. H., Wieland, A., Seifert, R., Michaelis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+polymeric+substances+(EPS)+from+cyanobacterial+mats:+characterisation+and+isolation+method+optimisation.">Extracellular polymeric substances (EPS) from cyanobacterial mats: characterisation and isolation method optimisation.</a> Marine Biology. 152 (5), 1077-1085 (2007).</li><li>Delattre, C., Pierre, G., Laroche, C., Michaud, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+extraction+and+characterization+of+microalgal+and+cyanobacterial+exopolysaccharides.">Production, extraction and characterization of microalgal and cyanobacterial exopolysaccharides.</a> Biotechnology Advances. 34 (7), 1159-1179 (2016).</li><li>Costa, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+systems+in+gram-negative+bacteria:+structural+and+mechanistic+insights.">Secretion systems in gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (6), 343-359 (2015).</li><li>Roier, S., Zingl, F. G., Cakar, F., Schild, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicle+biogenesis:+a+new+mechanism+and+its+implications.">Bacterial outer membrane vesicle biogenesis: a new mechanism and its implications.</a> Microbial Cell. 3 (6), 257-259 (2016).</li><li>Sergeyenko, T. V., Los, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+secreted+proteins+of+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+strain+PCC+6803.">Identification of secreted proteins of the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803.</a> FEMS Microbiology Letters. 193 (2), 213-216 (2000).</li><li>Oliveira, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatile+TolC-like+Slr1270+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">The versatile TolC-like Slr1270 in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Environmental Microbiology. 18 (2), 486-502 (2016).</li><li>Flores, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alternative+sigma+factor+SigF+is+a+key+player+in+the+control+of+secretion+mechanisms+in+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">The alternative sigma factor SigF is a key player in the control of secretion mechanisms in Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Environmental Microbiology. 21 (1), 343-359 (2018).</li><li>Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+method+for+determination+of+sugars+and+related+substances.">Colorimetric method for determination of sugars and related substances.</a> Analytical Chemistry. 28 (3), 350-356 (1956).</li><li>Parikh, A., Madamwar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+characterization+of+extracellular+polysaccharides+from+cyanobacteria.">Partial characterization of extracellular polysaccharides from cyanobacteria.</a> Bioresource Technology. 97 (15), 1822-1827 (2006).</li><li>R&#252;hmann, B., Schmid, J., Sieber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+identify+the+unexplored+diversity+of+microbial+exopolysaccharides.">Methods to identify the unexplored diversity of microbial exopolysaccharides.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 565 (2015).</li><li>Pathak, J., Rajneesh, R., Sonker, A. S., Kannaujiya, V. K., Sinha, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterial+extracellular+polysaccharide+sheath+pigment,+scytonemin:+A+novel+multipurpose+pharmacophore.">Cyanobacterial extracellular polysaccharide sheath pigment, scytonemin: A novel multipurpose pharmacophore.</a> Marine Glycobiology. , 343-358 (2016).</li><li>Nguyen, A. T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performances+of+different+protocols+for+exocellular+polysaccharides+extraction+from+milk+acid+gels:+Application+to+yogurt.">Performances of different protocols for exocellular polysaccharides extraction from milk acid gels: Application to yogurt.</a> Food Chemistry. 239, 742-750 (2018).</li><li>Jamshidian, H., Shojaosadati, S. A., Mousavi, S. M., Soudi, M. R., Vilaplana, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+of+recovery+procedures+on+structural+and+rheological+properties+of+schizophyllan+produced+from+date+syrup.">Implications of recovery procedures on structural and rheological properties of schizophyllan produced from date syrup.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 105, 36-44 (2017).</li><li>Couto, N., Schooling, S. R., Dutcher, J. R., Barber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+profiles+of+outer+membrane+vesicles+and+extracellular+matrix+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Proteome profiles of outer membrane vesicles and extracellular matrix of Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Journal of Proteome Research. 14 (10), 4207-4222 (2015).</li></ol>

細菌分泌機構をよりよく理解し、放出された製品を研究するためには、細胞外細菌環境に存在する生体分子の効率的な単離と分析を実証することが極めて重要です(放出など)炭水化物ポリマーおよびタンパク質)。
シアノバクテリア細胞外炭水化物ポリマーは、主にその組成1を構成する異なる単糖類の数および割合に起因する非常に複雑である。これら?...

シアノバクテリアは、有望なバイオテクノロジー/バイオメディカルアプリケーションを持つ天然物の多産源として広く認識されています。そのため、シアノバクテリアの分泌機構を理解し、抽出・回収方法の最適化を行うには、効率的な微生物細胞工場としてシアノバクテリアを実装することが不可欠です。
多くのシアノバクテリア株は、細胞外高分子物質(EPS)を産生することができ、主にヘテロ多糖類によって形成され、細胞表面に関連したままであるか、または培地1に放出される。これらの放出された炭水化物ポリマーは、他の細菌のものと比較して特徴があり、幅広い用途(例えば、抗ウイルス剤2、免疫刺激3、抗酸化4、抗酸化剤)に適しています。金属キレート5、乳化6、および薬物送達剤7、8)。これらのポリマーの単離のための方法論は、主に収率の向上に寄与するだけでなく、得られたポリマーの純度および特定の物理的特性の増加に寄与する9.ポリマーの単離のためのこれらの方法の大半は、ポリマーの強いアニオン性質9、10のために容易に達成される培養培地からの降水戦略に依存する。さらに、沈殿工程で使用される溶媒の除去は、蒸発および/または凍結乾燥によって迅速に達成することができる。予見された用途に応じて、トリクロロ酢酸(TCA)処理、濾過、またはサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を含む最終製品を調整するために、ポリマー沈殿後または前に異なるステップを結合することができます。列浄化10.
シアノバクテリアはまた、膜トランスポーター(古典的)11または小胞(非古典的)12に媒介される経路を介してタンパク質の広い範囲を分泌することができる。したがって、シアノバクテリアエキソプロテオームの分析は、シアノバクテリアタンパク質分泌機構を理解/操作し、これらのタンパク質の特異的な細胞外機能を理解するために不可欠なツールを構成する。分泌タンパク質の豊富さは比較的低いので、エキソプロテオームの信頼性の高い単離および分析は、細胞外milieuの濃度を必要とする。加えて、他の物理的または化学的ステップ(例えば、遠心分離、濾過、またはタンパク質沈殿)は、得られるエキソプロテオームの品質を最適化し、タンパク質含有量13を濃縮し、汚染物質の存在を回避し得る(例えば、顔料、炭水化物など)14歳,15またはサンプル中の細胞内タンパク質の優位性。しかし、これらのステップの一部は、検出可能なタンパク質のセットを制限し、偏った分析につながる可能性があります。
本研究では、シアノバクテリア培養培地から放出された炭水化物ポリマーとエキソプロテオームを単離するための効率的なプロトコルについて説明する。これらのプロトコルは、ここで説明する基本的な手順を維持しながら、研究の特定の目的とユーザーのニーズに簡単に適応できます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1393px;" width="1392">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Dialysis membranes</td>
			<td style="width:191px;">Medicell Membranes Ltd&#160;</td>
			<td style="width:119px;">DTV.12000.07</td>
			<td style="width:777px;">Visking Tubing Size 7, Dia 23.8 mm, Width 39-41 mm 30m Roll&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Ethanol 96%</td>
			<td style="width:191px;">AGA - &#193;lcool e G&#233;neros Alimentares, S.A.</td>
			<td style="width:119px;">4.000.02.02.00</td>
			<td>Fermentation ethyl alcohol 96% AGA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">PES Filter 0.2 &#956;m</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific, Lda</td>
			<td style="width:119px;">15206869</td>
			<td>Syringe filter polystyrene 33MM 0.2&#181;M STR&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Amicon Ultra-15, Ultracel-3K</td>
			<td style="width:191px;">Merck Millipore Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">UFC900324</td>
			<td>Centrifugal filters with a nominal molecular weight cut-off of 3 kDa</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Thermo Scientific&#160;Pierce BCA Protein Assay</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific, Lda</td>
			<td style="width:119px;">10741395</td>
			<td>Green-to-blue, precise, detergent-compatible assay reagent to measure total protein concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Brillant Blue G Colloidal Concentrate&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Sigma Aldrich Qu&#237;mica SL</td>
			<td style="width:119px;">B2025-1EA</td>
			<td>Coomassie blue&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

looking outwards: isolation of cyanobacterial released carbohydrate polymers and proteins

シアノバクテリアは、ヘテロ多糖やタンパク質などの細胞外環境に幅広い生体分子を積極的に分泌することができます。これらの生体分子の同定と特徴付けは、それらの分泌経路に関する知識を改善し、それらを操作するのに役立ちます。さらに、これらの生体分子のいくつかは、バイオテクノロジーの応用の面でも興味深い。ここで説明するシアノバクテリア放出炭水化物ポリマーおよびタンパク質の容易かつ迅速な単離のための2つのプロトコルがある。放出された炭水化物ポリマーの単離方法は、有機溶媒を用いた水溶液中の多糖類の従来の沈殿技術に基づいている。この方法は、ポリマーの特性を保持し、同時に細胞破片および培養培地からの汚染物質の存在を回避する。プロセスの終わりに、凍結乾燥ポリマーは、使用または特徴付けされる準備ができているか、または最終意図された使用に応じて、更なる精製のラウンドを受けることができる。シアノバクテリアエキソプロテオームの単離に関して、この技術は遠心分離および濾過による主要な汚染物質の除去後の無細胞培地の濃度に基づいている。この戦略は、膜トランスポーターまたは外膜小胞を介して細胞外のmilieuに達するタンパク質の信頼性の高い単離を可能にします。これらのタンパク質は、その後、標準的な質量分析技術を使用して同定することができる。ここで提示されるプロトコルは、幅広いシアノバクテリアだけでなく、他の細菌株にも適用することができる。さらに、これらの手順は、製品の最終使用、必要な純度、および細菌株に応じて容易に調整することができます。

シアノバクテリア培養物から放出された炭水化物ポリマーを抽出するために記載された方法の概略表現が図1に示されている。中等度のEPS生産者シアノバクテリウムシネコシスティススティスsp.PCC 6803および効率的なEPS生産者シアノテスsp. CCY 0110からの沈殿ポリマーは、図2に示されている。図3では、汚染度の異?...

Watch this Scientific Journal Video about Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins at JoVE.com

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

外向きに見る:シアノバクテリア放出炭水化物ポリマーとタンパク質の単離

ここで、シアノバクテリア放出炭水化物ポリマーの単離およびエキソプロテオームの単離に関するプロトコルが記載されている。両方の手順は、さらなる分析または用途に使用できる高純度のポリマーまたはタンパク質を得るための重要なステップを具体化します。それらはまた特定のユーザーの必要性に従って容易に合わせることができる。

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

我々が開発したこれらのプロトコルは、シアノバクテリアとその放出産物、すなわち細胞外炭水化物ポリマーおよびタンパク質の分泌メカニズムを研究するために重要である。生成された知識は、我々はいくつかのアプリケーション、すなわちバイオテクノロジーとバイオメディカルアプリケーションのためにこれらの製品をカスタマイズすることができます。これらのプロトコルは非常に簡単です。それらは生産生物、ユーザーの必要性、およびプロダクトの最終的な適用に従って合わせることができる。これらのプロトコルの主な利点は、他の生物系、特に他の細菌に容易に適応できることである。これらのプロトコルは簡単です。しかし、細菌株または必要な純度に応じて、いくつかの変化を導入する必要があるかもしれません。まず、シアノバクテリア株を標準的な条件下で栽培する。標準プロトコルを使用して成長を測定します。次に、培養液を透析膜に移し、連続撹拌しながら24時間、最低10容量の脱イオン水に対して透析を行う。摂氏4度で15,000倍gの培養物を15分間遠心する。上清を新しいバイアルに移し、ペレットを捨てます。遠心分離機は、細胞壁の破片またはリポ多糖類などの汚染物質を除去するために、摂氏4度で20,000倍のgで再び15分間行った。遠心分離後、上清をガラスビーカーに移し、ペレットを捨てる。ポリマーを沈殿させるために、上清に96%エタノールの2つのボリュームを加え、一晩摂氏4度で懸濁液をインキュベートする。沈殿ポリマーの少量または目に見えない量の場合、25分間摂氏4度で13,000倍gの懸濁液を遠心分離する。上清を静かに捨て、ペレットをオートクレーブ脱イオン水の1~2ミリリットルで再懸濁する。水性懸濁液をバイアルに移します。目に見える、大量の沈殿ポリマーについては、滅菌金属鉗子を介して沈殿させたポリマーをバイアルに集める。ポリマーを絞り、余分なエタノールを捨てる。凍結乾燥と呼ばれる凍結乾燥プロセスを実行するには、沈殿したポリマーを一晩マイナス80度に保ちます。ポリマーを少なくとも48時間凍結乾燥する。次いで、乾燥したポリマーを、さらに使用するまで室温でデシケータに保管する。培地を濃縮するために、まず、標準的な条件下でシアノバクテリアを栽培する。シアノバクテリウムの成長を標準的な手順で監視します。次いで、室温で4,000倍gの培養物を10分間遠心する。上清をフラスコに移し、細胞ペレットを捨てる。次に、0.2ミクロンの細孔サイズフィルターを介してデカン化された培地をフィルター処理します。培地を約500倍に濃縮するには、3キロダルトンから遠心分離器4、000倍g、摂氏15度の公称分子量カットオフを有する遠心濃縮器を、1回の遠心分離ラウンドあたり最大1時間使用する。遠心分離後、フィルター装置サンプルリザーバーの壁を濃縮サンプルでリンスし、その内容をマイクロ遠心チューブに移します。オートクレーブ培養培地を用いてフィルター装置サンプルリザーバの追加洗浄工程を行い、最大エキソプロテオーム回収を確実に行う。次に、エキソプロテオームサンプルをマイナス20°Cで保存し、さらに使用するまで保管します。エタノールは、ポリマー沈殿と収率を最適化するために精力的に添加する必要があります。沈殿したポリマーを遠心分離した後、上清の廃棄は、フラスコの壁に緩やかに付着し得るペレットの再懸濁を避けるために慎重に行われるべきである。手動でろ過を行う場合は、フィルター膜を壊さないように優しくする必要があります。沈殿したポリマーの中には、主にシネコシスティスのEPSの場合など、フラスコの壁部に比べ、遠心分離後にのみ見ることができるものがあります。他の場合には、シアノテーゼポリマーのような、沈殿直後にガラスビーカーに浮遊するポリマー塊を見ることができる。ポリマーの色素沈着(通常は白色または薄茶色)を変えるので、一部の汚染は、ポリマー凍結乾燥後にマクロ的に容易に検出することができる。オレンジ色のポリマーは、カロテノイドまたはこれらの顔料を含む構造で汚染されています。例えば、緑色のポリマーは、細胞の破片およびクロロフィルで汚染される。エキソプロテオームは、細菌株によって大きく異なる場合があります。例えば、単細胞シアノバクテリウムからのエキソプロテオームと糸状株からのエキソプロテオームを参照してください。エキソプロテオーム濃縮サンプル中の多糖類の多量は、エキソプロテオーム分析を妨げる可能性があります。例えば、タンパク質の分離を遅らせ、タンパク質のマスクを少なくすることができます。ユーザーは、組成物、物理的/化学的特性、試験ポリマー生物学的活性、または改変ポリマー成分の観点からポリマーを特徴付けることができます。タンパク質同定のために、ゲルおよび質量分析におけるタンパク質の分離を行うことができる。そして、小胞の分離のために、エキソプロテオームの超遠心分離を行う必要があります。我々のグループでは、これらのプロトコルは、バイオレメディエーションや抗腫瘍剤または薬物送達剤など、異なる分野におけるシアノバクテリア分泌機構または細胞外炭水化物ポリマーの応用を解明する道を既に開いている。

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Biochemistry of the Cell

SCIENTISTS IN ACTION

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

新規不溶性発色基質アッセイキットを使用した炭水化物分解酵素のハイスループットスクリーニング

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

アイスアフィニティー精製を用いた氷再結晶阻害とアイソレーションの評価による植物の氷結合タンパク質の同定

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

複数のマウス組織からの中間体フィラメントタンパク質の単離による老化に関連する翻訳後修飾の研究

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

炭水化物輸送基質結合タンパク質 SP0092 の生化学的および構造特性

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

動的タンパク質複合体の分析の組み立てし、質量分析法と電子顕微鏡を用いた Biolayer 干渉法によるバイオ センサーから解放

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

腎糸球体と腎糸球体細胞表面タンパク質の標識体内の分離

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

蛍光タンパク質のポリアクリルアミドゲルの銀製の汚損

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Interfacial Molecular-level Structures of Polymers and Biomacromolecules Revealed via Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy

サム周波数生成振動分光法で明らかになったポリマーと生体マクロ分子の界面分子レベル構造

As a second-order nonlinear optical spectroscopy, sum frequency generation (SFG) vibrational spectroscopy has widely been used in investigating various ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

蛍光相撲捕集タンパク質を用いた SUMO 修飾タンパク質の局在化

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Preparation of High-Quality Fermented Fish Product

高品質発酵魚製品の調製

This protocol provides a method for preparation of industrialized fermented fish product with sturgeon (Aquilaria sinensis) meat product. The procedures ...