Name: looking outwards: isolation of cyanobacterial released carbohydrate polymers and proteins
Uploaded: 2019-05-27T13:00:00
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이 작품은 FUNdo Europeu de Desenvolvimento 지역 (FEDER) 기금을 통해 COMPETE 2020 - 경쟁력 및 국제화를위한 오페라 프로그램 (POCI), 포르투갈 2020, FCT를 통해 포르투갈 어 펀드에 의해 지원되었습니다 - Fundação para a Ciência e Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino 슈페리어 프로젝트 POCI-01-0145-FEDER-028779 및 보조금 SFRH/BD/99715/2014(CF).

1. 시아노박테리아 방출 탄수화물 폴리머 분리
<ol><li>
폴리머 분리 및 오염 물질 제거
	<ol>
<li>표준 조건하에서 시아노박테리아 균주를 배양[예를 들어, 12h 빛 하에서 30°C(50 μEm-2s-1)/12h 암흑 요법, 150 rpm에서 궤도 흔들림]. 표준 프로토콜을 이용한 성장을 측정[예를 들어, 730 nm(OD730nm)에서의광학 밀도), 엽록소 a,건식 중량 등], 페놀-황산 방법에 따라 방출?...

<ol>
	<li>Pereira, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexity+of+cyanobacterial+exopolysaccharides:+composition,+structures,+inducing+factors+and+putative+genes+involved+in+their+biosynthesis+and+assembly.">Complexity of cyanobacterial exopolysaccharides: composition, structures, inducing factors and putative genes involved in their biosynthesis and assembly.</a> FEMS Microbiology Reviews. 33 (5), 917-941 (2009).</li><li>Kanekiyo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+an+Antiviral+Polysaccharide,+Nostoflan,+from+a+Terrestrial+Cyanobacterium,+Nostoc+flagelliforme.">Isolation of an Antiviral Polysaccharide, Nostoflan, from a Terrestrial Cyanobacterium, Nostoc flagelliforme.</a> Journal of Natural Products. 68 (7), 1037-1041 (2005).</li><li>L&#248;bner, M., Walsted, A., Larsen, R., Bendtzen, K., Nielsen, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+human+adaptive+immune+responses+by+administration+of+a+high-molecular-weight+polysaccharide+extract+from+the+cyanobacterium+Arthrospira+platensis.">Enhancement of human adaptive immune responses by administration of a high-molecular-weight polysaccharide extract from the cyanobacterium Arthrospira platensis.</a> Journal of Medicinal Food. 11 (2), 313-322 (2008).</li><li>Wang, H. B., Wu, S. J., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+polysaccharides+from+cyanobacteria+Nostoc+commune+and+their+antioxidant+activities.">Preparation of polysaccharides from cyanobacteria Nostoc commune and their antioxidant activities.</a> Carbohydrate Polymers. 99, 553-555 (2014).</li><li>Ozturk, S., Aslim, B., Suludere, Z., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+removal+of+cyanobacterial+exopolysaccharides+by+uronic+acid+content+and+monosaccharide+composition.">Metal removal of cyanobacterial exopolysaccharides by uronic acid content and monosaccharide composition.</a> Carbohydrate Polymers. 101, 265-271 (2014).</li><li>Han, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emulsifying,+flocculating,+and+physicochemical+properties+of+exopolysaccharide+produced+by+cyanobacterium+Nostoc+flagelliforme.">Emulsifying, flocculating, and physicochemical properties of exopolysaccharide produced by cyanobacterium Nostoc flagelliforme.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 172 (1), 36-49 (2014).</li><li>Leite, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterium&#8208;Derived+Extracellular+Carbohydrate+Polymer+for+the+Controlled+Delivery+of+Functional+Proteins.">Cyanobacterium&#8208;Derived Extracellular Carbohydrate Polymer for the Controlled Delivery of Functional Proteins.</a> Macromolecular Bioscience. 17 (2), 1600206 (2017).</li><li>Estevinho, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+cyanobacterial+extracellular+polymeric+substance+in+the+microencapsulation+of+vitamin+B12.">Application of a cyanobacterial extracellular polymeric substance in the microencapsulation of vitamin B12.</a> Powder Technology. 343, 644-651 (2019).</li><li>Klock, J. H., Wieland, A., Seifert, R., Michaelis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+polymeric+substances+(EPS)+from+cyanobacterial+mats:+characterisation+and+isolation+method+optimisation.">Extracellular polymeric substances (EPS) from cyanobacterial mats: characterisation and isolation method optimisation.</a> Marine Biology. 152 (5), 1077-1085 (2007).</li><li>Delattre, C., Pierre, G., Laroche, C., Michaud, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+extraction+and+characterization+of+microalgal+and+cyanobacterial+exopolysaccharides.">Production, extraction and characterization of microalgal and cyanobacterial exopolysaccharides.</a> Biotechnology Advances. 34 (7), 1159-1179 (2016).</li><li>Costa, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+systems+in+gram-negative+bacteria:+structural+and+mechanistic+insights.">Secretion systems in gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (6), 343-359 (2015).</li><li>Roier, S., Zingl, F. G., Cakar, F., Schild, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicle+biogenesis:+a+new+mechanism+and+its+implications.">Bacterial outer membrane vesicle biogenesis: a new mechanism and its implications.</a> Microbial Cell. 3 (6), 257-259 (2016).</li><li>Sergeyenko, T. V., Los, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+secreted+proteins+of+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+strain+PCC+6803.">Identification of secreted proteins of the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803.</a> FEMS Microbiology Letters. 193 (2), 213-216 (2000).</li><li>Oliveira, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatile+TolC-like+Slr1270+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">The versatile TolC-like Slr1270 in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Environmental Microbiology. 18 (2), 486-502 (2016).</li><li>Flores, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alternative+sigma+factor+SigF+is+a+key+player+in+the+control+of+secretion+mechanisms+in+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">The alternative sigma factor SigF is a key player in the control of secretion mechanisms in Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Environmental Microbiology. 21 (1), 343-359 (2018).</li><li>Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+method+for+determination+of+sugars+and+related+substances.">Colorimetric method for determination of sugars and related substances.</a> Analytical Chemistry. 28 (3), 350-356 (1956).</li><li>Parikh, A., Madamwar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+characterization+of+extracellular+polysaccharides+from+cyanobacteria.">Partial characterization of extracellular polysaccharides from cyanobacteria.</a> Bioresource Technology. 97 (15), 1822-1827 (2006).</li><li>R&#252;hmann, B., Schmid, J., Sieber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+identify+the+unexplored+diversity+of+microbial+exopolysaccharides.">Methods to identify the unexplored diversity of microbial exopolysaccharides.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 565 (2015).</li><li>Pathak, J., Rajneesh, R., Sonker, A. S., Kannaujiya, V. K., Sinha, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterial+extracellular+polysaccharide+sheath+pigment,+scytonemin:+A+novel+multipurpose+pharmacophore.">Cyanobacterial extracellular polysaccharide sheath pigment, scytonemin: A novel multipurpose pharmacophore.</a> Marine Glycobiology. , 343-358 (2016).</li><li>Nguyen, A. T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performances+of+different+protocols+for+exocellular+polysaccharides+extraction+from+milk+acid+gels:+Application+to+yogurt.">Performances of different protocols for exocellular polysaccharides extraction from milk acid gels: Application to yogurt.</a> Food Chemistry. 239, 742-750 (2018).</li><li>Jamshidian, H., Shojaosadati, S. A., Mousavi, S. M., Soudi, M. R., Vilaplana, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+of+recovery+procedures+on+structural+and+rheological+properties+of+schizophyllan+produced+from+date+syrup.">Implications of recovery procedures on structural and rheological properties of schizophyllan produced from date syrup.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 105, 36-44 (2017).</li><li>Couto, N., Schooling, S. R., Dutcher, J. R., Barber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+profiles+of+outer+membrane+vesicles+and+extracellular+matrix+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Proteome profiles of outer membrane vesicles and extracellular matrix of Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Journal of Proteome Research. 14 (10), 4207-4222 (2015).</li></ol>

세균 분비 메커니즘을 더 잘 이해하고 방출된 제품을 연구하기 위해 세포외 세균 환경에 존재하는 생체 분자의 효율적인 격리 및 분석을 입증하는 것이 매우 중요합니다(예: 방출됨) 탄수화물 중합체 및 단백질).
시아노박테리아 세포외 탄수화물 중합체는 그들의 조성물을 구성하는 상이한 단당류의 수및 비율로 인해 극도로 복잡하다 1. 이러한 고분자 물질?...

시아노박테리아는 유망한 생명공학/생명의학 응용 분야와 함께 천연 제품의 다산 공급원으로 널리 인정받고 있습니다. 따라서, 시아노박테리아 분비 메커니즘을 이해하고 추출/회수 방법의 최적화는 효율적인 미생물 세포 공장으로서 시아노박테리아를 구현하는 데 필수적입니다.
많은 시아노박테리아 균주는 주로 이종대당에 의해 형성된 세포외 고분자 물질(EPS)을 생성할 수 있으며, 이는세포 표면과 연관되거나 배지 1로 방출된다. 이 방출된 탄수화물 중합체는 다른 박테리아에서 그들에 비해 명백한 특징을 가지고 있습니다, 이는 응용의넓은 범위에 적합하게 (예를 들어, 항 바이러스 2, 면역 자극3,항산화44) 금속 킬레이트5, 유화6, 약물 전달 제7,8). 이들 중합체의 분리를 위한 방법론은 크게 수율 향상뿐만 아니라 수득된 폴리머의 증가된 순도 및 특이적 물성에기여한다. 중합체의 분리를 위한 이들 방법의 대부분은 중합체의 강한 음이온 성질9,10으로인해 쉽게 달성되는 배양 배지로부터의 침전 전략에 의존한다. 또한, 침전 단계에서 사용되는 용매의 제거는 증발 및/또는 호혜화에 의해 급속히 달성될 수 있다. 예측 된 응용 프로그램에 따라, 다른 단계는 트리클로로 아세트산 (TCA) 처리, 여과, 또는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 포함하는 최종 제품을 맞추기 위해 중합체 침전 후 또는 전에 결합 될 수있다 열 정제10.
시아노박테리아는 또한 막 수송기(classical)(11) 또는 소포(non-classical)에 의해 매개되는 경로를 통해 광범위한단백질을 분비할 수 있다(12). 따라서, 시아노박테리아 엑소테오솜의 분석은 시아노박테리아 단백질 분비 메커니즘을 이해하고 조작하고 이들 단백질의 특정 세포외 기능을 이해하는 데 필수적인 도구를 구성한다. 탈전의 신뢰할 수있는 격리 및 분석은 분비 된 단백질의 풍부가 상대적으로 낮기 때문에 세포 외 밀리외의 농도를 필요로합니다. 또한, 다른 물리적 또는 화학적 단계(예를 들어, 원심분리, 여과 또는 단백질 침전)는 얻어진 엑소테오므의 품질을 최적화할수 있고, 단백질 함량을 풍부하게 하고, 오염물질의 존재를 피할 수 있다(예를 들어, 안료, 탄수화물 등) 14세 , 샘플에서 세포내 단백질의 우위 또는 15. 그러나, 몇몇은의 이 단계는 또한 편향된 분석으로 이끌어 내는 검출될 수 있는 단백질의 세트를 제한할 수 있습니다.
이 작품은 시안박테리아 배양 배지로부터 방출된 탄수화물 중합체 및 엑소프로테옴의 분리를 위한 효율적인 프로토콜을 설명합니다. 이러한 프로토콜은 여기에 제시된 기본 단계를 유지하면서 연구의 특정 목표및 사용자 요구에 쉽게 적응할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1393px;" width="1392">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Dialysis membranes</td>
			<td style="width:191px;">Medicell Membranes Ltd&#160;</td>
			<td style="width:119px;">DTV.12000.07</td>
			<td style="width:777px;">Visking Tubing Size 7, Dia 23.8 mm, Width 39-41 mm 30m Roll&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Ethanol 96%</td>
			<td style="width:191px;">AGA - &#193;lcool e G&#233;neros Alimentares, S.A.</td>
			<td style="width:119px;">4.000.02.02.00</td>
			<td>Fermentation ethyl alcohol 96% AGA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">PES Filter 0.2 &#956;m</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific, Lda</td>
			<td style="width:119px;">15206869</td>
			<td>Syringe filter polystyrene 33MM 0.2&#181;M STR&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Amicon Ultra-15, Ultracel-3K</td>
			<td style="width:191px;">Merck Millipore Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">UFC900324</td>
			<td>Centrifugal filters with a nominal molecular weight cut-off of 3 kDa</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Thermo Scientific&#160;Pierce BCA Protein Assay</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific, Lda</td>
			<td style="width:119px;">10741395</td>
			<td>Green-to-blue, precise, detergent-compatible assay reagent to measure total protein concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Brillant Blue G Colloidal Concentrate&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Sigma Aldrich Qu&#237;mica SL</td>
			<td style="width:119px;">B2025-1EA</td>
			<td>Coomassie blue&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

looking outwards: isolation of cyanobacterial released carbohydrate polymers and proteins

시아노박테리아는 이종대당및단백질과같은세포외환경으로광범위한생체분자를능으로분비할수있습니다. 이 생체 분자의 확인 및 특성화는 그들의 분비 경로에 대한 지식을 향상시키고 그(것)들을 조작하는 것을 도울 수 있습니다. 또한, 이러한 생체 분자 중 일부는 생명 공학 응용 분야에서도 흥미롭습니다. 여기서 설명된 것은 시안박테리아 방출 탄수화물 중합체 및 단백질의 쉽고 신속한 분리를 위한 두 가지 프로토콜이다. 방출된 탄수화물 중합체의 분리 방법은 유기 용매를 사용하는 수성 용액에서 다당류의 기존 침전 기술을 기반으로합니다. 이 방법은 중합체의 특성을 보존하고 동시에 세포 파편 및 배양 배지에서 오염 물질의 존재를 방지한다. 공정의 끝에서, 용약화된 중합체는 최종 의도된 용도에 따라 사용 되거나 특성화될 준비가 되거나 추가의 정제를 실시할 수 있다. 시아노박테리아 엑소프로테오메의 분리에 관해서는, 이 기술은 원심분리 및 여과에 의한 주요 오염물질을 제거한 후 무세포 배지의 농도에 기초한다. 이 전략은 막 수송기 또는 외부 막 소포를 통해 세포외 milieu에 도달하는 단백질의 믿을 수 있는 격리를 허용합니다. 이 단백질은 표준 질량 분석 기술을 사용하여 이후에 확인될 수 있습니다. 여기에 제시 된 프로토콜은 광범위한 시아노 박테리아뿐만 아니라 다른 박테리아 균주에도 적용 될 수 있습니다. 더욱이, 이러한 절차는 제품의 최종 사용, 필요한 순도 및 세균 균주에 따라 용이하게 맞춤화될 수 있다.

시아노박테리아 배양물로부터 방출된 탄수화물 중합체를 추출하기 위해 기술된 방법의 개략적 표현은 도1에 도시되어 있다. 적당한 EPS 생산자시아노박테리움 시네시스ss. PCC 6803 및 효율적인 EPS 생산자 시아노테스 sp. CCY 0110으로부터의 침전된 중합체는 도2에 도시되어 있다. 그림3에서는 다른 오염 도를 가진 동색화?...

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Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

바깥쪽을 바라보며: 시안박테리아 방출 탄수화물 고분자 및 단백질 의 분리

여기서, 시안박테리아 방출 된 탄수화물 중합체의 분리 및 그들의 엑소프로테옴의 격리에 대한 프로토콜이 설명된다. 두 절차 모두 추가 분석 또는 응용 분야에 사용할 수 있는 고순도의 중합체 또는 단백질을 얻기 위한 주요 단계를 구현합니다. 또한 특정 사용자 요구에 따라 쉽게 조정할 수 있습니다.

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

우리가 개발한 이 프로토콜은 시아노박테리아와 그들의 방출된 제품, 즉 세포외 탄수화물 폴리머 및 단백질에 있는 분비 기계장치를 공부하는 것이 중요합니다. 생성 된 지식은 우리가 여러 응용 프로그램에 대한 이러한 제품을 사용자 정의 할 수 있습니다, 즉 생명 공학 및 생물 의학 응용 프로그램. 이러한 프로토콜은 매우 간단합니다.그들은 생산 유기체, 사용자의 요구 및 제품의 최종 응용 프로그램에 따라 조정할 수 있습니다. 이러한 프로토콜의 주요 장점은 다른 살아있는 시스템, 특히 다른 박테리아에 쉽게 적응할 수 있다는 것입니다. 이러한 프로토콜은 쉽습니다.그러나, 하나는 세균성 긴장 또는 요구되는 순도의 정도에 따라 몇몇 변경을 소개할 필요가 있을 수 있습니다. 시작하려면 표준 조건에서 치아노균 균주를 재배하십시오. 표준 프로토콜을 사용하여 성장을 측정합니다.다음으로, 투석막으로 문화를 옮기고, 연속 교반으로 24시간 동안 최소 10권의 탈온수에 투석한다. 원심 분리는 15 분 동안 섭씨 4도에서 15, 000 배 g에서 문화를 원심 분리합니다. 상체를 새로운 바이알로 옮기고 펠릿을 버립니다.원심분리기는 15분 동안 섭씨 4도에서 20, 000배 g에서 다시 20g, 세포벽 파편 또는 리포폴리사카라이드와 같은 오염물질을 제거합니다. 원심 분리 후, 상체를 유리 비커로 옮기고 펠릿을 버린다. 중합체를 침전시키기 위해, 상체에 96%에탄올의 두 부피를 추가하고, 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 서스펜션을 배양한다.작거나 눈에 보이지 않는 양의 침전 된 폴리머의 경우, 25 분 동안 섭씨 4도에서 13, 000 배 에서 서스펜션을 원심 분리합니다. 상체를 부드럽게 버리고, 오토클레이브 디온화 된 물의 1 ~ 2 밀리리터에 펠릿을 다시 놓습니다. 수성 서스펜션을 바이알로 옮기는다.눈에 띄는 다량의 침전 된 폴리머의 경우 멸균 금속 집게를 가진 침전 된 폴리머를 유리병에 수집합니다. 중합체를 짜내고 과도한 에탄올을 버린다. 동결 건조라고도 하는 리오필화 공정을 수행하려면, 하룻밤 사이에 침전된 폴리머로 바이알을 영하 80도에서 유지한다.적어도 48 시간 동안 중합체를 lyophilize. 그런 다음, 건조 된 폴리머를 실온에서 추가 사용까지 저장합니다. 매체를 농축하려면 먼저 표준 조건하에서 시아노박테리아를 재배합니다.표준 절차를 사용하여 시아노박테리움의 성장을 모니터링합니다. 그런 다음, 원심 분리는 10 분 동안 실온에서 4, 000 배 g에서 배양합니다. 상체를 플라스크로 옮기고 셀 펠릿을 폐기합니다.다음으로, 0.2미크론 모공 크기 필터를 통해 탈란된 매체를 필터링한다. 배지를 약 500회 농축하려면 원심 4, 000배, 섭씨 15도까지 3킬로달톤의 명목 분자량 컷오프가 있는 원심 농축기를 최대 1시간 원심 분리 라운드에 사용하십시오. 원심분리 후, 필터 장치 샘플 저장소의 벽을 농축 된 샘플로 헹구고 마이크로 원심 분리기 튜브로 함량을 전달합니다.최대 외프로테아메 회수를 보장하기 위해 오토클레이브 배양 배지를 사용하여 필터 장치 샘플 저장소의 추가 세척 단계를 수행한다. 그런 다음 외음항샘플을 영하 20도에서 추가 사용까지 저장합니다. 에탄올은 중합체 강수량과 수율을 최적화하기 위해 적극적으로 첨가되어야 합니다.침전된 중합체를 원심분리한 후, 플라스크 벽에 느슨하게 부착될 수 있는 펠릿의 재발을 피하기 위해 상체부의 폐기를 신중하게 해야 한다. 수동 여과가 수행되면 필터 멤브레인을 깨는 것을 피하기 위해 부드럽게해야합니다. 일부 침전 된 폴리머는 시에코시스티스의 EPS의 경우와 같은 플라스크의 벽에 주로 원심 분리 후에만 볼 수 있습니다.다른 경우에는, 시아노시스 폴리머와 같은, 강수직후 유리 비커에 떠있는 폴리머 덩어리를 볼 수 있다. 일부 오염은 폴리머 색소 침착, 일반적으로 흰색 또는 밝은 갈색을 변화시킬 것이기 때문에 폴리머 lyophilization 후에 매크로로 쉽게 검출될 수 있다. 주황색 폴리머는 카로티노이드 또는 이러한 안료를 포함하는 구조로 오염됩니다.예를 들어, 녹색 폴리머는 세포 파편과 엽록소로 오염됩니다. 외프로테옴은 세균균에 따라 크게 달라질 수 있습니다. 예를 들어, 단세포 시아노박테리움과 필라멘트 균주에서 외프로테아메를 참조하십시오.외프로테오메 농축 시료에서 다당류의 양이 많음은 외음류 분석을 저해할 수 있다. 예를 들어, 단백질 분리를 지연시키고 덜 풍부한 단백질을 마스크할 수 있습니다. 사용자는 조성물, 물리적/화학적 특성, 시험 폴리머 생물학적 활성 또는 변형된 폴리머 성분의 관점에서 폴리머를 특성화할 수 있다.단백질 식별을 위해 젤 및 질량 분석에서 단백질의 분리를 수행 할 수 있습니다. 그리고 소포의 분리를 위해, 외막의 초원심분리가 수행되어야 한다. 우리 그룹에서, 이러한 프로토콜은 이미 생물학적 제제 또는 항종양 또는 약물 전달 제로서와 같은 다른 분야에서 세포외 탄수화물 폴리머의 시아노균 분비 메커니즘 또는 응용 프로그램을 해명하는 길을 열었습니다.

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SCIENTISTS IN ACTION

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

소설 불용성 발색 기질 분석 키트를 사용하여 탄수화물 분해 효소의 높은 처리량 검열

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

연구

생화학

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

식물은 아이스 친화 정제를 사용하여 얼음의 재결정 억제 및 절연의 평가를 통해 단백질을 아이스 결합의 식별

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

노화 관련 post-translational 수정을 공부하기 위해 여러 마우스 조직에서 중간 필라멘트 단백질의 분리

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

탄수화물 전송 기질 바인딩 단백질 SP0092의 생 화 학적 및 구조적 특성

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

동적 단백질 복합물 분석에 조립 하 고 질량 분석 및 전자 현미경을 사용 하 여 Biolayer 간섭계 바이오 센서에서 발표

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

절연 Glomeruli와 비보에 사 세포 표면 단백질의 라벨

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Polyacrylamide 젤에 단백질의 형광은 얼룩

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Interfacial Molecular-level Structures of Polymers and Biomacromolecules Revealed via Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy

합계 주파수 생성 진동 분광법을 통해 밝혀진 중합체 및 생체 거력의 계면 분자 수준 구조

As a second-order nonlinear optical spectroscopy, sum frequency generation (SFG) vibrational spectroscopy has widely been used in investigating various ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

스모를 이용한 스모 변성 단백질의 국 소화-단백질 포착

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Preparation of High-Quality Fermented Fish Product

고품질 발효 생선 제품 준비

This protocol provides a method for preparation of industrialized fermented fish product with sturgeon (Aquilaria sinensis) meat product. The procedures ...