Name: looking outwards: isolation of cyanobacterial released carbohydrate polymers and proteins
Uploaded: 2019-05-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert av Fundo Europeu de Desenvolvimento regionale (FEDER) midler gjennom KONKURRER 2020-Operacional program for konkurranseevne og internasjonalisering (POCI), Portugal 2020, og av portugisiske midler gjennom FCT-Fundação para a Ciência e en Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e ensino overlegen innen rammen av prosjektet POCI-01-0145-FEDER-028779 og Grant SFRH/BD/99715/2014 (CF).

1. Cyanobacterial utgitt karbohydrat polymer isolasjon
<ol><li>
Polymer isolering og fjerning av forurensninger
	<ol>
<li>Dyrke cyanobacterial belastning under standard forhold [f. eks, 30 ° c under en 12 h lys (50 μE m− 2s− 1)/12 h Dark regime, med orbital risting ved 150 RPM]. Mål vekst ved hjelp av standardprotokoller [f. eks optisk tetthet ved 730 NM (OD730nm), klorofyll a, tørr-vekt, etc.], og deretter måle produksjonen av frigitte polysakkarider ...

<ol>
	<li>Pereira, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexity+of+cyanobacterial+exopolysaccharides:+composition,+structures,+inducing+factors+and+putative+genes+involved+in+their+biosynthesis+and+assembly.">Complexity of cyanobacterial exopolysaccharides: composition, structures, inducing factors and putative genes involved in their biosynthesis and assembly.</a> FEMS Microbiology Reviews. 33 (5), 917-941 (2009).</li><li>Kanekiyo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+an+Antiviral+Polysaccharide,+Nostoflan,+from+a+Terrestrial+Cyanobacterium,+Nostoc+flagelliforme.">Isolation of an Antiviral Polysaccharide, Nostoflan, from a Terrestrial Cyanobacterium, Nostoc flagelliforme.</a> Journal of Natural Products. 68 (7), 1037-1041 (2005).</li><li>L&#248;bner, M., Walsted, A., Larsen, R., Bendtzen, K., Nielsen, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+human+adaptive+immune+responses+by+administration+of+a+high-molecular-weight+polysaccharide+extract+from+the+cyanobacterium+Arthrospira+platensis.">Enhancement of human adaptive immune responses by administration of a high-molecular-weight polysaccharide extract from the cyanobacterium Arthrospira platensis.</a> Journal of Medicinal Food. 11 (2), 313-322 (2008).</li><li>Wang, H. B., Wu, S. J., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+polysaccharides+from+cyanobacteria+Nostoc+commune+and+their+antioxidant+activities.">Preparation of polysaccharides from cyanobacteria Nostoc commune and their antioxidant activities.</a> Carbohydrate Polymers. 99, 553-555 (2014).</li><li>Ozturk, S., Aslim, B., Suludere, Z., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+removal+of+cyanobacterial+exopolysaccharides+by+uronic+acid+content+and+monosaccharide+composition.">Metal removal of cyanobacterial exopolysaccharides by uronic acid content and monosaccharide composition.</a> Carbohydrate Polymers. 101, 265-271 (2014).</li><li>Han, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emulsifying,+flocculating,+and+physicochemical+properties+of+exopolysaccharide+produced+by+cyanobacterium+Nostoc+flagelliforme.">Emulsifying, flocculating, and physicochemical properties of exopolysaccharide produced by cyanobacterium Nostoc flagelliforme.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 172 (1), 36-49 (2014).</li><li>Leite, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterium&#8208;Derived+Extracellular+Carbohydrate+Polymer+for+the+Controlled+Delivery+of+Functional+Proteins.">Cyanobacterium&#8208;Derived Extracellular Carbohydrate Polymer for the Controlled Delivery of Functional Proteins.</a> Macromolecular Bioscience. 17 (2), 1600206 (2017).</li><li>Estevinho, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+cyanobacterial+extracellular+polymeric+substance+in+the+microencapsulation+of+vitamin+B12.">Application of a cyanobacterial extracellular polymeric substance in the microencapsulation of vitamin B12.</a> Powder Technology. 343, 644-651 (2019).</li><li>Klock, J. H., Wieland, A., Seifert, R., Michaelis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+polymeric+substances+(EPS)+from+cyanobacterial+mats:+characterisation+and+isolation+method+optimisation.">Extracellular polymeric substances (EPS) from cyanobacterial mats: characterisation and isolation method optimisation.</a> Marine Biology. 152 (5), 1077-1085 (2007).</li><li>Delattre, C., Pierre, G., Laroche, C., Michaud, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+extraction+and+characterization+of+microalgal+and+cyanobacterial+exopolysaccharides.">Production, extraction and characterization of microalgal and cyanobacterial exopolysaccharides.</a> Biotechnology Advances. 34 (7), 1159-1179 (2016).</li><li>Costa, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+systems+in+gram-negative+bacteria:+structural+and+mechanistic+insights.">Secretion systems in gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (6), 343-359 (2015).</li><li>Roier, S., Zingl, F. G., Cakar, F., Schild, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicle+biogenesis:+a+new+mechanism+and+its+implications.">Bacterial outer membrane vesicle biogenesis: a new mechanism and its implications.</a> Microbial Cell. 3 (6), 257-259 (2016).</li><li>Sergeyenko, T. V., Los, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+secreted+proteins+of+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+strain+PCC+6803.">Identification of secreted proteins of the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803.</a> FEMS Microbiology Letters. 193 (2), 213-216 (2000).</li><li>Oliveira, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatile+TolC-like+Slr1270+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">The versatile TolC-like Slr1270 in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Environmental Microbiology. 18 (2), 486-502 (2016).</li><li>Flores, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alternative+sigma+factor+SigF+is+a+key+player+in+the+control+of+secretion+mechanisms+in+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">The alternative sigma factor SigF is a key player in the control of secretion mechanisms in Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Environmental Microbiology. 21 (1), 343-359 (2018).</li><li>Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+method+for+determination+of+sugars+and+related+substances.">Colorimetric method for determination of sugars and related substances.</a> Analytical Chemistry. 28 (3), 350-356 (1956).</li><li>Parikh, A., Madamwar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+characterization+of+extracellular+polysaccharides+from+cyanobacteria.">Partial characterization of extracellular polysaccharides from cyanobacteria.</a> Bioresource Technology. 97 (15), 1822-1827 (2006).</li><li>R&#252;hmann, B., Schmid, J., Sieber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+identify+the+unexplored+diversity+of+microbial+exopolysaccharides.">Methods to identify the unexplored diversity of microbial exopolysaccharides.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 565 (2015).</li><li>Pathak, J., Rajneesh, R., Sonker, A. S., Kannaujiya, V. K., Sinha, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterial+extracellular+polysaccharide+sheath+pigment,+scytonemin:+A+novel+multipurpose+pharmacophore.">Cyanobacterial extracellular polysaccharide sheath pigment, scytonemin: A novel multipurpose pharmacophore.</a> Marine Glycobiology. , 343-358 (2016).</li><li>Nguyen, A. T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performances+of+different+protocols+for+exocellular+polysaccharides+extraction+from+milk+acid+gels:+Application+to+yogurt.">Performances of different protocols for exocellular polysaccharides extraction from milk acid gels: Application to yogurt.</a> Food Chemistry. 239, 742-750 (2018).</li><li>Jamshidian, H., Shojaosadati, S. A., Mousavi, S. M., Soudi, M. R., Vilaplana, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+of+recovery+procedures+on+structural+and+rheological+properties+of+schizophyllan+produced+from+date+syrup.">Implications of recovery procedures on structural and rheological properties of schizophyllan produced from date syrup.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 105, 36-44 (2017).</li><li>Couto, N., Schooling, S. R., Dutcher, J. R., Barber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+profiles+of+outer+membrane+vesicles+and+extracellular+matrix+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Proteome profiles of outer membrane vesicles and extracellular matrix of Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Journal of Proteome Research. 14 (10), 4207-4222 (2015).</li></ol>

For bedre å forstå bakteriell sekresjon mekanismer og studere frigitte produkter, er det av ekstrem viktighet å demonstrere effektiv isolasjon og analyse av biomolekyler stede i ekstracellulære bakterielle miljøet (for eksempel utgitt karbohydrater polymerer og proteiner).
Cyanobacterial ekstracellulære karbohydrat polymerer er svært komplekse, hovedsakelig på grunn av antall og andel av ulike monosakkarider som utgjør deres sammensetning1. Den konvensjonelle m...

Cyanobakterier er allment anerkjent som produktive kilder av naturlige produkter med lovende bioteknologisk/biomedisinsk applikasjoner. Derfor, forståelse cyanobacterial sekresjon mekanismer og optimalisering av utvinning/utvinning metoder er avgjørende for å implementere cyanobakterier som effektive mikrobielle celle fabrikker.
Mange cyanobacterial stammer er i stand til å produsere ekstracellulære polymer stoffer (EPS), hovedsakelig dannet av heteropolysaccharides, som forblir knyttet til celleoverflaten eller slippes ut i mediet1. Disse frigitte karbohydrater polymerer har forskjellige funksjoner i forhold til de fra andre bakterier, som gjør dem egnet for et bredt spekter av applikasjoner (f. eks, antivirale midler2, immunostimulatory3, antioksidant4, metall-chelaterande5, emulgering6, og legemiddellevering agenter7,8). Metodikk for isolering av disse polymerer bidrar i stor grad ikke bare til økt utbytte, men også til økt renhet og de spesifikke fysiske egenskapene til polymer oppnådd9. Et stort flertall av disse metodene for isolering av polymerer stole på nedbør strategier fra kulturen medium som er lett oppnås på grunn av polymer sterke anioniske natur9,10. I tillegg kan fjerning av løsemidler som brukes i nedbørs trinnet raskt oppnås ved fordampning og/eller lyophilization. Avhengig av den forutsett anvendelse, ulike trinn kan kobles enten etter eller før polymer nedbør for å skreddersy det endelige produktet, som inkluderer Trekloredikksyre acid (TCA) behandling, filtrering, eller størrelse eksklusjon kromatografi (SEC) kolonne rensing10.
Cyanobakterier er også i stand til å skille ut et bredt spekter av proteiner gjennom stier avhengig av membran transportører (klassisk)11 eller mediert av blemmer (ikke-klassisk)12. Derfor analyse av cyanobacterial exoproteome utgjør et viktig verktøy, både for å forstå/manipulere cyanobacterial protein sekresjon mekanismer og forstå den spesifikke ekstracellulære funksjon av disse proteinene. Pålitelig isolering og analyse av exoproteomes krever konsentrasjonen av ekstracellulære miljø, siden overflod av utskilles proteiner er relativt lav. I tillegg kan andre fysiske eller kjemiske tiltak (f.eks. sentrifugering, filtrering eller protein nedbør) optimere kvaliteten på exoproteome, berike proteininnholdet13, og unngå tilstedeværelsen av forurensninger (f.eks. pigmenter, karbohydrater, etc.) 14 priser og priser , 15 eller overvekt av intracellulære proteiner i prøvene. Noen av disse trinnene kan imidlertid også begrense settet med proteiner som kan oppdages, noe som fører til en partisk analyse.
Dette arbeidet beskriver effektive protokoller for isolering av frigitte karbohydrat polymerer og exoproteomes fra cyanobakterier kultur medier. Disse protokollene kan enkelt tilpasses til studiet spesifikke mål og brukerbehov, og samtidig opprettholde de grunnleggende trinnene som presenteres her.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1393px;" width="1392">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Dialysis membranes</td>
			<td style="width:191px;">Medicell Membranes Ltd&#160;</td>
			<td style="width:119px;">DTV.12000.07</td>
			<td style="width:777px;">Visking Tubing Size 7, Dia 23.8 mm, Width 39-41 mm 30m Roll&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Ethanol 96%</td>
			<td style="width:191px;">AGA - &#193;lcool e G&#233;neros Alimentares, S.A.</td>
			<td style="width:119px;">4.000.02.02.00</td>
			<td>Fermentation ethyl alcohol 96% AGA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">PES Filter 0.2 &#956;m</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific, Lda</td>
			<td style="width:119px;">15206869</td>
			<td>Syringe filter polystyrene 33MM 0.2&#181;M STR&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Amicon Ultra-15, Ultracel-3K</td>
			<td style="width:191px;">Merck Millipore Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">UFC900324</td>
			<td>Centrifugal filters with a nominal molecular weight cut-off of 3 kDa</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Thermo Scientific&#160;Pierce BCA Protein Assay</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific, Lda</td>
			<td style="width:119px;">10741395</td>
			<td>Green-to-blue, precise, detergent-compatible assay reagent to measure total protein concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Brillant Blue G Colloidal Concentrate&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Sigma Aldrich Qu&#237;mica SL</td>
			<td style="width:119px;">B2025-1EA</td>
			<td>Coomassie blue&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

looking outwards: isolation of cyanobacterial released carbohydrate polymers and proteins

Cyanobakterier kan aktivt skille ut et bredt spekter av biomolekyler inn i ekstracellulære miljø, slik som heteropolysaccharides og proteiner. Identifisering og karakterisering av disse biomolekyler kan forbedre kunnskapen om deres sekresjon trasé og bidra til å manipulere dem. Videre er noen av disse biomolekyler også interessante når det gjelder bioteknologisk applikasjoner. Beskrevet her er to protokoller for enkel og rask isolering av cyanobacterial utgitt karbohydrater polymerer og proteiner. Metoden for isolering av frigitte karbohydrat polymerer er basert på konvensjonelle nedbørs polysakkarider teknikker i vandige oppløsninger ved hjelp av organiske løsemidler. Denne metoden bevarer egenskapene til polymer og samtidig unngår tilstedeværelsen av forurensninger fra celle rusk og kultur medium. På slutten av prosessen, den lyofilisert polymer er klar til å brukes eller karakteriseres eller kan utsettes for ytterligere runder av rensing, avhengig av den endelige tiltenkte bruk. Når det gjelder isolering av cyanobacterial exoproteome, er teknikken basert på konsentrasjonen av celle-fri medium etter fjerning av de store forurensninger av sentrifugering og filtrering. Denne strategien gjør det mulig for pålitelig isolering av proteiner som når det ekstracellulære miljøet via membran transportører eller ytre membran blemmer. Disse proteinene kan senere identifiseres ved hjelp av standard masse massespektrometri teknikker. Protokollene som presenteres her kan brukes ikke bare til et bredt spekter av cyanobakterier, men også til andre bakterielle stammer. Videre disse prosedyrene kan lett skreddersys i henhold til den endelige bruken av produktene, renhet grad nødvendig, og bakteriell belastning.

En skjematisk fremstilling av metoden beskrevet for å utvinne frigitte karbohydrat polymerer fra cyanobacterial kulturer er avbildet i figur 1. Igangsatte polymerer fra den moderate EPS-produsenten cyanobacterium Synechocystis Sp. PCC 6803 og den effektive EPS-produsenten CYANOTHECE Sp. CCY 0110 er vist i figur 2. I Figur 3, lyofilisert polymerer med ulike grader av forurensning er vist, fremhever viktigheten av s...

Watch this Scientific Journal Video about Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins at JoVE.com

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

Looking utover: isolering av Cyanobacterial Released karbohydrater polymerer og proteiner

Her er protokoller for isolering av cyanobacterial utgitt karbohydrat polymerer og isolering av deres exoproteomes er beskrevet. Begge prosedyrene legemliggjøre viktige skritt for å få polymerer eller proteiner med høy renhet grader som kan brukes for videre analyse eller programmer. De kan også enkelt tilpasses i henhold til spesifikke brukerbehov.

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Disse protokollene som vi utviklet er viktige for å studere sekresjonsmekanismene i cyanobakterier og deres utgitte produkter, nemlig de ekstracellulære karbohydratpolymerene og proteinene. Kunnskapen som genereres vil tillate oss å tilpasse disse produktene for flere applikasjoner, nemlig bioteknologiske og biomedisinske applikasjoner. Disse protokollene er veldig greie.De kan skreddersys i henhold til den produserende organismen, brukerens behov og den endelige anvendelsen av produktet. Den største fordelen med disse protokollene er at de lett kan tilpasses andre levende systemer, spesielt til andre bakterier. Disse protokollene er enkle.Imidlertid må man kanskje introdusere noen endringer avhengig av bakteriestammen eller graden av renhet som kreves. For å begynne, dyrke cyanobakteriell belastning under standardforhold. Mål vekst ved hjelp av standardprotokoller.Deretter overfører du kulturen til dialysemembraner, og dialyze mot minst 10 volumer av deionisert vann i 24 timer med kontinuerlig omrøring. Sentrifuge kulturen på 15, 000 ganger g på fire grader Celsius i 15 minutter. Overfør supernatanten til et nytt hetteglass, og kast pelleten.Sentrifuge igjen på 20, 000 ganger g ved fire grader Celsius i 15 minutter for å fjerne forurensninger, for eksempel celleveggrester eller lipopolysakkarider. Etter sentrifugeringen, overfør supernatanten til et glassbeger, og kast pelleten. For å utløse polymeren, tilsett to volumer på 96% etanol til det overnaturlige, og inkuber suspensjonen ved fire grader Celsius over natten.For små eller ikke synlige mengder utfelt polymer, sentrifuger suspensjonen ved 13.000 ganger g ved fire grader Celsius i 25 minutter. Kast forsiktig det overnaturante, og resuspend pellet i en til to milliliter autoklavet avionisert vann. Overfør vandig suspensjon til et hetteglass.For synlige, store mengder utfelt polymer, samle den utfelte polymeren med sterile metall tang til et hetteglass. Klem polymeren, og kast overflødig etanol. For å utføre lyofiliseringsprosessen ellers kjent som frysetørking, hold hetteglassene med den utfelte polymeren på minus 80 grader Celsius over natten.Lyofilisere polymeren i minst 48 timer. Deretter oppbevarer du den tørkede polymeren i en desiccator ved romtemperatur til videre bruk. For å konsentrere mediet, først dyrke cyanobakterier under standard forhold.Overvåk cyanobacterium veksten ved hjelp av standard prosedyrer. Deretter sentrifugere kulturer på 4000 ganger g ved romtemperatur i 10 minutter. Overfør det overnaturlige til en kolbe, og kast cellepelleten.Deretter filtrerer du det dekanterte mediet gjennom et 0,2-mikron porestørrelsesfilter. For å konsentrere mediet ca 500 ganger, bruk sentrifugalkonsentratorer med en nominell molekylvektsreduksjon på tre kilodaltonn til sentrifuge 4, 000 ganger g og 15 grader Celsius i maksimalt en time per sentrifugasjonsrunde. Etter sentrifugering, skyll veggene i filterenhetens prøvereservoar med den konsentrerte prøven, og overfør innholdet til et mikrocentrifugerør.Utfør et ekstra vasketrinn i filterenhetsprøvereservoaret med det autoklavekulturmediet for å sikre maksimal eksoproteomgjenvinning. Deretter lagrer du eksoproteomprøvene ved minus 20 grader Celsius til videre bruk. Etanol må tilsettes kraftig for å optimalisere polymer nedbør og utbytte.Etter sentrifugering av den utfelte polymeren, bør kasseringen av supernatanten gjøres nøye for å unngå resuspensjon av pelleten som kan være løst festet på kolbens vegg. Hvis manuell filtrering utføres, bør det være skånsomt å unngå å bryte filtermembranen. Noen utfelte polymerer kan bare være synlige etter sentrifugering, hovedsakelig på kolbens vegger, for eksempel tilfelle av EPS fra Synechocystis.I andre tilfeller, som Cyanothece polymer, er det mulig å se polymerklumpene som flyter i glassbegeret like etter nedbør. Noen forurensninger kan lett oppdages makrooskopisk etter polymerlyofilisering siden de vil endre polymerpigmentering, vanligvis hvit eller lysebrun. Oransje polymerer er forurenset med karotenoider eller strukturer som inneholder disse pigmentene.For eksempel er grønne polymerer forurenset med celleavfall og klorofyll. Exoproteomes kan variere betydelig avhengig av bakteriestammen. Se for eksempel eksoproteomet fra en encellet cyanobacterium og den fra en filamentøs stamme.Den høye mengden polysakkarider i eksoproteomkonsentrerte prøver kan hindre eksoproteomanalysen. For eksempel kan det forsinke proteinseparasjon og maskere mindre rikelig proteiner. Brukeren kan karakterisere polymeren når det gjelder sammensetning, fysiske / kjemiske egenskaper, testpolymer biologisk aktivitet eller modifiserte polymerkomponenter.For proteinidentifikasjon kan separasjon av proteiner i gel og massespektrometri utføres. Og for separasjon av vesikler, bør ultracentrifugation av eksoproteomet utføres. I vår gruppe har disse protokollene allerede banet vei for å avdekke cyanobakterielle sekresjonsmekanismer eller anvendelser av ekstracellulære karbohydratpolymerer på forskjellige felt, for eksempel i bioremediering eller som antitumor- eller legemiddelleveringsagenter.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Biochemistry of the Cell

SCIENTISTS IN ACTION

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

Høy throughput screening av karbohydrat-nedbrytende enzymer Bruke Novel Uløselig kromogen substratmetode Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Identifisering av Plant is-bindende proteiner ved å bedømme is-rekrystallisasjon inhibering og isolering ved bruk av is-affinitetsrensing

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

Isolering av mellomproduktfilamentproteiner fra flere musvæsker til studie aldringsassosierte posttranslatoriske modifikasjoner

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biokjemiske og strukturelle karakteristikk av karbohydrater Transport substrat-binding-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

Analysere dynamisk Protein komplekser sammen på og løslatt fra Biolayer Interferometry Biosensor massespektrometri og elektronmikroskop

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolasjonen av Glomeruli og i Vivo merking av Glomerular celle overflaten proteiner

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Fluorescerende sølv farging av proteiner i polyakrylamid Gels

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Interfacial Molecular-level Structures of Polymers and Biomacromolecules Revealed via Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy

Grenseflate molekylær-nivå strukturer av polymerer og Biomacromolecules avdekket via sum frekvens generasjon vibrasjonen spektroskopi

As a second-order nonlinear optical spectroscopy, sum frequency generation (SFG) vibrational spectroscopy has widely been used in investigating various ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Lokalisering av SUMO-modifisert proteiner bruke fluorescerende Sumo-fangst proteiner

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Preparation of High-Quality Fermented Fish Product

Utarbeidelse av høy kvalitet gjæret fisk produkt

This protocol provides a method for preparation of industrialized fermented fish product with sturgeon (Aquilaria sinensis) meat product. The procedures ...