Name: looking outwards: isolation of cyanobacterial released carbohydrate polymers and proteins
Uploaded: 2019-05-27T13:00:00
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Este trabalho foi financiado pelos fundos do Fundo Europeu de desenvolvimento regional (FEDER) através do programa de competitividade e internacionalização da 2020 concorrência (POCI), Portugal 2020 e dos fundos portugueses através da FCT-Fundação para a ciência e a tecnologia/Ministério da ciência, tecnologia e ensino superior no âmbito do projecto POCI-01-0145-FEDER-028779 e a subvenção SFRH/BD/99715/2014 (CF).

1. cianobactérias liberado isolamento de polímero de carboidratos
<ol><li>
Isolamento de polímeros e remoção de contaminantes
	<ol>
<li>Cultivar a estirpe de cianobactérias em condições padrão [por exemplo, 30 ° c uma luz de 12 h (50 μE m− 2s− 1)/12 h de regime escuro, com agitação orbital a 150 rpm]. Meça o crescimento usando protocolos padrão [por exemplo, densidade ótica em 730 nanômetro (OD730nm), clorofila a, seco-peso, etc.], a seguir...

<ol>
	<li>Pereira, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexity+of+cyanobacterial+exopolysaccharides:+composition,+structures,+inducing+factors+and+putative+genes+involved+in+their+biosynthesis+and+assembly.">Complexity of cyanobacterial exopolysaccharides: composition, structures, inducing factors and putative genes involved in their biosynthesis and assembly.</a> FEMS Microbiology Reviews. 33 (5), 917-941 (2009).</li><li>Kanekiyo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+an+Antiviral+Polysaccharide,+Nostoflan,+from+a+Terrestrial+Cyanobacterium,+Nostoc+flagelliforme.">Isolation of an Antiviral Polysaccharide, Nostoflan, from a Terrestrial Cyanobacterium, Nostoc flagelliforme.</a> Journal of Natural Products. 68 (7), 1037-1041 (2005).</li><li>L&#248;bner, M., Walsted, A., Larsen, R., Bendtzen, K., Nielsen, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+human+adaptive+immune+responses+by+administration+of+a+high-molecular-weight+polysaccharide+extract+from+the+cyanobacterium+Arthrospira+platensis.">Enhancement of human adaptive immune responses by administration of a high-molecular-weight polysaccharide extract from the cyanobacterium Arthrospira platensis.</a> Journal of Medicinal Food. 11 (2), 313-322 (2008).</li><li>Wang, H. B., Wu, S. J., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+polysaccharides+from+cyanobacteria+Nostoc+commune+and+their+antioxidant+activities.">Preparation of polysaccharides from cyanobacteria Nostoc commune and their antioxidant activities.</a> Carbohydrate Polymers. 99, 553-555 (2014).</li><li>Ozturk, S., Aslim, B., Suludere, Z., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+removal+of+cyanobacterial+exopolysaccharides+by+uronic+acid+content+and+monosaccharide+composition.">Metal removal of cyanobacterial exopolysaccharides by uronic acid content and monosaccharide composition.</a> Carbohydrate Polymers. 101, 265-271 (2014).</li><li>Han, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emulsifying,+flocculating,+and+physicochemical+properties+of+exopolysaccharide+produced+by+cyanobacterium+Nostoc+flagelliforme.">Emulsifying, flocculating, and physicochemical properties of exopolysaccharide produced by cyanobacterium Nostoc flagelliforme.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 172 (1), 36-49 (2014).</li><li>Leite, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterium&#8208;Derived+Extracellular+Carbohydrate+Polymer+for+the+Controlled+Delivery+of+Functional+Proteins.">Cyanobacterium&#8208;Derived Extracellular Carbohydrate Polymer for the Controlled Delivery of Functional Proteins.</a> Macromolecular Bioscience. 17 (2), 1600206 (2017).</li><li>Estevinho, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+cyanobacterial+extracellular+polymeric+substance+in+the+microencapsulation+of+vitamin+B12.">Application of a cyanobacterial extracellular polymeric substance in the microencapsulation of vitamin B12.</a> Powder Technology. 343, 644-651 (2019).</li><li>Klock, J. H., Wieland, A., Seifert, R., Michaelis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+polymeric+substances+(EPS)+from+cyanobacterial+mats:+characterisation+and+isolation+method+optimisation.">Extracellular polymeric substances (EPS) from cyanobacterial mats: characterisation and isolation method optimisation.</a> Marine Biology. 152 (5), 1077-1085 (2007).</li><li>Delattre, C., Pierre, G., Laroche, C., Michaud, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+extraction+and+characterization+of+microalgal+and+cyanobacterial+exopolysaccharides.">Production, extraction and characterization of microalgal and cyanobacterial exopolysaccharides.</a> Biotechnology Advances. 34 (7), 1159-1179 (2016).</li><li>Costa, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+systems+in+gram-negative+bacteria:+structural+and+mechanistic+insights.">Secretion systems in gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (6), 343-359 (2015).</li><li>Roier, S., Zingl, F. G., Cakar, F., Schild, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicle+biogenesis:+a+new+mechanism+and+its+implications.">Bacterial outer membrane vesicle biogenesis: a new mechanism and its implications.</a> Microbial Cell. 3 (6), 257-259 (2016).</li><li>Sergeyenko, T. V., Los, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+secreted+proteins+of+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+strain+PCC+6803.">Identification of secreted proteins of the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803.</a> FEMS Microbiology Letters. 193 (2), 213-216 (2000).</li><li>Oliveira, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatile+TolC-like+Slr1270+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">The versatile TolC-like Slr1270 in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Environmental Microbiology. 18 (2), 486-502 (2016).</li><li>Flores, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alternative+sigma+factor+SigF+is+a+key+player+in+the+control+of+secretion+mechanisms+in+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">The alternative sigma factor SigF is a key player in the control of secretion mechanisms in Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Environmental Microbiology. 21 (1), 343-359 (2018).</li><li>Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+method+for+determination+of+sugars+and+related+substances.">Colorimetric method for determination of sugars and related substances.</a> Analytical Chemistry. 28 (3), 350-356 (1956).</li><li>Parikh, A., Madamwar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+characterization+of+extracellular+polysaccharides+from+cyanobacteria.">Partial characterization of extracellular polysaccharides from cyanobacteria.</a> Bioresource Technology. 97 (15), 1822-1827 (2006).</li><li>R&#252;hmann, B., Schmid, J., Sieber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+identify+the+unexplored+diversity+of+microbial+exopolysaccharides.">Methods to identify the unexplored diversity of microbial exopolysaccharides.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 565 (2015).</li><li>Pathak, J., Rajneesh, R., Sonker, A. S., Kannaujiya, V. K., Sinha, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterial+extracellular+polysaccharide+sheath+pigment,+scytonemin:+A+novel+multipurpose+pharmacophore.">Cyanobacterial extracellular polysaccharide sheath pigment, scytonemin: A novel multipurpose pharmacophore.</a> Marine Glycobiology. , 343-358 (2016).</li><li>Nguyen, A. T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performances+of+different+protocols+for+exocellular+polysaccharides+extraction+from+milk+acid+gels:+Application+to+yogurt.">Performances of different protocols for exocellular polysaccharides extraction from milk acid gels: Application to yogurt.</a> Food Chemistry. 239, 742-750 (2018).</li><li>Jamshidian, H., Shojaosadati, S. A., Mousavi, S. M., Soudi, M. R., Vilaplana, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+of+recovery+procedures+on+structural+and+rheological+properties+of+schizophyllan+produced+from+date+syrup.">Implications of recovery procedures on structural and rheological properties of schizophyllan produced from date syrup.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 105, 36-44 (2017).</li><li>Couto, N., Schooling, S. R., Dutcher, J. R., Barber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+profiles+of+outer+membrane+vesicles+and+extracellular+matrix+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Proteome profiles of outer membrane vesicles and extracellular matrix of Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Journal of Proteome Research. 14 (10), 4207-4222 (2015).</li></ol>

Para compreender melhor os mecanismos de secreção bacteriana e estudar os produtos liberados, é de extrema importância demonstrar o isolamento e a análise eficientes das biomoléculas presentes no ambiente bacteriano extracelular (como o liberado polímeros e proteínas de carboidratos).
Os polímeros de carboidratos extracelulares de cianobactérias são extremamente complexos, principalmente devido ao número e proporção de diferentes monossacarídeos que constituem sua composição<s...

As cianobactérias são amplamente reconhecidas como fontes prolíficas de produtos naturais com promissoras aplicações biotecnológicas/biomédicas. Portanto, a compreensão dos mecanismos de secreção de cianobactérias e a otimização dos métodos de extração/recuperação são essenciais para implementar cianobactérias como eficientes fábricas de células microbianas.
Muitas cepas de cianobactérias são capazes de produzir substâncias poliméricos extracelulares (EPS), formadas principalmente por heteropolissacarídeos, que permanecem associadas à superfície celular ou são liberados para o meio1. Estes polímeros de carboidratos liberados têm características distintas em comparação com aqueles de outras bactérias, que os tornam adequados para uma ampla gama de aplicações (por exemplo, antivirais2, imunoterapia Imunoestimulador3, antioxidante4, metal-quelante5, emulsificante6, e agentes de entrega de fármacos7,8). A metodologia para o isolamento desses polímeros contribui, em grande parte, não só para a melhoria da produtividade, mas também para o aumento da pureza e as propriedades físicas específicas do polímero obtido9. A grande maioria destes métodos de isolamento dos polímeros dependem de estratégias de precipitação do meio de cultura que são facilmente realizadas devido à forte natureza aniônica do polímero9,10. Além disso, a remoção dos solventes utilizados na etapa de precipitação pode ser rapidamente alcançada por evaporação e/ou liofilização. Dependendo da aplicação prevista, podem ser acoplados diferentes passos, quer após ou antes da precipitação do polímero, a fim de adaptar o produto final, que incluem o tratamento com ácido tricloroacético (TCA), filtração ou cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) purificação de coluna10.
As cianobactérias também são capazes de secretar uma ampla gama de proteínas através de vias dependentes de transportadores de membrana (clássica)11 ou mediadas por vesículas (não-clássicas)12. Portanto, a análise do exoproteoma cianobactérias constitui uma ferramenta essencial, tanto para compreender/manipular os mecanismos de secreção de proteínas cianobactérias quanto para compreender a função extracelular específica dessas proteínas. A isolação e a análise confiáveis de exoproteomes exigem a concentração do Milieu extracelular, desde que a abundância de proteínas secretado é relativamente baixa. Além disso, outras etapas físicas ou químicas (por exemplo, centrifugação, filtração ou precipitação protéica) podem otimizar a qualidade do exoproteoma obtido, enriquecedora do conteúdo proteico13, e evitando a presença de contaminantes (por exemplo, pigmentos, hidratos de carbono, etc.) 14 anos de , 15 ou a predominância de proteínas intracelulares nas amostras. No entanto, algumas dessas etapas também podem restringir o conjunto de proteínas que podem ser detectadas, levando a uma análise tendenciosa.
Este trabalho descreve protocolos eficientes para o isolamento de polímeros de carboidratos liberados e exoproteomes de meios de cultura de cianobactérias. Esses protocolos podem ser facilmente adaptados aos objetivos específicos do estudo e às necessidades dos usuários, mantendo as etapas básicas aqui apresentadas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1393px;" width="1392">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Dialysis membranes</td>
			<td style="width:191px;">Medicell Membranes Ltd&#160;</td>
			<td style="width:119px;">DTV.12000.07</td>
			<td style="width:777px;">Visking Tubing Size 7, Dia 23.8 mm, Width 39-41 mm 30m Roll&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Ethanol 96%</td>
			<td style="width:191px;">AGA - &#193;lcool e G&#233;neros Alimentares, S.A.</td>
			<td style="width:119px;">4.000.02.02.00</td>
			<td>Fermentation ethyl alcohol 96% AGA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">PES Filter 0.2 &#956;m</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific, Lda</td>
			<td style="width:119px;">15206869</td>
			<td>Syringe filter polystyrene 33MM 0.2&#181;M STR&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Amicon Ultra-15, Ultracel-3K</td>
			<td style="width:191px;">Merck Millipore Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">UFC900324</td>
			<td>Centrifugal filters with a nominal molecular weight cut-off of 3 kDa</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Thermo Scientific&#160;Pierce BCA Protein Assay</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific, Lda</td>
			<td style="width:119px;">10741395</td>
			<td>Green-to-blue, precise, detergent-compatible assay reagent to measure total protein concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Brillant Blue G Colloidal Concentrate&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Sigma Aldrich Qu&#237;mica SL</td>
			<td style="width:119px;">B2025-1EA</td>
			<td>Coomassie blue&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

looking outwards: isolation of cyanobacterial released carbohydrate polymers and proteins

A cianobactéria pode secretar ativamente uma ampla gama de biomoléculas para o ambiente extracelular, como heteropolissacarídeos e proteínas. A identificação e caracterização dessas biomoléculas podem melhorar o conhecimento sobre suas vias de secreção e ajudar a manipulá-las. Além disso, algumas dessas biomoléculas também são interessantes em termos de aplicações biotecnológicas. Descritos aqui estão dois protocolos para o isolamento fácil e rápido de cianobactérias liberado polímeros de carboidratos e proteínas. O método de isolamento de polímeros de carboidratos liberados é baseado em técnicas convencionais de precipitação de polissacarídeos em soluções aquosas utilizando solventes orgânicos. Este método preserva as características do polímero e, simultaneamente, evita a presença de contaminantes de detritos celulares e meio de cultura. No final do processo, o polímero liofilizado está pronto para ser usado ou caracterizado ou pode ser submetido a novas rodadas de purificação, dependendo do uso final pretendido. Em relação ao isolamento do exoproteoma cianobactérias, a técnica baseia-se na concentração do meio livre de células após a remoção dos principais contaminantes por centrifugação e filtração. Essa estratégia permite o isolamento confiável de proteínas que atingem o meio extracelular através de transportadores de membrana ou vesículas de membrana externa. Essas proteínas podem ser posteriormente identificadas usando técnicas de espectrometria de massas padrão. Os protocolos aqui apresentados podem ser aplicados não apenas a uma ampla gama de cianobactérias, mas também a outras cepas bacterianas. Além disso, estes procedimentos podem facilmente ser costurados de acordo com o uso final dos produtos, o grau da pureza exigido, e a tensão bacteriana.

Uma representação esquemática do método descrito para extrair polímeros de carboidratos liberados de culturas de cianobactérias é descrita na Figura 1. Os polímeros precipitados do moderado produtor de EPS cianobactéria synechocystis SP. PCC 6803 e o eficiente produtor de EPS cyanothece SP. CCY 0110 são mostrados na Figura 2. Na Figura 3, são mostrados polímeros liofilizados com diferentes graus de cont...

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Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

Olhando para fora: isolamento de cianobactérias liberado polímeros de carboidratos e proteínas

Aqui, os protocolos para o isolamento de cianobactérias liberado polímeros de carboidratos e isolamento de seus exoproteomes são descritos. Ambos os procedimentos incorporam etapas-chave para obter polímeros ou proteínas com graus de alta pureza que podem ser usados para posterior análise ou aplicações. Eles também podem ser facilmente adaptados de acordo com as necessidades específicas do usuário.

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Esses protocolos que desenvolvemos são importantes para estudar os mecanismos de secreção em cianobactérias e seus produtos liberados, ou seja, os polímeros e proteínas de carboidratos extracelulares. O conhecimento gerado nos permitirá personalizar esses produtos para diversas aplicações, ou seja, aplicações biotecnológicas e biomédicas. Esses protocolos são muito simples.Eles podem ser adaptados de acordo com o organismo produtor, as necessidades do usuário e a aplicação final do produto. A principal vantagem desses protocolos é que eles podem ser facilmente adaptados a outros sistemas vivos, em particular a outras bactérias. Esses protocolos são fáceis.No entanto, pode-se precisar introduzir algumas alterações dependendo da cepa bacteriana ou do grau de pureza necessário. Para começar, cultive a cepa cianobacteriana em condições normais. Medir o crescimento usando protocolos padrão.Em seguida, transfira a cultura para membranas de diálise, e diálise contra um mínimo de 10 volumes de água deionizada por 24 horas com agitação contínua. Centrifugar a cultura a 15.000 vezes g a quatro graus Celsius por 15 minutos. Transfira o supernatante para um novo frasco, e descarte a pelota.Centrífuga novamente a 20.000 vezes g a quatro graus Celsius por 15 minutos para remover contaminantes, como detritos de parede celular ou lipopólises. Após a centrifugação, transfira o supernatante para um béquer de vidro, e descarte a pelota. Para precipitar o polímero, adicione dois volumes de 96% de etanol ao supernascido e incuba a suspensão a quatro graus Celsius durante a noite.Para pequenas ou não quantidades visíveis de polímero precipitado, centrifugar a suspensão a 13.000 vezes g a quatro graus Celsius por 25 minutos. Descarte suavemente o supernasciente, e resuspenque a pelota em um a dois mililitros de água deionizada autoclavada. Transfira a suspensão aquosa para um frasco.Para visível, grandes quantidades de polímero precipitado, colete o polímero precipitado com fórceps metálicos estéreis em um frasco. Aperte o polímero e descarte o excesso de etanol. Para realizar o processo de liofilização também conhecido como secagem congelante, mantenha os frascos com o polímero precipitado a menos 80 graus Celsius durante a noite.Lyophilize o polímero por pelo menos 48 horas. Em seguida, armazene o polímero seco em um desiccador à temperatura ambiente até usar ainda mais. Para concentrar o meio, primeiro cultivar cianobactérias em condições padrão.Monitore o crescimento do cianobacterium usando procedimentos padrão. Em seguida, centrifugar as culturas a 4.000 vezes g em temperatura ambiente por 10 minutos. Transfira o supernatante para um frasco, e descarte a pelota celular.Em seguida, filtre o meio decantado através de um filtro de tamanho de poros de 0,2 mícrons. Para concentrar o meio aproximadamente 500 vezes, use concentradores centrífugas com um corte nominal de peso molecular de três kilodaltons para centrífugas 4.000 vezes g e 15 graus Celsius para um máximo de uma hora por rodada de centorifugação. Após a centrifugação, enxágue as paredes do reservatório de amostra do dispositivo do filtro com a amostra concentrada e transfira o conteúdo para um tubo de microcentrifutura.Realize uma etapa adicional de lavagem do reservatório de amostra do dispositivo do filtro com o meio de cultura autoclaved para garantir a recuperação máxima do exoproteome. Em seguida, armazene as amostras de exoproteome a menos 20 graus Celsius até usar mais. O etanol deve ser adicionado vigorosamente para otimizar a precipitação e o rendimento do polímero.Após a centrifugação do polímero precipitado, o descarte do supernante deve ser feito cuidadosamente para evitar a ressuspensão da pelota que pode ser vagamente presa na parede do frasco. Se a filtragem manual for realizada, deve ser suave para evitar quebrar a membrana do filtro. Alguns polímeros precipitados só podem ser visíveis após a centrifugação, principalmente nas paredes dos frascos, como o caso de EPS de Synechocystis.Em outros casos, como o polímero Cyanothece, é possível ver os aglomerados de polímeros flutuando no béquer de vidro logo após a precipitação. Algumas contaminações podem ser facilmente detectadas macroscopicamente após a liofilização do polímero, pois alteram a pigmentação do polímero, geralmente branco ou marrom claro. Polímeros laranjas estão contaminados com carotenoides ou estruturas contendo esses pigmentos.Por exemplo, polímeros verdes estão contaminados com detritos celulares e clorofila. Exoproteomes podem variar significativamente dependendo da cepa bacteriana. Veja, por exemplo, o exoproteome de um cianobacterium unicelular e o de uma cepa fiomante.A alta quantidade de polissacarídeos em amostras exoprotetoras concentradas pode dificultar a análise exoproteome. Por exemplo, pode atrasar a separação de proteínas e mascarar proteínas menos abundantes. O usuário pode caracterizar o polímero em termos de composição, propriedades físicas/químicas, atividade biológica de polímero de teste ou componentes de polímeros modificados.Para identificação de proteínas, pode ser realizada a separação de proteínas em gel e espectrometria de massa. E para a separação das vesículas, a ultracentrifugação do exoproteome deve ser realizada. Em nosso grupo, esses protocolos já abriram caminho para desvendar mecanismos de secreção cianobacteriana ou aplicações dos polímeros de carboidratos extracelulares em diferentes campos, como na bioremediação ou como agentes de antitumor ou de entrega de medicamentos.

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Biochemistry of the Cell

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