Name: looking outwards: isolation of cyanobacterial released carbohydrate polymers and proteins
Uploaded: 2019-05-27T13:00:00
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Este trabajo fue financiado por los fondos de la Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) a través del Programa DE Competitividad e Internacionalización (POCI) COMPETE 2020, Portugal 2020, y por fondos portugueses a través del FCT - Fundación para la Ciencia y el Programa De Lancia e A Tecnologia/Ministério da Ciéncia, Tecnologia e Ensino Superior en el marco del proyecto POCI-01-0145-FEDER-028779 y la subvención SFRH/BD/99715/2014 (CF).

1. Aislamiento de polímero de carbohidratos liberado por cianobacteria
<ol><li>
Aislamiento de polímeros y eliminación de contaminantes
	<ol>
<li>Cultivar la cepa cianobacteriana en condiciones estándar [p. ej., 30 oC bajo una luz de 12 h (50 oEm s 2s x1) /12 h de régimen oscuro, con temblor orbital a 150 rpm]. Mida el crecimiento utilizando protocolos estándar [por ejemplo, densidad óptica a 730 nm (OD730nm),clorofila a, peso seco, etc.], luego mida la ...

<ol>
	<li>Pereira, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexity+of+cyanobacterial+exopolysaccharides:+composition,+structures,+inducing+factors+and+putative+genes+involved+in+their+biosynthesis+and+assembly.">Complexity of cyanobacterial exopolysaccharides: composition, structures, inducing factors and putative genes involved in their biosynthesis and assembly.</a> FEMS Microbiology Reviews. 33 (5), 917-941 (2009).</li><li>Kanekiyo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+an+Antiviral+Polysaccharide,+Nostoflan,+from+a+Terrestrial+Cyanobacterium,+Nostoc+flagelliforme.">Isolation of an Antiviral Polysaccharide, Nostoflan, from a Terrestrial Cyanobacterium, Nostoc flagelliforme.</a> Journal of Natural Products. 68 (7), 1037-1041 (2005).</li><li>L&#248;bner, M., Walsted, A., Larsen, R., Bendtzen, K., Nielsen, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+human+adaptive+immune+responses+by+administration+of+a+high-molecular-weight+polysaccharide+extract+from+the+cyanobacterium+Arthrospira+platensis.">Enhancement of human adaptive immune responses by administration of a high-molecular-weight polysaccharide extract from the cyanobacterium Arthrospira platensis.</a> Journal of Medicinal Food. 11 (2), 313-322 (2008).</li><li>Wang, H. B., Wu, S. J., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+polysaccharides+from+cyanobacteria+Nostoc+commune+and+their+antioxidant+activities.">Preparation of polysaccharides from cyanobacteria Nostoc commune and their antioxidant activities.</a> Carbohydrate Polymers. 99, 553-555 (2014).</li><li>Ozturk, S., Aslim, B., Suludere, Z., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+removal+of+cyanobacterial+exopolysaccharides+by+uronic+acid+content+and+monosaccharide+composition.">Metal removal of cyanobacterial exopolysaccharides by uronic acid content and monosaccharide composition.</a> Carbohydrate Polymers. 101, 265-271 (2014).</li><li>Han, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emulsifying,+flocculating,+and+physicochemical+properties+of+exopolysaccharide+produced+by+cyanobacterium+Nostoc+flagelliforme.">Emulsifying, flocculating, and physicochemical properties of exopolysaccharide produced by cyanobacterium Nostoc flagelliforme.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 172 (1), 36-49 (2014).</li><li>Leite, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterium&#8208;Derived+Extracellular+Carbohydrate+Polymer+for+the+Controlled+Delivery+of+Functional+Proteins.">Cyanobacterium&#8208;Derived Extracellular Carbohydrate Polymer for the Controlled Delivery of Functional Proteins.</a> Macromolecular Bioscience. 17 (2), 1600206 (2017).</li><li>Estevinho, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+cyanobacterial+extracellular+polymeric+substance+in+the+microencapsulation+of+vitamin+B12.">Application of a cyanobacterial extracellular polymeric substance in the microencapsulation of vitamin B12.</a> Powder Technology. 343, 644-651 (2019).</li><li>Klock, J. H., Wieland, A., Seifert, R., Michaelis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+polymeric+substances+(EPS)+from+cyanobacterial+mats:+characterisation+and+isolation+method+optimisation.">Extracellular polymeric substances (EPS) from cyanobacterial mats: characterisation and isolation method optimisation.</a> Marine Biology. 152 (5), 1077-1085 (2007).</li><li>Delattre, C., Pierre, G., Laroche, C., Michaud, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+extraction+and+characterization+of+microalgal+and+cyanobacterial+exopolysaccharides.">Production, extraction and characterization of microalgal and cyanobacterial exopolysaccharides.</a> Biotechnology Advances. 34 (7), 1159-1179 (2016).</li><li>Costa, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+systems+in+gram-negative+bacteria:+structural+and+mechanistic+insights.">Secretion systems in gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (6), 343-359 (2015).</li><li>Roier, S., Zingl, F. G., Cakar, F., Schild, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicle+biogenesis:+a+new+mechanism+and+its+implications.">Bacterial outer membrane vesicle biogenesis: a new mechanism and its implications.</a> Microbial Cell. 3 (6), 257-259 (2016).</li><li>Sergeyenko, T. V., Los, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+secreted+proteins+of+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+strain+PCC+6803.">Identification of secreted proteins of the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803.</a> FEMS Microbiology Letters. 193 (2), 213-216 (2000).</li><li>Oliveira, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatile+TolC-like+Slr1270+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">The versatile TolC-like Slr1270 in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Environmental Microbiology. 18 (2), 486-502 (2016).</li><li>Flores, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alternative+sigma+factor+SigF+is+a+key+player+in+the+control+of+secretion+mechanisms+in+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">The alternative sigma factor SigF is a key player in the control of secretion mechanisms in Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Environmental Microbiology. 21 (1), 343-359 (2018).</li><li>Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+method+for+determination+of+sugars+and+related+substances.">Colorimetric method for determination of sugars and related substances.</a> Analytical Chemistry. 28 (3), 350-356 (1956).</li><li>Parikh, A., Madamwar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+characterization+of+extracellular+polysaccharides+from+cyanobacteria.">Partial characterization of extracellular polysaccharides from cyanobacteria.</a> Bioresource Technology. 97 (15), 1822-1827 (2006).</li><li>R&#252;hmann, B., Schmid, J., Sieber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+identify+the+unexplored+diversity+of+microbial+exopolysaccharides.">Methods to identify the unexplored diversity of microbial exopolysaccharides.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 565 (2015).</li><li>Pathak, J., Rajneesh, R., Sonker, A. S., Kannaujiya, V. K., Sinha, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterial+extracellular+polysaccharide+sheath+pigment,+scytonemin:+A+novel+multipurpose+pharmacophore.">Cyanobacterial extracellular polysaccharide sheath pigment, scytonemin: A novel multipurpose pharmacophore.</a> Marine Glycobiology. , 343-358 (2016).</li><li>Nguyen, A. T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performances+of+different+protocols+for+exocellular+polysaccharides+extraction+from+milk+acid+gels:+Application+to+yogurt.">Performances of different protocols for exocellular polysaccharides extraction from milk acid gels: Application to yogurt.</a> Food Chemistry. 239, 742-750 (2018).</li><li>Jamshidian, H., Shojaosadati, S. A., Mousavi, S. M., Soudi, M. R., Vilaplana, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+of+recovery+procedures+on+structural+and+rheological+properties+of+schizophyllan+produced+from+date+syrup.">Implications of recovery procedures on structural and rheological properties of schizophyllan produced from date syrup.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 105, 36-44 (2017).</li><li>Couto, N., Schooling, S. R., Dutcher, J. R., Barber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+profiles+of+outer+membrane+vesicles+and+extracellular+matrix+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Proteome profiles of outer membrane vesicles and extracellular matrix of Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Journal of Proteome Research. 14 (10), 4207-4222 (2015).</li></ol>

Para comprender mejor los mecanismos de secreción bacteriana y estudiar los productos liberados, es de extrema importancia demostrar el aislamiento y análisis eficientes de las biomoléculas presentes en el entorno bacteriano extracelular (como polímeros de carbohidratos y proteínas).
Los polímeros de carbohidratos extracelulares cianobacterianos son extremadamente complejos, principalmente debido al número y proporción de diferentes monosacáridos que constituyen su composición<sup cl...

Las cianobacterias son ampliamente reconocidas como fuentes prolíficas de productos naturales con aplicaciones biotecnológicas/biomédicas prometedoras. Por lo tanto, la comprensión de los mecanismos de secreción cianobacteriana y la optimización de los métodos de extracción/recuperación son esenciales para implementar cianobacterias como fábricas de células microbianas eficientes.
Muchas cepas cianobacterianas son capaces de producir sustancias poliméricas extracelulares (EPS), formadas principalmente porheteropolisacáridos, que permanecen asociadas a la superficie celular o se liberan en el medio 1. Estos polímeros de carbohidratos liberados tienen características distintas en comparación con los de otras bacterias, que los hacen adecuados para una amplia gama de aplicaciones (por ejemplo, antivirales2, inmunoestimuladores3, antioxidante4, metal-quelating5, emulsionando6, y agentes de administración de drogas7,8). La metodología para el aislamiento de estos polímeros contribuye en gran medida no sólo a la mejora del rendimiento, sino también al aumento de la pureza y las propiedades físicas específicas del polímero obtenido9. La gran mayoría de estos métodos para el aislamiento de los polímeros se basan en estrategias de precipitación del medio de cultivo que se logran fácilmente debido a la fuerte naturaleza aniónica del polímero9,10. Además, la eliminación de los disolventes utilizados en el paso de precipitación se puede lograr rápidamente por evaporación y/o liofilización. Dependiendo de la aplicación prevista, se pueden acoplar diferentes pasos después o antes de la precipitación de polímeros para adaptar el producto final, que incluyen el tratamiento del ácido tricloroacético (TCA), filtración o cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) purificación de columnas10.
Las cianobacterias también son capaces de secretar una amplia gama de proteínas a través de vías dependientes de transportadores de membrana (clásicos)11 o mediadas por vesículas (no clásicas)12. Por lo tanto, el análisis del exoproteome cianobacteriano constituye una herramienta esencial, tanto para entender/manipular los mecanismos de secreción de proteínas cianobacterianas como para comprender la función extracelular específica de estas proteínas. El aislamiento y análisis fiables de los exoproteomes requieren la concentración del entorno extracelular, ya que la abundancia de proteínas secretadas es relativamente baja. Además, otras etapas físicas o químicas (por ejemplo, centrifugación, filtración o precipitación proteica) pueden optimizar la calidad del exproteome obtenido, enriqueciendo el contenido proteico13y evitando la presencia de contaminantes (por ejemplo, pigmentos, carbohidratos, etc.) 14 , 15 o el predominio de proteínas intracelulares en las muestras. Sin embargo, algunos de estos pasos también pueden restringir el conjunto de proteínas que se pueden detectar, lo que conduce a un análisis sesgado.
Este trabajo describe protocolos eficientes para el aislamiento de polímeros de carbohidratos liberados y exoproteomes de medios de cultivo de cianobacterias. Estos protocolos se pueden adaptar fácilmente a los objetivos específicos del estudio y a las necesidades del usuario, manteniendo al mismo tiempo los pasos básicos que se presentan aquí.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1393px;" width="1392">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Dialysis membranes</td>
			<td style="width:191px;">Medicell Membranes Ltd&#160;</td>
			<td style="width:119px;">DTV.12000.07</td>
			<td style="width:777px;">Visking Tubing Size 7, Dia 23.8 mm, Width 39-41 mm 30m Roll&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Ethanol 96%</td>
			<td style="width:191px;">AGA - &#193;lcool e G&#233;neros Alimentares, S.A.</td>
			<td style="width:119px;">4.000.02.02.00</td>
			<td>Fermentation ethyl alcohol 96% AGA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">PES Filter 0.2 &#956;m</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific, Lda</td>
			<td style="width:119px;">15206869</td>
			<td>Syringe filter polystyrene 33MM 0.2&#181;M STR&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Amicon Ultra-15, Ultracel-3K</td>
			<td style="width:191px;">Merck Millipore Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">UFC900324</td>
			<td>Centrifugal filters with a nominal molecular weight cut-off of 3 kDa</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Thermo Scientific&#160;Pierce BCA Protein Assay</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific, Lda</td>
			<td style="width:119px;">10741395</td>
			<td>Green-to-blue, precise, detergent-compatible assay reagent to measure total protein concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Brillant Blue G Colloidal Concentrate&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Sigma Aldrich Qu&#237;mica SL</td>
			<td style="width:119px;">B2025-1EA</td>
			<td>Coomassie blue&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

looking outwards: isolation of cyanobacterial released carbohydrate polymers and proteins

Las cianobacterias pueden secretar activamente una amplia gama de biomoléculas en el entorno extracelular, como los heteropolisacáridos y las proteínas. La identificación y caracterización de estas biomoléculas puede mejorar el conocimiento sobre sus vías de secreción y ayudar a manipularlas. Además, algunas de estas biomoléculas también son interesantes en términos de aplicaciones biotecnológicas. Aquí se describen dos protocolos para el aislamiento fácil y rápido de polímeros y proteínas de carbohidratos liberados por cianobacterias. El método de aislamiento de polímeros de carbohidratos liberados se basa en técnicas convencionales de precipitación de polisacáridos en soluciones acuosas utilizando disolventes orgánicos. Este método preserva las características del polímero y al mismo tiempo evita la presencia de contaminantes de los desechos celulares y el medio de cultivo. Al final del proceso, el polímero liofilizado está listo para ser utilizado o caracterizado o puede ser sometido a más rondas de purificación, dependiendo del uso final previsto. En cuanto al aislamiento del exoproteoma cianobacteriano, la técnica se basa en la concentración del medio libre de células después de la eliminación de los principales contaminantes por centrifugación y filtración. Esta estrategia permite un aislamiento fiable de las proteínas que alcanzan el medio extracelular a través de transportadores de membrana o vesículas de membrana externa. Estas proteínas se pueden identificar posteriormente utilizando técnicas estándar de espectrometría de masas. Los protocolos presentados aquí se pueden aplicar no sólo a una amplia gama de cianobacterias, sino también a otras cepas bacterianas. Además, estos procedimientos se pueden adaptar fácilmente según el uso final de los productos, el grado de pureza requerido y la cepa bacteriana.

En la Figura 1se muestra una representación esquemática del método descrito para extraer polímeros de carbohidratos liberados de cultivos cianobacterianos. Los polímeros precipitados del productor moderado de EPS cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 y el eficiente productor de EPS Cyanothece sp. En la Figura3, se muestran polímeros liofilizados con diferentes grados de contaminación, destacando la impor...

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Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

Mirando hacia afuera: Aislamiento de polímeros y proteínas de carbohidratos liberados de cianobacteria

Aquí, se describen los protocolos para el aislamiento de polímeros de carbohidratos liberados por cianobacterias y el aislamiento de sus exoproteomes. Ambos procedimientos incorporan pasos clave para obtener polímeros o proteínas con grados de alta pureza que se pueden utilizar para análisis o aplicaciones adicionales. También se pueden adaptar fácilmente según las necesidades específicas del usuario.

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Estos protocolos que desarrollamos son importantes para estudiar los mecanismos de secreción en cianobacterias y sus productos liberados, a saber, los polímeros y proteínas de carbohidratos extracelulares. El conocimiento generado nos permitirá personalizar estos productos para diversas aplicaciones, a saber, aplicaciones biotecnológicas y biomédicas. Estos protocolos son muy sencillos.Se pueden adaptar según el organismo productor, las necesidades del usuario y la aplicación final del producto. La principal ventaja de estos protocolos es que se pueden adaptar fácilmente a otros sistemas vivos, en particular a otras bacterias. Estos protocolos son fáciles.Sin embargo, uno puede necesitar introducir algunos cambios dependiendo de la cepa bacteriana o el grado de pureza requerida. Para empezar, cultivar la cepa cianobacteriana en condiciones estándar. Mida el crecimiento utilizando protocolos estándar.A continuación, transfiera el cultivo a membranas de diálisis y dialice contra un mínimo de 10 volúmenes de agua desionizada durante 24 horas con agitación continua. Centrifugar el cultivo a 15.000 g a cuatro grados centígrados durante 15 minutos. Transfiera el sobrenadante a un vial nuevo y deseche el pellet.Centrifugar de nuevo a 20.000 veces g a cuatro grados Celsius durante 15 minutos para eliminar contaminantes, como restos de pared celular o lipopolisacáridos. Después de la centrifugación, transfiera el sobrenadante a un vaso de precipitados de vidrio y deseche el pellet. Para precipitar el polímero, añadir dos volúmenes de 96% etanol al sobrenadante, e incubar la suspensión a cuatro grados Celsius durante la noche.Para pequeñas o no visibles cantidades de polímero precipitado, centrifugar la suspensión a 13.000 veces g a cuatro grados centígrados durante 25 minutos. Deseche suavemente el sobrenadante y resuspender el pellet en uno o dos mililitros de agua desionizada autoclavizada. Transfiera la suspensión acuosa a un vial.Para grandes cantidades visibles de polímero precipitado, recoja el polímero precipitado con fórceps metálicos estériles en un vial. Apriete el polímero y deseche el exceso de etanol. Para realizar el proceso de liofilización también conocido como secado por congelación, mantenga los viales con el polímero precipitado a menos 80 grados centígrados durante la noche.Liofilizar el polímero durante al menos 48 horas. A continuación, guarde el polímero seco en un desecador a temperatura ambiente hasta su uso posterior. Para concentrar el medio, primero cultivar cianobacterias en condiciones estándar.Monitorear el crecimiento de cianobacterium utilizando procedimientos estándar. Luego, centrifugar los cultivos a 4.000 g a temperatura ambiente durante 10 minutos. Transfiera el sobrenadante a un matraz y deseche el pellet celular.A continuación, filtre el medio decantado a través de un filtro de tamaño de poro de 0,2 micras. Para concentrar el medio aproximadamente 500 veces, utilice concentradores centrífugos con un corte de peso molecular nominal de tres kilodatones para centrifugar 4.000 veces g y 15 grados celsius durante un máximo de una hora por centrifugación redonda. Después de la centrifugación, enjuague las paredes del depósito de muestra del dispositivo de filtro con la muestra concentrada y transfiera el contenido a un tubo de microcentrífuga.Realice un paso de lavado adicional del depósito de muestra del dispositivo de filtro con el medio de cultivo autoclavedo para garantizar la máxima recuperación del exoprotemo. A continuación, guarde las muestras de exoproteomo a menos 20 grados centígrados hasta su uso posterior. El etanol debe añadirse vigorosamente para optimizar la precipitación y el rendimiento del polímero.Después de centrifugar el polímero precipitado, el descarte del sobrenadante debe hacerse cuidadosamente para evitar la resuspensión del pellet que puede estar libremente unido en la pared del matraz. Si se realiza una filtración manual, debe ser suave para evitar romper la membrana del filtro. Algunos polímeros precipitados sólo pueden ser visibles después de la centrifugación, principalmente en las paredes de los matraces, como el caso de EPS de Synechocystis.En otros casos, como el polímero Cyanothece, es posible ver los grumos de polímero flotando en el vaso de precipitados de vidrio justo después de la precipitación. Algunas contaminaciones se pueden detectar fácilmente macroscópicamente después de la liofilización de polímeros, ya que alterarán la pigmentación del polímero, generalmente blanco o marrón claro. Los polímeros naranjas están contaminados con carotenoides o estructuras que contienen estos pigmentos.Por ejemplo, los polímeros verdes están contaminados con desechos celulares y clorofila. Los exoprotemos pueden variar significativamente dependiendo de la cepa bacteriana. Véase, por ejemplo, el exoprotemo de un cianobacterium unicelular y el de una cepa filamentosa.La alta cantidad de polisacáridos en muestras concentradas con exoproteomo puede obstaculizar el análisis del exoproteoma. Por ejemplo, puede retrasar la separación de proteínas y enmascarar proteínas menos abundantes. El usuario puede caracterizar el polímero en términos de composición, propiedades físicas/químicas, actividad biológica de polímero de prueba o componentes de polímero modificados.Para la identificación de proteínas, se puede realizar la separación de proteínas en gel y espectrometría de masas. Y para la separación de las vesículas, se debe realizar la ultracentrifugación del exoprotemo. En nuestro grupo, estos protocolos ya han allanado el camino para desentrañar mecanismos de secreción cianobacteriana o aplicaciones de los polímeros de carbohidratos extracelulares en diferentes campos, como en la biorremediación o como antitumoores o agentes de administración de fármacos.

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