Name: looking outwards: isolation of cyanobacterial released carbohydrate polymers and proteins
Uploaded: 2019-05-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins at JoVE.com

Detta arbete finansierades av Fundo europeu de Desenvolvimento regional (FEDER) medel genom att konkurrera 2020-Operacional program för konkurrenskraft och internationalisering (POCI), Portugal 2020, och av portugisiska fonder genom FCT-Fundação para a Ciência e en Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e ensino överlägsen inom ramen för projektet POCI-01-0145-FEDER-028779 och Grant SFRH/BD/99715/2014 (CF).

1. cyanobakterial släppt kolhydrat polymerisolering
<ol><li>
Polymerisolering och avlägsnande av föroreningar
	<ol>
<li>Odla cyanobakterial stammen under standardförhållanden [t. ex., 30 ° c under en 12 h ljus (50 μE m− 2s− 1)/12 h mörk regim, med orbitalskakning vid 150 rpm]. Mät tillväxt med hjälp av standardprotokoll [t. ex. optisk densitet vid 730 nm (OD730nm), klorofyll a, torr-vikt, etc.] och mät sedan produktionen av frisläppt polysackar...

<ol>
	<li>Pereira, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexity+of+cyanobacterial+exopolysaccharides:+composition,+structures,+inducing+factors+and+putative+genes+involved+in+their+biosynthesis+and+assembly.">Complexity of cyanobacterial exopolysaccharides: composition, structures, inducing factors and putative genes involved in their biosynthesis and assembly.</a> FEMS Microbiology Reviews. 33 (5), 917-941 (2009).</li><li>Kanekiyo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+an+Antiviral+Polysaccharide,+Nostoflan,+from+a+Terrestrial+Cyanobacterium,+Nostoc+flagelliforme.">Isolation of an Antiviral Polysaccharide, Nostoflan, from a Terrestrial Cyanobacterium, Nostoc flagelliforme.</a> Journal of Natural Products. 68 (7), 1037-1041 (2005).</li><li>L&#248;bner, M., Walsted, A., Larsen, R., Bendtzen, K., Nielsen, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+human+adaptive+immune+responses+by+administration+of+a+high-molecular-weight+polysaccharide+extract+from+the+cyanobacterium+Arthrospira+platensis.">Enhancement of human adaptive immune responses by administration of a high-molecular-weight polysaccharide extract from the cyanobacterium Arthrospira platensis.</a> Journal of Medicinal Food. 11 (2), 313-322 (2008).</li><li>Wang, H. B., Wu, S. J., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+polysaccharides+from+cyanobacteria+Nostoc+commune+and+their+antioxidant+activities.">Preparation of polysaccharides from cyanobacteria Nostoc commune and their antioxidant activities.</a> Carbohydrate Polymers. 99, 553-555 (2014).</li><li>Ozturk, S., Aslim, B., Suludere, Z., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+removal+of+cyanobacterial+exopolysaccharides+by+uronic+acid+content+and+monosaccharide+composition.">Metal removal of cyanobacterial exopolysaccharides by uronic acid content and monosaccharide composition.</a> Carbohydrate Polymers. 101, 265-271 (2014).</li><li>Han, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emulsifying,+flocculating,+and+physicochemical+properties+of+exopolysaccharide+produced+by+cyanobacterium+Nostoc+flagelliforme.">Emulsifying, flocculating, and physicochemical properties of exopolysaccharide produced by cyanobacterium Nostoc flagelliforme.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 172 (1), 36-49 (2014).</li><li>Leite, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterium&#8208;Derived+Extracellular+Carbohydrate+Polymer+for+the+Controlled+Delivery+of+Functional+Proteins.">Cyanobacterium&#8208;Derived Extracellular Carbohydrate Polymer for the Controlled Delivery of Functional Proteins.</a> Macromolecular Bioscience. 17 (2), 1600206 (2017).</li><li>Estevinho, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+cyanobacterial+extracellular+polymeric+substance+in+the+microencapsulation+of+vitamin+B12.">Application of a cyanobacterial extracellular polymeric substance in the microencapsulation of vitamin B12.</a> Powder Technology. 343, 644-651 (2019).</li><li>Klock, J. H., Wieland, A., Seifert, R., Michaelis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+polymeric+substances+(EPS)+from+cyanobacterial+mats:+characterisation+and+isolation+method+optimisation.">Extracellular polymeric substances (EPS) from cyanobacterial mats: characterisation and isolation method optimisation.</a> Marine Biology. 152 (5), 1077-1085 (2007).</li><li>Delattre, C., Pierre, G., Laroche, C., Michaud, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+extraction+and+characterization+of+microalgal+and+cyanobacterial+exopolysaccharides.">Production, extraction and characterization of microalgal and cyanobacterial exopolysaccharides.</a> Biotechnology Advances. 34 (7), 1159-1179 (2016).</li><li>Costa, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+systems+in+gram-negative+bacteria:+structural+and+mechanistic+insights.">Secretion systems in gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (6), 343-359 (2015).</li><li>Roier, S., Zingl, F. G., Cakar, F., Schild, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicle+biogenesis:+a+new+mechanism+and+its+implications.">Bacterial outer membrane vesicle biogenesis: a new mechanism and its implications.</a> Microbial Cell. 3 (6), 257-259 (2016).</li><li>Sergeyenko, T. V., Los, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+secreted+proteins+of+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+strain+PCC+6803.">Identification of secreted proteins of the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803.</a> FEMS Microbiology Letters. 193 (2), 213-216 (2000).</li><li>Oliveira, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatile+TolC-like+Slr1270+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">The versatile TolC-like Slr1270 in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Environmental Microbiology. 18 (2), 486-502 (2016).</li><li>Flores, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alternative+sigma+factor+SigF+is+a+key+player+in+the+control+of+secretion+mechanisms+in+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">The alternative sigma factor SigF is a key player in the control of secretion mechanisms in Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Environmental Microbiology. 21 (1), 343-359 (2018).</li><li>Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+method+for+determination+of+sugars+and+related+substances.">Colorimetric method for determination of sugars and related substances.</a> Analytical Chemistry. 28 (3), 350-356 (1956).</li><li>Parikh, A., Madamwar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+characterization+of+extracellular+polysaccharides+from+cyanobacteria.">Partial characterization of extracellular polysaccharides from cyanobacteria.</a> Bioresource Technology. 97 (15), 1822-1827 (2006).</li><li>R&#252;hmann, B., Schmid, J., Sieber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+identify+the+unexplored+diversity+of+microbial+exopolysaccharides.">Methods to identify the unexplored diversity of microbial exopolysaccharides.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 565 (2015).</li><li>Pathak, J., Rajneesh, R., Sonker, A. S., Kannaujiya, V. K., Sinha, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterial+extracellular+polysaccharide+sheath+pigment,+scytonemin:+A+novel+multipurpose+pharmacophore.">Cyanobacterial extracellular polysaccharide sheath pigment, scytonemin: A novel multipurpose pharmacophore.</a> Marine Glycobiology. , 343-358 (2016).</li><li>Nguyen, A. T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performances+of+different+protocols+for+exocellular+polysaccharides+extraction+from+milk+acid+gels:+Application+to+yogurt.">Performances of different protocols for exocellular polysaccharides extraction from milk acid gels: Application to yogurt.</a> Food Chemistry. 239, 742-750 (2018).</li><li>Jamshidian, H., Shojaosadati, S. A., Mousavi, S. M., Soudi, M. R., Vilaplana, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+of+recovery+procedures+on+structural+and+rheological+properties+of+schizophyllan+produced+from+date+syrup.">Implications of recovery procedures on structural and rheological properties of schizophyllan produced from date syrup.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 105, 36-44 (2017).</li><li>Couto, N., Schooling, S. R., Dutcher, J. R., Barber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+profiles+of+outer+membrane+vesicles+and+extracellular+matrix+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Proteome profiles of outer membrane vesicles and extracellular matrix of Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Journal of Proteome Research. 14 (10), 4207-4222 (2015).</li></ol>

För att bättre förstå bakteriella sekretionsmekanismer och studera de frisläppta produkterna, är det av yttersta vikt att demonstrera effektiv isolering och analys av biomolekyler som finns i den extracellulära bakteriella miljön (såsom utsläppt kolhydrat polymerer och proteiner).
Cyanobakterial extracellulära kolhydrat polymerer är extremt komplexa, främst på grund av antalet och andelen olika monosackarider som utgör deras sammansättning1. De konventio...

Cyanobakterier är allmänt erkända som produktiva källor av naturliga produkter med lovande bioteknologiska/biomedicinska tillämpningar. Därför är det viktigt att förstå cyanobakteriala sekretionsmekanismer och optimering av utvinnings-och återvinningsmetoderna för att kunna implementera cyklo-terier som effektiva mikrobiella cell fabriker.
Många cyanobakterial stammar kan producera extracellulära polymera ämnen (EPS), huvudsakligen bildas av heteropolysackarider, som förblir associerade till cellytan eller släpps ut i mediet1. Dessa frigörs kolhydrat polymerer har distinkta funktioner jämfört med de från andra bakterier, som gör dem lämpliga för ett brett spektrum av tillämpningar (t. ex., antivirala läkemedel2, immunstimulerande3, antioxidant4, Metal-Kelating5, emulgering6, och Drug Delivery agenter7,8). Metod för isolering av dessa polymerer bidrar till stor del inte bara till förbättrad avkastning utan också till ökad renhet och de specifika fysikaliska egenskaperna hos den polymer som erhålls9. En stor majoritet av dessa metoder för isolering av polymererna förlitar sig på nederbördsstrategier från odlingsmediet som lätt kan åstadkommas på grund av polymerens starka anjonnatur9,10. Dessutom kan avlägsnande av lösningsmedel som används i nederbörden steg snabbt uppnås genom avdunstning och/eller frystorkade. Beroende på den planerade appliceringen kan olika steg kopplas antingen efter eller före polymernederbörd för att skräddarsy slutprodukten, som omfattar behandling med triklorättiksyra (TCA), filtrering eller kromatografi av storlek (SEC) kolumn rening10.
Cyanobakterier kan också utsöndra ett brett spektrum av proteiner genom vägar som är beroende av membran transportörer (klassisk)11 eller medieras av vesikler (icke-klassisk)12. Därför är analys av cyanobakterial exoproteome ett viktigt verktyg, både för att förstå/manipulera cyanobakterial proteinutsöndringen mekanismer och förstå den specifika extracellulära funktionen av dessa proteiner. Tillförlitlig isolering och analys av exoproteomes kräver koncentrationen av den extracellulära miljön, eftersom överflödet av utsöndras proteiner är relativt lågt. Dessutom kan andra fysikaliska eller kemiska steg (t. ex. centrifugering, filtrering eller protein nederbörd) optimera kvaliteten på det exoproteome som erhålls, berika proteinhalten13och undvika förekomst av föroreningar (t. ex. pigment, kolhydrater, etc.) fjorton , 15 eller dominans av intracellulära proteiner i proverna. Men vissa av dessa steg kan också begränsa den uppsättning proteiner som kan upptäckas, vilket leder till en partisk analys.
Detta arbete beskriver effektiva protokoll för isolering av utsläppt kolhydrat polymerer och exoproteomes från cyanobakterier odlingsmedier. Dessa protokoll kan lätt anpassas till studiens specifika mål och användarbehov, samtidigt som de grundläggande stegen som presenteras här.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1393px;" width="1392">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Dialysis membranes</td>
			<td style="width:191px;">Medicell Membranes Ltd&#160;</td>
			<td style="width:119px;">DTV.12000.07</td>
			<td style="width:777px;">Visking Tubing Size 7, Dia 23.8 mm, Width 39-41 mm 30m Roll&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Ethanol 96%</td>
			<td style="width:191px;">AGA - &#193;lcool e G&#233;neros Alimentares, S.A.</td>
			<td style="width:119px;">4.000.02.02.00</td>
			<td>Fermentation ethyl alcohol 96% AGA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">PES Filter 0.2 &#956;m</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific, Lda</td>
			<td style="width:119px;">15206869</td>
			<td>Syringe filter polystyrene 33MM 0.2&#181;M STR&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Amicon Ultra-15, Ultracel-3K</td>
			<td style="width:191px;">Merck Millipore Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">UFC900324</td>
			<td>Centrifugal filters with a nominal molecular weight cut-off of 3 kDa</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Thermo Scientific&#160;Pierce BCA Protein Assay</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific, Lda</td>
			<td style="width:119px;">10741395</td>
			<td>Green-to-blue, precise, detergent-compatible assay reagent to measure total protein concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Brillant Blue G Colloidal Concentrate&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Sigma Aldrich Qu&#237;mica SL</td>
			<td style="width:119px;">B2025-1EA</td>
			<td>Coomassie blue&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

looking outwards: isolation of cyanobacterial released carbohydrate polymers and proteins

Cyanobakterier kan aktivt utsöndra ett brett spektrum av biomolekyler i den extracellulära miljön, såsom heteropolysackarider och proteiner. Identifieringen och karakteriseringen av dessa biomolekyler kan förbättra kunskapen om deras utsöndringen vägar och hjälpa till att manipulera dem. Dessutom är några av dessa biomolekyler också intressanta när det gäller bioteknologiska tillämpningar. Här beskrivs två protokoll för enkel och snabb isolering av cyanobakterial utsläppt kolhydrat polymerer och proteiner. Metoden för isolering av frisläppt kolhydrat polymerer är baserad på konventionella nederbördstekniker av polysackarider i vattenlösningar med organiska lösningsmedel. Denna metod bevarar polymerens egenskaper och undviker samtidigt närvaron av föroreningar från Cellrester och odlingssubstrat. I slutet av processen, den frystorkade polymeren är redo att användas eller kännetecknas eller kan utsättas för ytterligare omgångar av rening, beroende på den slutliga avsedda användningen. När det gäller isoleringen av cyanobakterial exoproteome är tekniken baserad på koncentrationen av det cell fria mediet efter avlägsnande av de stora föroreningarna genom centrifugering och filtrering. Denna strategi möjliggör tillförlitlig isolering av proteiner som når den extracellulära miljö via membran transportörer eller yttre membran blåsor. Dessa proteiner kan därefter identifieras med hjälp av standardmasspektrometritekniker. De protokoll som presenteras här kan inte bara tillämpas på ett brett spektrum av cyanobakterier, utan även på andra bakteriestammar. Dessutom kan dessa förfaranden lätt anpassas efter den slutliga användningen av produkterna, renhetsgrad som krävs, och bakteriestam.

En schematisk framställning av den metod som beskrivs för att extrahera frisläppt kolhydrat polymerer från cyanobakteriala kulturer avbildas i figur 1. Utfälld polymerer från den måttliga EPS-producenten Cyanobakterie synechocystis SP. PCC 6803 och den effektiva EPS-producenten cyanothece SP. CCY 0110 visas i figur 2. I figur 3visas frystorkade polymerer med olika grader av kontamination som belyser vikten a...

Watch this Scientific Journal Video about Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins at JoVE.com

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

Ser utåt: isolering av Cyanobakterial släppt kolhydrat polymerer och proteiner

Här beskrivs protokoll för isolering av cyanobakterial som frigörs kolhydratpolymerer och isolering av deras exoproteomes. Båda procedurerna förkroppsligar viktiga steg för att få polymerer eller proteiner med hög renhetsgrad som kan användas för ytterligare analys eller tillämpningar. De kan också enkelt anpassas efter specifika användarbehov.

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Dessa protokoll som vi utvecklat är viktiga för att studera utsöndring mekanismerna i cyanobakterier och deras frisläppta produkter, nämligen de extracellulära kolhydrater polymerer och proteiner. Den kunskap som genereras kommer att tillåta oss att anpassa dessa produkter för flera tillämpningar, nämligen biotekniska och biomedicinska tillämpningar. Dessa protokoll är mycket okomplicerade.De kan skräddarsys enligt den producerande organismen, användarens behov, och den slutliga tillämpningen av produkten. Den största fördelen med dessa protokoll är att de lätt kan anpassas till andra levande system, särskilt till andra bakterier. Dessa protokoll är lätta.Emellertid, man kan behöva införa vissa förändringar beroende på bakteriestammen eller graden av renhet som krävs. Till att börja, odla den cyanobakteriella stammen under standardförhållanden. Mät tillväxt med hjälp av standardprotokoll.Därefter överför kulturen till dialysmembran, och dialyze mot minst 10 volymer av avjoniserat vatten i 24 timmar med kontinuerlig omrörning. Centrifugera kulturen vid 15, 000 gånger g vid fyra grader Celsius i 15 minuter. Överför supernatanten till en ny injektionsflaska och kassera pelleten.Centrifugera igen vid 20, 000 gånger g vid fyra grader Celsius i 15 minuter för att ta bort föroreningar, såsom cellvägg skräp eller lipopolysackarider. Efter centrifugeringen överför du supernatanten till en glasbägare, och kassera pelleten. För att fälla ut polymeren, tillsätt två volymer av 96%etanol till supernatanten, och inkubera suspensionen i fyra grader Celsius över natten.För små eller inte synliga mängder utfälld polymer, centrifug suspensionen vid 13, 000 gånger g vid fyra grader Celsius i 25 minuter. Kassera försiktigt supernatanten och återanvänd pelleten i en till två milliliter autoklaverat avjoniserat vatten. Överför vattenupphängningen till en injektionsflaska.För synliga, stora mängder utfälld polymer, samla den utfällda polymeren med sterila metall-tlycper till en injektionsflaska. Pressa polymeren, och kasta överskottet etanol. För att utföra lyofiliiseringsprocessen som annars kallas frystorkning, håll injektionsflaskan med den utfällda polymeren vid minus 80 grader Celsius över natten.Lyofilisera polymeren i minst 48 timmar. Sedan, lagra den torkade polymeren i en exsiccator vid rumstemperatur tills vidare användning. För att koncentrera mediet, först odla cyanobakterier under standardförhållanden.Övervaka cyanobakteriumtillväxten med hjälp av standardprocedurer. Sedan centrifugerna kulturerna vid 4, 000 gånger g vid rumstemperatur i 10 minuter. Överför supernatanten till en kolv, och kassera cellpelleten.Därefter filtrerar du det dekanterade mediet genom ett 0,2-mikronporsstorleksfilter. För att koncentrera mediet cirka 500 gånger, använd centrifugalkoncentratorer med en nominell molekylvikt cut-off på tre kilodalton till centrifug 4, 000 gånger g och 15 grader Celsius för högst en timmes centrifugeringsrunda. Efter centrifugering, skölj väggarna i filteranordningen provbehållaren med det koncentrerade provet, och överför innehållet till ett mikrocentrifugrör.Utför ett extra tvättsteg av filteranordningen provbehållaren med det autoklaverade odlingsmediet för att säkerställa maximal exoproteom återhämtning. Sedan, lagra exoproteome prover på minus 20 grader Celsius tills vidare användning. Etanolen måste tillsättas kraftigt för att optimera polymernedfällningen och utbytet.Efter centrifugering av den utfällda polymeren bör man noggrant göra kassering av supernatanten för att undvika återfjädring av pelleten som kan vara löst fastsatt på kolvens vägg. Om manuell filtrering utförs bör det vara skonsamt för att undvika att filtermembranet bryts. Vissa utfällda polymerer kan endast vara synliga efter centrifugering, huvudsakligen på kolvarnas väggar, såsom fallet med EPS från Synechocystis.I andra fall, såsom Cyanothece polymer, är det möjligt att se polymeren klumpar flyter i glasbägaren strax efter utfällning. Vissa föroreningar kan lätt detekteras makroskopiskt efter polymerlyofilatering eftersom de kommer att förändra polymerpigmentering, vanligtvis vit eller ljusbrun. Orange polymerer är förorenade med karotenoider eller strukturer som innehåller dessa pigment.Till exempel är gröna polymerer förorenade med cellskräp och klorofyll. Exoproteomer kan variera avsevärt beroende på bakteriestammen. Se till exempel exoproteomet från ett encelligt cyanobakterie och det från en fintrådig stam.Den höga mängden polysackarider i exoproteome-koncentrerade prover kan hindra exoproteomanalysen. Till exempel, Det kan fördröja protein separation och maskera mindre rikliga proteiner. Användaren kan karakterisera polymeren i fråga om sammansättning, fysikaliska/kemiska egenskaper, testpolymerbiologisk aktivitet, eller modifierade polymerkomponenter.För proteinidentifiering kan separation av proteiner i gel och masspektrometri utföras. Och för separation av vesiklar bör ultracentrifugering av exoproteomen utföras. I vår grupp har dessa protokoll redan banat väg för att riva upp cyanobakteriella sekretionsmekanismer eller tillämpningar av de extracellulära kolhydratpolymererna inom olika områden, såsom inom bioremediering eller som antitumör- eller läkemedelsförlossningsagenter.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Biochemistry of the Cell

SCIENTISTS IN ACTION

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

High-throughput screening av kolhydratnedbrytande enzymer Använda Novel Olöslig kromogena substratmetod Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Identifiering av växtisbindande proteiner genom bedömning av iskristallisationshämning och isolering med användning av isaffinitetsrening

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

Isolering av intermediära filamentproteiner från flera musvävnader för att studera åldringsrelaterade posttranslationella modifieringar

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biokemiska och strukturell karaktärisering av den kolhydrat Transport substrat-bindande-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

Analysera dynamiska proteinkomplex monterat på och släppt från Biolayer interferometri Biosensor med hjälp av masspektrometri och elektronmikroskopi

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolering av Glomeruli och In Vivo märkning av glomerulär Cell ytproteiner

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Fluorescerande silverfärgning av proteiner i polyakrylamidgeler

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Interfacial Molecular-level Structures of Polymers and Biomacromolecules Revealed via Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy

Interfacial molekylär nivå strukturer av polymerer och Biomacromolecules avslöjade via sum Frequency generation vibrational spektroskopi

As a second-order nonlinear optical spectroscopy, sum frequency generation (SFG) vibrational spectroscopy has widely been used in investigating various ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Lokalisering av SUMO-modifierade proteiner med fluorescerande Sumo-fångst proteiner

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Preparation of High-Quality Fermented Fish Product

Beredning av högkvalitativ fermenterad fisk produkt

This protocol provides a method for preparation of industrialized fermented fish product with sturgeon (Aquilaria sinensis) meat product. The procedures ...