Name: looking outwards: isolation of cyanobacterial released carbohydrate polymers and proteins
Uploaded: 2019-05-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins at JoVE.com

Bu çalışma, Fundo Europeu de desenvolvimento Regional (FEDER) fonları tarafından rekabetçilik 2020-Operacional YARıŞMA ve uluslararasılaşma programı (POCı), Portekiz 2020 ve Portekiz fonları ile FCT-Fundação para a Ciência e aracılığıyla finanse edilmiştir. bir Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e ensino proje çerçevesinde POCI-01-0145-FEDER-028779 ve Grant SFRH/BD/99715/2014 (CF) üstün.

1. siyanobacterial serbest karbonhidrat polimer yalıtım
<ol><li>
Polimer yalıtım ve kirleticilerin çıkarılması
	<ol>
<li>Standart koşullar altında siyanobacterial gerginliği geliştirin [Örneğin, 12 saat ışık altında 30 °C (50 μE m− 2s− 1)/12 h karanlık rejim, 150 RPM 'de orbital sallayarak). Standart protokolleri kullanarak büyüme ölçmek [örn., 730 nm optik yoğunluğu (OD730nm), klorofil a, Kuru ağırlık, vb], sonra fenol-sülf?...

<ol>
	<li>Pereira, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexity+of+cyanobacterial+exopolysaccharides:+composition,+structures,+inducing+factors+and+putative+genes+involved+in+their+biosynthesis+and+assembly.">Complexity of cyanobacterial exopolysaccharides: composition, structures, inducing factors and putative genes involved in their biosynthesis and assembly.</a> FEMS Microbiology Reviews. 33 (5), 917-941 (2009).</li><li>Kanekiyo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+an+Antiviral+Polysaccharide,+Nostoflan,+from+a+Terrestrial+Cyanobacterium,+Nostoc+flagelliforme.">Isolation of an Antiviral Polysaccharide, Nostoflan, from a Terrestrial Cyanobacterium, Nostoc flagelliforme.</a> Journal of Natural Products. 68 (7), 1037-1041 (2005).</li><li>L&#248;bner, M., Walsted, A., Larsen, R., Bendtzen, K., Nielsen, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+human+adaptive+immune+responses+by+administration+of+a+high-molecular-weight+polysaccharide+extract+from+the+cyanobacterium+Arthrospira+platensis.">Enhancement of human adaptive immune responses by administration of a high-molecular-weight polysaccharide extract from the cyanobacterium Arthrospira platensis.</a> Journal of Medicinal Food. 11 (2), 313-322 (2008).</li><li>Wang, H. B., Wu, S. J., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+polysaccharides+from+cyanobacteria+Nostoc+commune+and+their+antioxidant+activities.">Preparation of polysaccharides from cyanobacteria Nostoc commune and their antioxidant activities.</a> Carbohydrate Polymers. 99, 553-555 (2014).</li><li>Ozturk, S., Aslim, B., Suludere, Z., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+removal+of+cyanobacterial+exopolysaccharides+by+uronic+acid+content+and+monosaccharide+composition.">Metal removal of cyanobacterial exopolysaccharides by uronic acid content and monosaccharide composition.</a> Carbohydrate Polymers. 101, 265-271 (2014).</li><li>Han, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emulsifying,+flocculating,+and+physicochemical+properties+of+exopolysaccharide+produced+by+cyanobacterium+Nostoc+flagelliforme.">Emulsifying, flocculating, and physicochemical properties of exopolysaccharide produced by cyanobacterium Nostoc flagelliforme.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 172 (1), 36-49 (2014).</li><li>Leite, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterium&#8208;Derived+Extracellular+Carbohydrate+Polymer+for+the+Controlled+Delivery+of+Functional+Proteins.">Cyanobacterium&#8208;Derived Extracellular Carbohydrate Polymer for the Controlled Delivery of Functional Proteins.</a> Macromolecular Bioscience. 17 (2), 1600206 (2017).</li><li>Estevinho, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+cyanobacterial+extracellular+polymeric+substance+in+the+microencapsulation+of+vitamin+B12.">Application of a cyanobacterial extracellular polymeric substance in the microencapsulation of vitamin B12.</a> Powder Technology. 343, 644-651 (2019).</li><li>Klock, J. H., Wieland, A., Seifert, R., Michaelis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+polymeric+substances+(EPS)+from+cyanobacterial+mats:+characterisation+and+isolation+method+optimisation.">Extracellular polymeric substances (EPS) from cyanobacterial mats: characterisation and isolation method optimisation.</a> Marine Biology. 152 (5), 1077-1085 (2007).</li><li>Delattre, C., Pierre, G., Laroche, C., Michaud, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+extraction+and+characterization+of+microalgal+and+cyanobacterial+exopolysaccharides.">Production, extraction and characterization of microalgal and cyanobacterial exopolysaccharides.</a> Biotechnology Advances. 34 (7), 1159-1179 (2016).</li><li>Costa, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+systems+in+gram-negative+bacteria:+structural+and+mechanistic+insights.">Secretion systems in gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (6), 343-359 (2015).</li><li>Roier, S., Zingl, F. G., Cakar, F., Schild, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicle+biogenesis:+a+new+mechanism+and+its+implications.">Bacterial outer membrane vesicle biogenesis: a new mechanism and its implications.</a> Microbial Cell. 3 (6), 257-259 (2016).</li><li>Sergeyenko, T. V., Los, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+secreted+proteins+of+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+strain+PCC+6803.">Identification of secreted proteins of the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803.</a> FEMS Microbiology Letters. 193 (2), 213-216 (2000).</li><li>Oliveira, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatile+TolC-like+Slr1270+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">The versatile TolC-like Slr1270 in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Environmental Microbiology. 18 (2), 486-502 (2016).</li><li>Flores, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alternative+sigma+factor+SigF+is+a+key+player+in+the+control+of+secretion+mechanisms+in+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">The alternative sigma factor SigF is a key player in the control of secretion mechanisms in Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Environmental Microbiology. 21 (1), 343-359 (2018).</li><li>Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+method+for+determination+of+sugars+and+related+substances.">Colorimetric method for determination of sugars and related substances.</a> Analytical Chemistry. 28 (3), 350-356 (1956).</li><li>Parikh, A., Madamwar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+characterization+of+extracellular+polysaccharides+from+cyanobacteria.">Partial characterization of extracellular polysaccharides from cyanobacteria.</a> Bioresource Technology. 97 (15), 1822-1827 (2006).</li><li>R&#252;hmann, B., Schmid, J., Sieber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+identify+the+unexplored+diversity+of+microbial+exopolysaccharides.">Methods to identify the unexplored diversity of microbial exopolysaccharides.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 565 (2015).</li><li>Pathak, J., Rajneesh, R., Sonker, A. S., Kannaujiya, V. K., Sinha, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterial+extracellular+polysaccharide+sheath+pigment,+scytonemin:+A+novel+multipurpose+pharmacophore.">Cyanobacterial extracellular polysaccharide sheath pigment, scytonemin: A novel multipurpose pharmacophore.</a> Marine Glycobiology. , 343-358 (2016).</li><li>Nguyen, A. T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performances+of+different+protocols+for+exocellular+polysaccharides+extraction+from+milk+acid+gels:+Application+to+yogurt.">Performances of different protocols for exocellular polysaccharides extraction from milk acid gels: Application to yogurt.</a> Food Chemistry. 239, 742-750 (2018).</li><li>Jamshidian, H., Shojaosadati, S. A., Mousavi, S. M., Soudi, M. R., Vilaplana, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+of+recovery+procedures+on+structural+and+rheological+properties+of+schizophyllan+produced+from+date+syrup.">Implications of recovery procedures on structural and rheological properties of schizophyllan produced from date syrup.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 105, 36-44 (2017).</li><li>Couto, N., Schooling, S. R., Dutcher, J. R., Barber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+profiles+of+outer+membrane+vesicles+and+extracellular+matrix+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Proteome profiles of outer membrane vesicles and extracellular matrix of Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Journal of Proteome Research. 14 (10), 4207-4222 (2015).</li></ol>

Bakteriyel salgılanma mekanizmalarını daha iyi anlamak ve serbest bırakılan ürünleri incelemek için, ekstraselüler bakteriyel ortamda mevcut olan Biomoleküllerin verimli yalıtımı ve analizini göstermek çok önemlidir (örneğin, serbest karbonhidrat polimerler ve proteinler).
Siyanobacterial ekstraküler karbonhidrat polimerleri, özellikle kompozisyon1' i oluşturan farklı monosakkaritlerin sayısı ve oranı nedeniyle son derece karmaşıktır. Bu poli...

Siyanobacteria, umut verici biyoteknolojik/biyomedikal uygulamalar ile doğal ürünlerin üretken kaynakları olarak yaygın olarak tanınır. Bu nedenle, siyanobakteryal salgılanma mekanizmaları ve ekstraksiyon/kurtarma yöntemlerinin optimizasyonu anlayışı, etkili mikrobiyal hücre fabrikaları olarak siyanobasitemi uygulamak için esastır.
Birçok siyanobacterial suşları, ağırlıklı olarak heteropolizakkaritler tarafından oluşturulan, hücre yüzeyine ilişkili kalan veya orta1' e serbest bırakılan, ekstrülüler polimerik maddeler (EPS) üretebilir. Bu serbest karbonhidrat polimerleri, diğer bakterilere kıyasla farklı özelliklere sahiptir, bu da onları geniş bir uygulama yelpazesi için uygun hale getiren (örn., antiviral2, immünostimulatuar3, antioksidan4, Metal-şelasyon5, Emulsifying6, ve ilaç teslim ajanlar7,8). Bu polimerlerin yalıtım metodolojisi büyük ölçüde sadece geliştirilmiş verim için değil, aynı zamanda artan saflık ve polimerin spesifik fiziksel özellikleri elde9katkıda bulunur. Polimerlerin izolasyonu için bu yöntemlerin büyük bir çoğunluğu, polimer güçlü anyonik doğa9,10nedeniyle kolayca gerçekleştirilen kültür ortamından yağış stratejileri güveniyor. Ayrıca, yağış adımda kullanılan çözücüler kaldırılması hızla buharlaşma ve/veya lyophilization ile elde edilebilir. Öngörülen uygulamaya bağlı olarak, trichloroasetik asit (TCA) tedavisi, filtrasyon veya boyut dışlama Kromatografi (SEC) dahil olmak üzere son ürünü terzi etmek için polimer yağışından sonra veya önce farklı adımlar birleştirilebilir. sütun arıtma10.
Cyanobacteria da membran taşıyıcıları (klasik)11 veya veziküller (klasik olmayan)12tarafından aracılı bağlı yollar aracılığıyla çeşitli proteinleri salgılayarak edebiliyoruz. Bu nedenle, siyanobakterial dış proteomun analizi, siyanobacterial protein salgısı mekanizmalarını anlamak/manipüle etmek ve bu proteinlerin belirli bir hücre dışı fonksiyonunu anlamak için önemli bir araçtır. Gizli proteinlerin bolluğu nispeten düşük olduğu için, exoproteomlerin güvenilir yalıtımı ve analizi, ekstrüler ortamın konsantrasyonunu gerektirir. Buna ek olarak, diğer fiziksel veya kimyasal adımlar (örneğin, santrifüjleme, filtrasyon veya protein yağış) elde edilen dış proteomun kalitesini optimize edebilir, protein içeriği13' ü zenginleştirebilir ve kirleticilerin varlığını önleyerek (örn. Pigmentler, karbonhidratlar, vb.) 14 , 15 veya numunelerde hücre içi proteinlerin üstünlüğü. Ancak, bu adımlardan bazıları da tespit edilebilir protein kümesini kısıtlayabilir, önyargılı bir analiz yol.
Bu çalışma, serbest karbonhidrat polimerleri ve siyanobacteria kültür medyadan exoproteomes izolasyonu için etkili protokoller açıklar. Bu protokoller, burada sunulan temel adımları korurken, çalışmanın belirli hedeflerine ve Kullanıcı ihtiyaçlarına kolayca adapte edilebilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1393px;" width="1392">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Dialysis membranes</td>
			<td style="width:191px;">Medicell Membranes Ltd&#160;</td>
			<td style="width:119px;">DTV.12000.07</td>
			<td style="width:777px;">Visking Tubing Size 7, Dia 23.8 mm, Width 39-41 mm 30m Roll&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Ethanol 96%</td>
			<td style="width:191px;">AGA - &#193;lcool e G&#233;neros Alimentares, S.A.</td>
			<td style="width:119px;">4.000.02.02.00</td>
			<td>Fermentation ethyl alcohol 96% AGA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">PES Filter 0.2 &#956;m</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific, Lda</td>
			<td style="width:119px;">15206869</td>
			<td>Syringe filter polystyrene 33MM 0.2&#181;M STR&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Amicon Ultra-15, Ultracel-3K</td>
			<td style="width:191px;">Merck Millipore Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">UFC900324</td>
			<td>Centrifugal filters with a nominal molecular weight cut-off of 3 kDa</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Thermo Scientific&#160;Pierce BCA Protein Assay</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific, Lda</td>
			<td style="width:119px;">10741395</td>
			<td>Green-to-blue, precise, detergent-compatible assay reagent to measure total protein concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Brillant Blue G Colloidal Concentrate&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Sigma Aldrich Qu&#237;mica SL</td>
			<td style="width:119px;">B2025-1EA</td>
			<td>Coomassie blue&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

looking outwards: isolation of cyanobacterial released carbohydrate polymers and proteins

Siyanobacteria, heteropolizakkaritler ve proteinler gibi, geniş bir yelpazede biomolekülleri hücre içi ortama aktif olarak salgılasabilir. Bu Biomoleküllerin tanımlanması ve karakterize edilmesi, salgısı yolları hakkında bilgi geliştirebilir ve onları manipüle etmenize yardımcı olabilir. Ayrıca, bu biyomoleküllerin bazıları da biyoteknolojik uygulamalar açısından ilginç. Burada açıklanan cyanobacterial serbest karbonhidrat polimerleri ve proteinlerin kolay ve hızlı yalıtım için iki protokol vardır. Yayımlanan karbonhidrat polimerlerinin yalıtım yöntemi, organik çözücüler kullanarak sulu çözümlerde polisakkaritlerin geleneksel yağış tekniklerini temel alır. Bu yöntem polimer özelliklerini korur ve aynı anda hücre enkaz ve kültür ortamından kirleticilerin varlığını önler. Sürecin sonunda, liyofilize polimer kullanılmak üzere hazır veya karakterize veya son amaçlanan kullanıma bağlı olarak, arıtma daha fazla tur maruz kalabilirler. Cyanobacterial exoproteomun izolasyonu ile ilgili olarak, teknik, büyük kirleticilerin santrifüjleme ve filtrasyon ile kaldırılmasından sonra hücre içermeyen ortamın konsantrasyonuna dayanır. Bu strateji, membran taşıyıcıları veya dış membran veziküller üzerinden ekstrülüler ortama ulaşan proteinleri güvenilir bir şekilde yalıtmayı sağlar. Bu proteinler daha sonra standart kütle spektrometresi teknikleri kullanılarak tespit edilebilir. Burada sunulan protokoller sadece geniş bir siyanobacteria yelpazesine değil, aynı zamanda diğer bakteriyel suşların da uygulanabilmektedir. Ayrıca, bu prosedürler, ürünlerin son kullanımına, gerekli saflık derecesine ve bakteriyel gerilime göre kolayca uyarlanmış olabilir.

Şekil 1' de, siyanobakteryal kültürlerden serbest bırakılan karbonhidrat polimerlerini ayıklamak için açıklanan yöntemin şematik bir gösterimi gösterilmiştir. Orta EPS üreticilerinden siyanobacterium Synechocystis Sp. pcc 6803 ve verimli EPS üreticisi cyanothece sp. ccy 0110 ' den çöktürülmüş polimerler Şekil 2' de gösterilir. Şekil 3' te, farklı kirlilik derecelerine sahip likofilize poli...

Watch this Scientific Journal Video about Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins at JoVE.com

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

Dışa bakıyor: Siyanobacterial serbest karbonhidrat polimerleri ve proteinleri Izolasyonu

Burada, siyanobakteryal serbest karbonhidrat polimerlerinin izolasyonu ve exoproteomlarının izolasyonu için protokoller açıklanmıştır. Her iki prosedür de, daha fazla analiz veya uygulama için kullanılabilecek yüksek saflık derecelerine sahip Polimerler veya proteinleri elde etmek için önemli adımları somutlaştırmak. Ayrıca, belirli kullanıcı ihtiyaçlarına göre kolayca adapte edilebilir.

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Geliştirdiğimiz bu protokoller siyanobakterilerin ve bunların serbest bırakılan ürünlerindeki salgı mekanizmalarını, yani hücre dışı karbonhidrat polimerlerini ve proteinlerini incelemek için önemlidir. Üretilen bilgi bize çeşitli uygulamalar, yani biyoteknolojik ve biyomedikal uygulamalar için bu ürünleri özelleştirmek için izin verecektir. Bu protokoller çok basittir.Bunlar, üretim yapan organizmaya, kullanıcının ihtiyaçlarına ve ürünün son uygulamasına göre uyarlanabilir. Bu protokollerin en büyük avantajı, diğer canlı sistemlere, özellikle de diğer bakterilere kolayca adapte edilebilmelidir. Bu protokoller çok kolay.Ancak, bir bakteriyel zorlanma veya gerekli saflık derecesine bağlı olarak bazı değişiklikler tanıtmak gerekebilir. Başlamak için, standart koşullar altında siyanobakteriyel zorlanma yetiştirmek. Büyümeyi standart protokolleri kullanarak ölçün.Daha sonra, diyaliz membranları içine kültür aktarın ve sürekli karıştırma ile 24 saat boyunca deiyonize su en az 10 hacimli karşı diyaliz. 15 dakika boyunca 4 santigrat derece de 15, 000 kez g de kültür santrifüj. Supernatant'ı yeni bir şişeye aktarın ve peleti atın.Hücre duvarı enkazı veya lipopolysaccharides gibi kirleticimaddeleri temizlemek için 15 dakika boyunca 4 santigrat derecede 20, 000 kez g tekrar santrifüj. Santrifüjden sonra, supernatant'ı cam bir kabına aktarın ve peleti atın. Polimer çökelti için, supernatant için% 96 etanol iki cilt ekleyin ve bir gecede dört derece santigrat süspansiyon kuluçka.Çökelmiş polimerin küçük veya görünür olmayan miktarları için süspansiyonu 13,000 kez g'de 4 santigrat derecede 25 dakika santrifüj edin. Yavaşça supernatant atın ve otoklavlı deiyonize su bir ila iki mililitre pelet resuspend. Sulu süspansiyonu bir şişeye aktarın.Görünür için, çökelmiş polimer büyük miktarda, bir şişe steril metal forseps ile çökelmiş polimer toplamak. Polimer sıkmak ve aşırı etanol atın. Donma-kurutma olarak bilinen lyophilization işlemini gerçekleştirmek için, eksi 80 santigrat derece bir gecede çökelmiş polimer ile şişeleri tutun.Polimeri en az 48 saat boyunca lyophilize edin. Daha sonra kurutulmuş polimeri oda sıcaklığında daha fazla kullanılana kadar kurutucuda saklayın. Orta konsantre etmek için, ilk standart koşullar altında siyanobakteriler yetiştirmek.Standart prosedürleri kullanarak siyanobacterium büyümesini izleyin. Daha sonra, 10 dakika oda sıcaklığında 4, 000 kez g kültürleri santrifüj. Supernatant'ı bir şişeye aktarın ve hücre peletini atın.Ardından, decanted ortamı 0,2 mikron luk gözenek boyutu filtresinden süzün. Orta yaklaşık 500 kez konsantre etmek için, santrifüj konsantratörleri kullanarak üç kilodaltondan 4, 000 kez g ve 15 santigrat dereceyi maksimum bir saat santrifüj mermisi için kesin. Santrifüjden sonra, filtre cihazı örnek haznesi duvarlarını konsantre numune ile durulayın ve içeriği mikrosantrifüj tüpüne aktarın.Maksimum ekzoproteom geri kazanımı sağlamak için otoklavlı kültür ortamı ile filtre cihazı örnek rezervuar ek bir yıkama adımı gerçekleştirin. Daha sonra ekoproteom örneklerini eksi 20 santigrat derecede daha fazla kullanılana kadar saklayın. Polimer çökeltme ve verim optimize etmek için etanol şiddetle eklenmelidir.Çökelmiş polimersantrik sonra, şişe duvarına gevşek bağlı olabilir pelet resuspension önlemek için supernatant atılması dikkatle yapılmalıdır. Manuel filtrasyon yapılırsa, filtre zarının kırılmasını önlemek için nazik olmalıdır. Bazı çökelmiş polimerler sadece santrifüjden sonra görülebilir, özellikle şişelerin duvarlarında, Synechocystis EPS durumda gibi.Siyanothece polimeri gibi diğer durumlarda, yağıştan hemen sonra cam kabın içinde yüzen polimer kümeleri görmek mümkündür. Bazı kontaminasyonlar polimer liofilizasyondan sonra makroskopik olarak kolayca tespit edilebilir, çünkü genellikle beyaz veya açık kahverengi polimer pigmentasyonunu değiştirirler. Turuncu polimerler karotenoidler veya bu pigmentleri içeren yapılar ile kontamine edilir.Örneğin, yeşil polimerler hücre enkazı ve klorofil ile kontamine edilir. Ekoproteomlar bakteriyel suşbağlı olarak önemli ölçüde değişebilir. Örneğin, tek hücreli bir siyanobakteriden ekoproteom ve ipliksi bir türden gelen.Eksoproteom konsantre numunelerde yüksek miktarda polisakkarit eksoproteom analizini engelleyebilir. Örneğin, protein ayrıştırma geciktirebilir ve maske daha az bol proteinler. Kullanıcı polimeri bileşimi, fiziksel/kimyasal özellikleri, test polimer biyolojik aktivitesi veya modifiye polimer bileşenleri açısından karakterize edebilir.Protein tanımlaması için jel ve kütle spektrometresi proteinlerinin ayrılması yapılabilir. Veziküllerin ayrılması için eksoproteomun ultrasantrifüjü yapılmalıdır. Grubumuzda, bu protokoller zaten biyoremediasyon veya antitümör veya ilaç dağıtım ajanları gibi farklı alanlarda, siyanobakteriyel salgı mekanizmaları veya ekstrasellüler karbonhidrat polimerlerin uygulamaları çözmek için yol açmıştır.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Biochemistry of the Cell

SCIENTISTS IN ACTION

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

Yeni çözünmez Kromojenik altyapı deneyiyle kitleri kullanılarak karbonhidrat parçalayıcı Enzimlerin yüksek verimli tarama

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Bitki Buz yakınlık Arıtma kullanma Buz yeniden kristalleşme İnhibisyon ve İzolasyonu Değerlendirilmesi sayesinde Proteinler Buz bağlayıcı tanımlanması

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

Yaşlanmaya Bağlı Translasyon Sonrası Değişiklikleri İncelemek İçin Birden Fazla Fare Dokusundan Ara Filament Proteinlerinin İzolasyonu

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Karbonhidrat taşıma substrat-bağlayıcı-protein SP0092 biyokimyasal ve yapısal karakterizasyonu

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

Dinamik Protein kompleksleri analiz monte ve kütle spektrometresi ve Elektron Mikroskopisi kullanılarak Biolayer Interferometry biyoalgılayıcı--dan serbest bırakmak

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Yalıtım Glomeruli ve Glomerular hücre yüzey proteinleri Vivo etiketleme

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Floresan gümüş Polyacrylamide jeller proteinlerin boyama

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Interfacial Molecular-level Structures of Polymers and Biomacromolecules Revealed via Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy

Toplam Frekans Üretimi TitreşimSpektroskopisi Ile Ortaya Çıkan Polimerlerin ve Biyomakromoleküllerin İnterasfer Moleküler Düzey Yapıları

As a second-order nonlinear optical spectroscopy, sum frequency generation (SFG) vibrational spectroscopy has widely been used in investigating various ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Floresan Sumo-bindirme proteinleri kullanarak SUMO-modifiye proteinlerin lokalizasyonu

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Preparation of High-Quality Fermented Fish Product

Yüksek Kaliteli Fermente Balık Ürününün Hazırlanması

This protocol provides a method for preparation of industrialized fermented fish product with sturgeon (Aquilaria sinensis) meat product. The procedures ...