Name: murine myocardial infarction model using permanent ligation of left anterior descending coronary artery
Uploaded: 2019-08-16T13:00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery at JoVE.com

Questo modello è stato sviluppato con il supporto della Fondazione nazionale svizzera per la scienza (Concede 310030_162629 a LL) e dei fondi dipartimentali provenienti dai servizi di Chirurgia Toracica e Medicina Intensiva dell'Ospedale Universitario di Losanna. JL è insignito di una sovvenzione dalla Fondazione Emma Muschamp. Riconosciamo il supporto cruciale dei veterinari e del personale addetto alle strutture animali della Facoltà di Biologia e Medicina dell'Università di Losanna. Ringraziamo la Dott.ssa Giuseppina Milano del Servizio di Chirurgia Cardiaca dell'Ospedale Universitario di Losanna e il Dr. Alexandre Sarre dell'Università di Losanna per i loro suggerimenti tecnici.

Gli esperimenti sugli animali descritti in questo protocollo sono stati esaminati e approvati dal Comitato Etico Animale del Cantone di Vaud.
NOTA: Per questi esperimenti, abbiamo usato topi maschi C57Bl/6J del peso compreso tra 25 g e 30 g e un'età di 8-12 settimane. I topi sono stati alimentati chow pellet e acqua al libitum e allevati in condizioni convenzionali. Le apparecchiature chirurgiche sono state precedentemente sterilizzate. Lo sperimentatore deve indossare guanti chirurgici sterili e una maschera chirurgica per limitare la contaminazione e le infezioni post-operatorie.
1. Anestesia e canonazione tracheale.
<ol><li>Pesare il topo per determinare il dosaggio di farmaci anestetici, farmaci analgesici post-operatori e volume di marea del ventilatore. Preriscaldare la piastra di riscaldamento a 37 gradi centigradi. L'impostazione chirurgica è raffigurato in Figura 1.</li>
	<li>Iniettare il topo intraperitonealmente con un mix di ketamina e xilanina a una dose di 80 mg/kg e 10 mg/kg rispettivamente.</li>
	<li>Rade rapidamente la pelliccia di topo sulla gola e sul lato sinistro della gabbia toracica utilizzando un rasoio elettrico.</li>
	<li>Controllare la profondità dell'anestesia pizzicando la coda e/o i piedi posteriori e sistemare l'animale in una posizione supina sul pad di riscaldamento. Posizionare una piccola garza comprimere sotto la testa dell'animale per evitare il surriscaldamento degli occhi. Applicare il gel oculare per evitare la secchezza degli occhi.</li>
	<li>Fissare i quattro arti con nastro adesivo sulla superficie del pad di riscaldamento. Passare un anello di sutura di seta 5-0 sotto gli incisivi superiori e attaccare l'estremità del ciclo con del nastro adesivo sul pad di riscaldamento. Questo manterrà la bocca dell'animale aperta e faciliterà la cannulation.</li>
	<li>Applicare la crema per la depilazione sulle aree pre-rasate e massaggiare delicatamente con un tampone di cotone per 1 min. Utilizzare gocce di soluzione salina dello 0,9% e garza per pulire le aree di incisione. Applicare pezzi di garza sterile sulla gola rasata e torace e immergerli in iodopovidone. NOTA: Si consiglia l'applicazione di un farmaco anestetico locale (lidocaina o bupivacaina) ai siti di incisioni.</li>
	<li>Impostare il ventilatore ad un volume di marea di 7 mL/kg e velocità di ventilazione di 140 colpi/min. NOTA: D'ora in eseguito il lavoro sotto uno stereomicroscopio di microchirurgia.</li>
	<li>Tenere la pelle al centro della gola ed eseguire un'incisione di 0,5 cm seguendo una linea caudale / cefalica utilizzando piccole forbici. Separare i lobi della ghiandola salivare, quindi separare delicatamente la fascia del muscolo sternoioide con pinze di dissezione curve fino a quando la lasuge e trachea sono visibili. Bordi sicuri dell'apertura con retrattili attaccati a elastici. NOTA: Fare questo passaggio senza incisione dei muscoli. Un operatore addestrato sarà in grado di intubare l'animale tramite cavità orale senza la visualizzazione della trachea rendendo questo passaggio opzionale.</li>
	<li>Tenere delicatamente la lingua lateralmente. Con le pinze, inserire l'ago interno smussato di una cannula da 16 G nella trachea. Visualizza il corretto inserimento nella trachea attraverso l'incisione della gola.</li>
	<li>Collegare la cannula al ventilatore e garantire una corretta ventilazione mettendo il tubo di scarico in acqua. La presenza di bolle indica una corretta intubazione. NOTA: Al fine di mantenere i tessuti bagnati durante l'operazione luogo garza sterile imbevuto di soluzione salina 0.9% e iodopovidone sull'incisione gola. Controllare l'umidità durante la procedura.</li>
</ol>2. Ligazione dell'arteria coronaria LAD
<ol><li>Rilasciare la zampa anteriore sinistra dal nastro adesivo e spostare con attenzione il mouse nella posizione decubito lato destro. Fissare l'arto anteriore sinistro una volta che l'animale è nella posizione corretta.</li>
	<li>Identificare la linea tra i muscoli minori e principali pettorali sinistro e fare un'incisione oblique della pelle su 1 cm con le forbici che seguono la linea. Con micro forbici smussate, fascia separata dei muscoli pettorali senza incisione. Mantenere i muscoli pettorali separati da retrattili attaccati a elastici.</li>
	<li>Impostare il ventilatore con una pressione positiva end-expiratory (PEEP) di 3 cm H2O.</li>
	<li>Aprire la cavità toracica utilizzando pinze smussate al 3rd spazio intercostale tra 3rd e 4th costole. Evitare di toccare l'arteria toracica interna in quanto vi è il pericolo di sanguinamento. Non toccare il cuore o il polmone. Applicare due retrattili nella gabbia toracica, uno per ogni costola (Figura 2A).</li>
	<li>Con una pinze sottili curve, rimuovere con attenzione il pericardio e tirarlo a parte senza danneggiare il cuore e i polmoni.</li>
	<li>Individuare l'arteria coronaria anteriore decrescente (LAD) sinistra. L'arteria LAD appare come una linea superficiale di colore rosso brillante che corre dal bordo del cauricolo sinistro verso l'apice.</li>
	<li>Utilizzare un supporto ad ago per passare una sutura di seta 7-0 sotto il LAD da 2 a 3 mm sotto gli atri a sinistra. Tirare la seta lentamente per evitare una strappo del tessuto cardiaco. Legare la legatura con tre nodi. La parte inferiore sinistra del ventricolo sinistro impallidisce istantaneamente alla legatura (Figura 2B-E). NOTA: È importante non andare troppo in profondità nella cavità ventricolare o rimanere troppo superficiali. Per gli animali con finta, tirare la seta di sutura sotto il LAD e rimuoverla lentamente evitando la lacerazione dei tessuti.</li>
	<li>Rilasciare i retrattili delle costole, tenere la costola 3rd con pinze e fare due passaggi con una sutura di seta 6-0 sotto le costole 3rd e 4th. AVVISO: Non il cuore perforato o polmone. Non stringere ancora i nodi.</li>
	<li>Mettere tre gocce di 37 c 0,9% soluzione salina sull'apertura e chiudere il tubo di scarico di scadenza per 2 o 3 cicli respiratori per gonfiare correttamente i polmoni. Stringere la sutura e fissarla con due tiri.</li>
	<li>Rilasciare i retrattili che tengono i muscoli e aiutarli a recuperare il posto giusto.</li>
	<li>Chiudere la pelle toracica con due punti di seta sutura 5-0 e fissarla con due tiri. Chiudere la pelle della gola con un punto di seta di sutura 5-0 e fissare con due tiri.</li>
</ol>3. Procedure post-operatorie e follow-up.
<ol><li>Rimuovere i nastri adesivi dagli arti. Mettere un impacco sul pad di riscaldamento sul lato destro dell'animale. NOTA: La procedura complessiva dall'anestesia a questo punto non dovrebbe richiedere più di 40-45 min.</li>
	<li>Intraperitonealmente iniettare 0,3 mL di 5% soluzione di glucosio preriscaldata a 37 gradi centigradi.</li>
	<li>Girare con attenzione l'animale sul decubito ventrale sul blocco di compressione.</li>
	<li>Fermare il ventilatore; se il mouse respira spontaneamente, rimuovere con cautela la cannula.</li>
	<li>Iniettare la buprenorfina sottocutanea (SC) 0,1 mg/kg e mettere i topi in una gabbia preriscaldata riscaldata a 30 gradi e ventilata con un 100% O2 per un minimo di 1 h. Monitorare i topi per qualsiasi condizione pericolosa per la vita come dispone o emorragia eccessiva.</li>
	<li>Durante i due primi giorni dopo l'intervento chirurgico, monitorare il mouse due volte al giorno. Iniettare SC 0,1 mg/kg di buprenorfine due volte al giorno. Intraperitonealmente iniettare 0,3 mL 0 di 5% soluzione di glucosio due volte al giorno. Fornire ai topi una dieta morbida e acqua al libitum. Riscaldare l'animale, se necessario. NOTA: Oltre agli oppioidi, gli animali devono essere dotati di farmaci antinfiammatori non steroidei miscelati in dieta o diluiti nell'acqua potabile.</li>
	<li>Dal terzo giorno, iniettare SC 0.1 mg/kg buprenorfina due volte al giorno se l'animale presenta segni insoliti riguardanti l'aspetto generale, la respirazione o il comportamento. Intraperitonealmente iniettare 0.3 mL di 5% soluzione di glucosio due volte al giorno se l'animale sta ancora perdendo peso. Riscaldare l'animale se necessario. NOTA: Applicare rigorosamente criteri di interruzione predefiniti quando necessario per evitare sofferenze eccessive. Di solito i topi perdono peso fino al giorno 3 e 4 e poi aumentano di peso. Dopo sette giorni, i topi di solito recuperano il peso pre-operativo.</li>
</ol>

<ol>
	<li>GBD 2016 Causes of Death Collaborators. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=regional,+and+national+age-sex+specific+mortality+for+264+causes+of+death,+1980-2016:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study.">regional, and national age-sex specific mortality for 264 causes of death, 1980-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study.</a> Lancet. 390 (10100), 1151-1210 (2017).</li><li>Reed, G. W., Rossi, J. E., Cannon, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myocardial+infarction.">Acute myocardial infarction.</a> Lancet. 389 (10065), 197-210 (2017).</li><li>Frangogiannis, N. 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(99), e52197 (2015).</li><li>van den Bos, E. J., Mees, B. M., de Waard, M. C., de Crom, R., Duncker, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+model+of+cryoinjury-induced+myocardial+infarction+in+the+mouse:+a+comparison+with+coronary+artery+ligation.">A novel model of cryoinjury-induced myocardial infarction in the mouse: a comparison with coronary artery ligation.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 289 (3), H1291-H1300 (2005).</li><li>Duerr, G. 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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La prima fase critica di questa procedura è certamente l'intubazione. Usiamo l'ago interno smussato di un catetere 16 G come tubo tracheale. Si sconsiglia di utilizzare questa configurazione con topi che pesano meno di 22 g. Con questa configurazione, può essere difficile intubare i topi correttamente con peso corporeo più piccolo senza danneggiare la trachea. Un altro punto critico è quello di limitare le incisioni fatte al muscolo mentre espongono la trachea e la gabbia toracica. Ridurre il danno ai tessuti è di grande importanza, soprattutto quando si studiano i processi infiammatori successivi a MI. Ecco perché preferiamo la delicata diffusione del muscolo e delle costole con pinze e retrattili8,9. Non usiamo cauterizzatore elettrico per controllare il sanguinamento10. Questo può causare ustioni iatrogeniche e favorire le infezioni. Sia i traumi che le infezioni possono disperdere le letture infiammatorie. L'applicazione di un PEEP estrinseca di 3 cm H2O facendo immergere lo scarico di ventilazione in un tubo dell'acqua limita il collasso dell'alveolare end-expiratory durante la toracotomia. La localizzazione di LAD è un altro passo critico e si dovrebbe tenere a mente che l'anatomia delle arterie coronarie può variare a seconda del ceppo e il genotipo del topo11. Richiede una certa esperienza per visualizzare il LAD, tuttavia posizionando la sutura direttamente 2-3 mm sotto gli atri a sinistra come descritto nella procedura deve consentire il corretto posizionamento della legatura. Lo scolorimento istantaneo di grandi porzioni del ventricolo sinistro sotto la sutura conferma la precisione. Infine, l'applicazione artificiale di auto-PEEP bloccando lo scarico di ventilazione per 2-3 cicli respiratori durante la chiusura toracica consente un'iperinflazione transitoria del polmone che aiuterà a inseguire l'aria dalla cavità toracica12. Non eseguiamo intenzionalmente una toracentesi come mostrato in 9,10. In questo modo, limitiamo il rischio di lesioni polmonari e cardiache ed evitiamo danni eccessivi ai tessuti o perforazioni.
La miocardia-reperfusione (I/R) è un modello chirurgico correlato che imita il ripristino del flusso sanguigno coronarica che viene fatto ai pazienti miti nelle cliniche. Durante il modello I/R viene eseguita un'occlusione transitoria dell'arteria coronaria stringendo un pezzo di tubo sul LAD per una durata di 20-45 min8,13. Quindi l'occlusione viene rilasciata per consentire la riperfusione del miocardio per la durata desiderata. Questa semplice modifica applicata al nostro protocollo può facilmente trasformarla in un modello I/R4,8,14,15. L'infarto può essere confermato da un esame del sangue per troponina cardiaca T8,10 o da ecocardiografia15.
MI si differenzia dal modello I/R perché la riperfusione di per sé induce un infortunio. MI induce più necrosi tissutale e apoptosi è più pronunciata nel miocardio reperfuso5. Cinetica delle cellule infiammatorie infiltrazione è anche diverso tra in MI e IR con un'infiltrazione miocardiale ritardata delle cellule immunitarie in MI7. Le dimensioni e la posizione dell'area infarto differiranno anche tra i modelli di ligazione permanente e i modelli I/R15. Tenendo questo in mente, bisogna essere cauti di scegliere un modello rilevante dal momento che i modelli I/R e MI permanente non sono equivalenti. Un altro modello murino dell'infarto miocardico è il modello crioinfarinia. L'applicazione di una sonda criogenica sulla parete anteriore LV induce il congelamento del tessuto ventricolare e l'arresto del flusso sanguigno nell'arteria LAD. Questa tecnica tuttavia differisce dalle tecniche MI e I/R per quanto riguarda la tempistica e l'ampiezza di rimodellamento e risposte infiammatorie16,17.
La variabilità è una limitazione come per qualsiasi procedura chirurgica. Questa variabilità si basa sulle differenze biologiche. Un buon esempio è la variazione nella disposizione coronarica arteriosa nei topi11. Si basa anche sulle abilità degli sperimentatori. Vale la pena ricordare che un'adeguata formazione degli sperimentatori è obbligatoria per raggiungere risultati stabili con questo modello. Uno sperimentatore ben addestrato può facilmente produrre dimensioni infarto che sono riproducibili (Figura 3A-B). La mortalità del modello dipende dalla posizione del LAD, dalla durata degli esperimenti (giorni, settimane), dalla deformazione del topo e dai genotipi. I tipi di farmaci anestetici e analgesici possono anche influenzare l'esito degli esperimenti con effetti cardioprotettivi o cardiodepressivi. Nelle nostre mani, questo modello ha un tasso di mortalità globale del 25-30%. Questo tasso di mortalità comprende morti e sacrifici spontanei prima della fine dell'esperimento, indipendentemente dai ceppi e dalla durata dell'esperimento. La maggior parte dei decessi o sacrifici sono tra il secondo e il quarto giorno dopo l'intervento chirurgico. L'applicazione di una rigorosa gestione del dolore e il follow-up degli animali può ridurre la mortalità.
Qui presentiamo risultati rappresentativi della dimensione infarto analizzati utilizzando la colorazione E'cdi ttC e l'espressione di proteine e geni coinvolti nei processi infiammatori o fibroti in LV da macchia occidentale e PCR in tempo reale rispettivamente (Figura 3C-G). È anche possibile misurare molti di questi parametri mediante saggi immunosorbena enzimatici (ELISA) o saggi enzimatici. Naturalmente, secondo ipotesi che deve essere testata, questo metodo può essere seguito da qualsiasi analisi funzionale da ultrasuoni, risonanza magnetica o misurazione catetere intraventricolare di pressione e volume. È anche possibile estrarre il cuore e studiare ulteriormente la biologia delle cellule cardiache su cellule isolate. Nel complesso, il modello MI con legatura permanente dell'arteria coronaria LAD è particolarmente utile per valutare i processi infiammatori e fibrotici, la guarigione delle ferite e i cambiamenti nella funzione cardiaca dopo l'infarto miocardico.

L'infarto miocardico acuto (MI) è l'espressione più grave di malattie cardiache ischemiche (IHD). IHD sono la principale causa di morbilità e morte in tutto il mondo, soprattutto nei paesi occidentali1. Di conseguenza, ha un enorme impatto economico sui sistemi sanitari2. L'MI è caratterizzato dall'occlusione di un'arteria coronaria da parte della placca aterosclerotica e dal successivo arresto del flusso sanguigno in gran parte del miocardio. La mancanza di apporto di ossigeno nel miocardio porta alla morte ischemica dei cardiomiociti. Questa condizione patologica innesca risposte nel tessuto ventricolare che alla fine porta a carenze nelle funzioni ventricolari, rimodellamento e insufficienza cardiaca3 . L'MI è una complessa condizione patofisiologica che coinvolge processi biologici multipli e intricati che comprendono la morte regolata delle cellule, la risposta allo stress ossidativo, l'infiammazione, la guarigione delle ferite, la fibrosi e il rimodellamento ventricolare. Alcune di queste risposte biologiche sono modellate come singoli processi in vitro come il rilascio indotto dalla necrosi dei modelli molecolari associati ai danni e le risposte infiammatorie associate4. Questi modelli semplificati sono essenziali per comprendere l'MI. Tuttavia solo un modello in vivo può fornire un'immagine realistica della complessità dei processi biologici impegnati in risposta all'MI.
Anche se i modelli di MI in animali più grandi come i maiali possono essere più strettamente correlati alla fisiopatologia umana di MI, la potenza dei modelli murini risiede nelle possibilità offerte dall'ingegneria genetica che è più avanzata che in qualsiasi altra specie di mammiferi. Altri aspetti non trascurabili sono il relativo basso costo e la semplicità della configurazione chirurgica.
Vale la pena ricordare che i modelli di ischemia-reperfusione del miocardio possono presentare risultati diversi rispetto ai modelli MI permanenti. Processi biologici come il tipo di morte cellulare impegnata, qualità/ampiezza o cinetica delle risposte infiammatorie e di guarigione delle ferite nel tessuto miocardico possono variare a seconda del modello5,6,7. Tuttavia, questo protocollo di occlusione coronarica permanente può essere facilmente adattato per ottenere un modello di ischemia-reperfusione.
Questo metodo è rilevante per gli studi relativi alla fisiopatologia dell'MI senza riperfusione e consente il monitoraggio dei processi patologici che si verificano dall'occlusione coronarica (minuti) all'insufficienza cardiaca in fase avanzata (settimane) presso il tessuto cardiaco locale e Livelli.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:588px;" width="589">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:221px;">1 CC Syringe, Omnifix-F</td>
			<td style="width:73px;">B. Braun</td>
			<td style="width:123px;">9161406V</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:221px;">30G- Needle</td>
			<td style="width:73px;">BD Microlance 3</td>
			<td style="width:123px;">304000</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:221px;">70% Ethanol</td>
			<td style="width:73px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:221px;">Betadine 60 ml</td>
			<td style="width:73px;">MundiPharma</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:221px;">Blunt Retractors</td>
			<td style="width:73px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:123px;">18200-09</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:221px;">Castroviejo Needle Holder Straight with Lock</td>
			<td style="width:73px;">Roboz</td>
			<td style="width:123px;">RS-6416</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:221px;">Cotton Swabs</td>
			<td style="width:73px;">Applimed SA</td>
			<td style="width:123px;">6001109</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:221px;">Dissecting Scissors, Curved</td>
			<td style="width:73px;">Aesculap</td>
			<td style="width:123px;">BC603R</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:221px;">Electrical Razor</td>
			<td style="width:73px;">Remington</td>
			<td style="width:123px;">HC720</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:221px;">Glucose 5% B.Braun</td>
			<td style="width:73px;">B. Braun</td>
			<td style="width:123px;">531032</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:221px;">Hair Removal Cream, Veet</td>
			<td style="width:73px;">Silk &#38; Fresh Tech.</td>
			<td style="width:123px;">8218535</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:221px;">Iris Dissecting Forceps Full Curved</td>
			<td style="width:73px;">Aesculap</td>
			<td style="width:123px;">&#160;OC022R</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:221px;">Ketasol 100 (100 mg/ml)</td>
			<td style="width:73px;">Dr. E. Graeub AG</td>
			<td>QN01AX03</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:221px;">Micro Scissors, Curved Blunt/Blunt</td>
			<td style="width:73px;">Aesculap&#160;</td>
			<td style="width:123px;">FM013R</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:221px;">NaCl 0.9% B. Braun</td>
			<td style="width:73px;">B. Braun</td>
			<td style="width:123px;">534534</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:221px;">Short Fixator</td>
			<td style="width:73px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:123px;">18200-01</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:221px;">Silk Suture 5-0, BB</td>
			<td style="width:73px;">Ethicon</td>
			<td style="width:123px;">K880H</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:221px;">Silk Suture 6-0, P-1</td>
			<td style="width:73px;">Ethicon</td>
			<td style="width:123px;">639H</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:221px;">Silk Suture 7-0,BV-1</td>
			<td style="width:73px;">Ethicon</td>
			<td style="width:123px;">K804</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:221px;">Student Dumont #7 Forceps</td>
			<td style="width:73px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:123px;">91197-00</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:221px;">Student Fine Forceps-Angled</td>
			<td style="width:73px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:123px;">91110-10</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:221px;">Surgical Gloves</td>
			<td style="width:73px;">Weitacare</td>
			<td style="width:123px;">834301</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:221px;">Surgical heating pad</td>
			<td style="width:73px;">Personalized setting</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:221px;">Temgesic&#160; sol 0.3 mg/ml&#160; Buprenorphine</td>
			<td style="width:73px;">Indivior Schweiz AG</td>
			<td style="width:123px;">N02AE01</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:221px;">Tracheal tube inner needle of an 16G i.v. cat</td>
			<td style="width:73px;">Abbocath-T</td>
			<td style="width:123px;">G714-A01</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:221px;">Universal S3 Microscope, OMPIMD</td>
			<td style="width:73px;">Zeizz</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:221px;">Ventilator, MiniVent Model 845</td>
			<td style="width:73px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:123px;">73-0043</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:221px;">Viscotears</td>
			<td style="width:73px;">Alcon</td>
			<td style="width:123px;">1551535</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:221px;">Xylasol (1mg/ml)</td>
			<td style="width:73px;">Dr. E. Graeub AG</td>
			<td>QN05CM92</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

murine myocardial infarction model using permanent ligation of left anterior descending coronary artery

L'infarto miocardico (MI) e le malattie coronariche acute sono tra le principali cause di morte nella popolazione con stile di vita occidentale. I modelli murini di MI con legatura permanente dell'arteria coronaria discendente sinistra-anteriore (LAD) imitano da vicino MI negli esseri umani. I modelli Murine beneficiano della vasta ingegneria genetica oggi disponibile. Qui proponiamo un modello chirurgico murino riproducibile dell'infarto miocardico per legatura coronarica permanente LAD. La nostra tecnica comprende l'anestesia con chetamina/xilazina che può essere rapidamente invertita con la somministrazione di un antagonista, intubazione senza tracheotomia per la ventilazione assistita meccanica, ventilazione con applicazione di positivo estrinseco pressione end-expiratory (PEEP) per evitare il collasso alveolare, un metodo di toracotomia che limita le lesioni chirurgiche minime apportate ai muscoli scheletrici e l'inflazione polmonare senza toracenesi. Questo metodo è scarsamente invasivo, riproducibile e riduce la mortalità e le complicazioni post-chirurgiche.

I topi sono stati eutanasia sette giorni dopo l'intervento chirurgico. Gli animali erano anestesizzati con 80 mg/kg di ketamina e 10 mg/kg di xilizina. In anestesia, il sangue veniva prelevato dalla vena cava e il cuore veniva campionato. Gli Atria sono stati rimossi, il miocardio sono stati lavati in PBS ghiacciato. Per le misurazioni delle aree ischemiche, i cuori sono stati congelati a -20 gradi centigradi per 40 minuti, quindi tagliati a fette per 20 minuti a 37 gradi centigradi in PBS contenenti 2% di cloruro di tripiletrazolio (TTC). Le fette cardiache sono state fissate durante la notte in una soluzione di paraformaldeide tampolatata del 4% tamponellata a temperatura ambiente. Le aree ischemiche sono rimaste incontaminate, mentre il tessuto vivo è stato macchiato di rosso a causa della presenza di diigenasi. Le aree ischemiche sono state calcolate come percentuale dell'area bianca del ventricolo sinistro (LV) con un software di imaging (Figura 3A, B). Per le analisi biochimiche e di biologia molecolare, i cuori sono stati congelati in azoto liquido. Dopo aver macinato i cuori sull'azoto liquido, l'organo in polvere è stato utilizzato per l'estrazione di proteine e mRNA. L'estensione della fibrosi nel tessuto miocardico dei cuori infardati è stata valutata mediante l'analisi occidentale dell'atto del muscolo liscio alfa (zMA) e del fosforolante SMAD2, che sono rispettivamente le principali letture dei miofibromi e dell'attivazione della segnalazione di TGF ( Figura 3C). espressione mRNA di Tgfb, e obiettivi a valle Ctgf, Postn e Il11 sono tutti indicatori di fibrosi miopamica. Ciò è stato dimostrato dall'analisi della reazione a catena della polimerasi in tempo reale (PCR) (Figura3D).
I percorsi di segnalazione pro-infiammatori e l'espressione dei geni pro-infiammatori sono stati in genere trovati attivati entro la prima settimana dopo l'infarto miocardico. La fosforolalazione del fattore di trascrizione NF-B p65 è un segno distintivo dell'infiammazione ed è stata osservata in estratti di miocardio interi dei topi MI (Figura 3E). espressione mRNA di geni pro-infiammatori Il1b, Il6 e Cxcl10 (Figura 3F) e marcatori monociti/macrofagi Cd14 e Mertk sono stati analizzati da PCR in tempo reale (Figura 3G). Si noti che c'era una variabilità nell'estensione di p65 NF-B e fosfororylazione SMAD2 (Figura3C,E, corsie 4-7). Questa variabilità dipende in gran parte dalle dimensioni dell'infarto.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59591/59591fig1.jpg"> Figura 1 : Descrizione della configurazione chirurgica. (A) L'installazione chirurgica comprende un cuscinetto di riscaldamento modificato, un ventilatore e retrattori attaccati a elastici. (B) Set di forbici, pinze e portaa ago utilizzati durante l'intervento chirurgico. (C) Primo piano dei mini-retrattili. Non mostrato: microscopio stereo chirurgico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59591/59591fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59591/59591fig2.jpg"> Figura 2 : Immagini rappresentative dell'intervento chirurgico e della legatura LAD. (A) Torace aperto con retrattili. Il ventricolo sinistro era evidente. I retrattori superiore, sinistro e inferiore tenevano la gabbia toracica e il retrattore destro teneva il muscolo pettorale. (B) L'ago è stato passato sotto il LAD. (C) La seta di sutura è stata passata sotto il LAD, nel ventricolo sinistro. (D) Punto singolo sul LAD. (E) Fine della procedura di legatura, la sutura è stata fissata con tre nodi. (F) Rappresentazione di una vista anteriore del cuore. La posizione della legatura LAD era 2-3 mm sotto gli atri a sinistra e sopra il ramo diagonale del LAD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59591/59591fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59591/59591fig3.jpg"> Figura 3 : Fibrosi e infiammazione in estratti di miocardio sette giorni dopo l'intervento chirurgico. (A) Immagini rappresentative della colorazione TTC di un cuore affettato sette giorni dopo l'intervento chirurgico. Le aree ischemiche pallide sono rimaste instainate e bianche, mentre il tessuto vivo era macchiato di rosso. La legatura era visibile sulla terza fetta da sinistra. (B) Le dimensioni delle aree ischemiche di cinque cuori infarto sono state misurate utilizzando la tecnica di colorazione TTC. I risultati sono stati la percentuale di area bianca del ventricolo sinistro (LV). (C) Analisi occidentale della fosfororylazione SMAD2 e dell'espressione alfa-SMA in tutto il miocardio come indicatori della fibrosi. (D) espressione mRNA di Tgfb, Ctgf, Postn e Il11 in estratti di miocardio interi. (E) Macchia occidentale di anN-B p65 fosfororylazione in estratti interi di miocardio. (F) espressione mRNA dei geni pro-infiammatori Il1b, Il6 e Cxcl10 in estratti interi di miocardio. (G) espressione mRNA di Cd14 e Mertk come indicatori della presenza nel miocardio di monociti/macrofagi e macrofagi fagociti rispettivamente. N - 3 in farsa e N 4 nel gruppo MI. Per l'analisi dell'espressione mRNA, expression era relativa al controllo endogeno Rps18 e i confronti di gruppo erano test T di Student non accoppiati, .p , 0,05, sp , 0,01, s. Nei pannelli B, D, F e G le barre di errore rappresentano le deviazioni standard.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59591/59591fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery

Qui descriviamo una procedura chirurgica che mostra come ottenere una legatura permanente dell'arteria coronaria discendente sinistra-anteriore nei topi. Questo modello è di grande rilevanza per studiare la fisiofisiologia dell'infarto miocardico e i processi biologici concomitanti.

Modello di infarto miocardico Murine utilizzando la legatura permanente dell'arteria coronaria discendente anteriore sinistra

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine ...

Questo modello murino di infrazione miocardica consente il monitoraggio dei processi patologici che si verificano dall'occlusione coronarica all'insufficienza cardiaca in fase avanzata al tessuto cardiaco locale e ai livelli sistemici. Questo metodo è compatibile con qualsiasi lettura attualmente utilizzata in biologia cardiaca e fisiologia. Inoltre, beneficia dell'immensa diversità dei modelli genetici murini.L'acquisizione di adeguate capacità chirurgiche può richiedere tempo per essere padroneggiata. Questa procedura è meglio appresa passo dopo passo con un ricercatore esperto. La dimostrazione visiva di questo modello murino consente la condivisione di suggerimenti che possono aiutare con la procedura chirurgica e accelerare il processo di apprendimento.Usa un rasoio elettrico per radere rapidamente un topo anestetizzato, da 25 a 30 grammi, maschio, C57-Black / 6 sulla gola e sul lato sinistro della gabbia toracica. Confermare la mancanza di risposta al dito del dito. Applicare un unguento agli occhi dell'animale.Posizionare il mouse in posizione supina su una pastiglia riscaldante e posizionare una piccola garza compressa sotto la testa per evitare il surriscaldamento degli occhi. Fissare gli arti con nastro adesivo. Passare un anello di sutura di seta 5-0 sotto gli incisivi superiori e fissare l'estremità dell'anello sul riscaldante per mantenere la bocca aperta durante la cannulazione.Applicare la crema depilatoria sulle aree pre-rasate e massaggiare delicatamente con un batuffolo di cotone per un minuto. Rimuovere la pelliccia e la crema in eccesso con garza e pulire la pelle esposta con gocce di soluzione salina allo 0,9% e garza. Applicare pezzi di garza sterile sulla gola rasata e sul torace e immergere la garza con iodopovidone.Impostare il ventilatore a un volume di marea di sette millilitri per chilogrammo e una velocità di ventilazione di 140 corse al minuto. Spostare il mouse al microscopio stereo della microchirurgia. Tenendo la pelle al centro della gola, fare un'incisione di 0,5 centimetri lungo la linea caudale / cefalica e separare i lobi della ghiandola salivare.Utilizzare forcep curve per separare delicatamente la fascia del muscolo sternoioide fino a quando la laringe e la trachea non sono visibili. Quindi fissare i bordi dell'apertura con retrattiri attaccati a fasce elastiche. Quindi, tirare delicatamente la lingua lateralmente e utilizzare le pina per inserire l'ago interno smussato di una cannula calibro 16 nella trachea.Visualizzare un corretto inserimento nella trachea attraverso l'incisione della gola e collegare la cannula al ventilatore. Posizionare la soluzione salina sterile allo 0,9% integrata con garza imbevuta di iodopovidone sull'incisione per mantenere i tessuti bagnati durante l'operazione. Quindi posizionare i tubi di scarico in acqua.La presenza di bolle indica un'intubazione riuscita. Per la legatura dell'arteria coronarica discendente anteriore sinistra, o LAD, spostare attentamente il mouse nella posizione del decubito laterale destro e riorridire l'arto anteriore sinistro nella nuova posizione. Identificare la linea tra il pettorale sinistro minore e i muscoli maggiori e fare un'incisione obliqua della pelle di un centimetro lungo la linea.Utilizzando micro forbici smussate, separare la fascia dei muscoli pettorali senza incisione dei tessuti e utilizzare retrattili attaccati a fasce elastiche per mantenere la separazione. Impostare il ventilatore con una pressione end-espiratoria positiva di tre centimetri d'acqua. Utilizzare le forcep smussate per aprire la cavità toracica nel terzo spazio intercostale tra la terza e la quarta costola.Posizionare due retrattili nella gabbia toracica, uno su ogni costola, e utilizzare una forcep fine curva per rimuovere con cura il pericardio senza danneggiare il cuore e i polmoni. Individuare il LAD come una linea rossa brillante superficiale che corre dal bordo del padiglione auricolare sinistro verso l'apice. Utilizzare un portaaghi per passare una sutura di seta 7-0 sotto il LAD da due a tre millimetri sotto gli atri sinistro.Tirando lentamente la seta per evitare di strappare il tessuto cardiaco, legare la legatura con tre nodi. La parte in basso a sinistra del ventricolo sinistro impallidisce istantaneamente dopo la legatura. Ora rilascia i retrattili delle costole e tenendo la terza costola con le forcep, fai due passaggi con una sutura di seta 6-0 sotto la terza e la quarta costola.Posizionare tre gocce di soluzione salina 37 gradi Celsius allo 0,9% sull'apertura e chiudere il tubo di scarico di scadenza per due o tre cicli respiratori per gonfiare correttamente i polmoni. Stringere e fissare la sutura con due tiri e rilasciare i retrattori che tengono i muscoli, aiutando i muscoli a tornare alla loro corretta posizione anatomica. Quindi chiudere la pelle toracica con due punti e due tiri di seta sutura 5-0.Chiudi la pelle della gola con un punto di seta sutura 5-0 e due tiri. Alla fine della procedura, rimuovere le fasce di nastro dagli arti, ruotare attentamente l'animale in decubito ventrale sul tampone di compressione e posizionare un impacco sul pad riscaldante sul lato destro dell'animale. Iniettare per via intraperitoneale 0,3 millilitri di soluzione di glucosio riscaldata al 5% da 37 gradi Celsius.Ferma il ventilatore. Se il topo respira spontaneamente, rimuovere cautamente la cannula. Iniettare per via sottocutanea 0,1 milligrammi per chilogrammo di buprenorfina.Posizionare il mouse in una gabbia Celsius di 30 gradi ventilata con ossigeno al 100% per almeno un'ora con monitoraggio. Durante i due primi giorni successivi all'intervento chirurgico, fornire al topo una dieta morbida e acqua ad libitum, riscaldando l'animale se necessario. Sette giorni dopo l'intervento chirurgico, le aree ischemiche rimangono incontaminate dal cloruro di trifeniltetrazolo, mentre il tessuto vivo macchia di rosso a causa della presenza di deidrogenasi.Le aree ischemiche possono quindi essere calcolate come percentuale di area bianca del ventricolo sinistro in un programma software di imaging. L'analisi western della macchia per l'actina muscolare alfa-liscia e la fosforilazione SMAD2, che sono rispettivamente le principali letture dei miofibroblasti e dell'attivazione della segnalazione beta del fattore di crescita, può essere utilizzata per determinare l'estensione della fibrosi all'interno del tessuto miocardico dei cuori infarti. L'analisi della reazione a catena della polimerasi in tempo reale della trasformazione del fattore di crescita beta e la sua espressione di mRNA bersaglio a valle possono anche essere eseguite per valutare la presenza di fibrosi miocardica.Le vie di segnalazione pro-infiammatorie e l'espressione di geni pro-infiammatori si trovano tipicamente attivate entro la prima settimana successiva all'infarto del miocardio. si osserva anche l'espressione di mRNA di geni pro-infiammatori e marcatori monociti/macrofagi. L'altezza di legatura influenzerà criticamente la sopravvivenza e dovrebbe essere adattata a ciascun ceppo o genotipo, poiché la ramificazione del LAD può variare.Le costanti nella legatura sono fondamentali per ottenere risultati riproducibili. Questa procedura può essere accoppiata con qualsiasi metodo analitico e può essere seguita da analisi funzionale, fissazione dei tessuti, coltura cellulare o qualsiasi tecnica di interesse.

Research

JoVE Journal

Medicine

Coronary Artery Ligation and Intramyocardial Injection in a Murine Model of Infarction

Legatura dell&#39;arteria coronarica e di iniezione intramiocardico in un modello murino di infarto

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo.  With the advent of genetic modifications to ...

Ricerca

Medicina

The Application Of Permanent Middle Cerebral Artery Ligation in the Mouse

L&#39;applicazione di permanente legatura dell&#39;arteria cerebrale media nel mouse

Focal cerebral ischemia is among the most common type of stroke seen in patients. Due to the clinical significance there has been a prolonged effort to ...

Modified Technique for Coronary Artery Ligation in Mice

Tecnica modificata di legatura dell&#39;arteria coronarica in Mouse

Myocardial infarction (MI) is one of the most important causes of mortality in humans1-3. In order to improve morbidity and mortality in patients with MI ...

A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery

Un modello murino di ischemia miocardica e riperfusione lesioni da legatura della arteria discendente anteriore sinistra

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms ...

Permanent Ligation of the Left Anterior Descending Coronary Artery in Mice: A Model of Post-myocardial Infarction Remodelling and Heart Failure

Legatura permanente dell&#39;arteria discendente anteriore sinistra coronarica nei topi: un modello di post-infarto rimodellante miocardico e insufficienza cardiaca

Heart failure is a syndrome in which the heart fails to pump blood at a rate commensurate with cellular oxygen requirements at rest or during stress. It ...

Murine Echocardiography of Left Atrium, Aorta, and Pulmonary Artery

Murine ecocardiografia di Sinistra Atrium, Aorta, e l&#39;arteria polmonare

The present methodology teaches the investigator how to measure and use the LAV as a surrogate of chronic elevations in Left Ventricular diastolic ...

Murine Left Anterior Descending (LAD) Coronary Artery Ligation: An Improved and Simplified Model for Myocardial Infarction

Murine Left Anterior Descending LAD Coronary Artery Ligation: An Improved and Simplified Model for Myocardial Infarction

Murino discendente anteriore sinistra (LAD) Coronary legatura dell&#39;arteria: una migliore e semplificata del modello di infarto miocardico

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Direct Re-implantation of Left Coronary Artery into the Aorta in Adults with Anomalous Origin of Left Coronary Artery from the Pulmonary Artery (ALCAPA)

Direct Re-implantation of Left Coronary Artery into the Aorta in Adults with Anomalous Origin of Left Coronary Artery from the Pulmonary Artery ALCAPA

Diretto Re-impianto di sinistra coronarica nell&#39;aorta in Adulti con Anomala origine della coronaria sinistra dall&#39;arteria polmonare (ALCAPA)

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Misurazione di contrattilità isometrica dell'arteria mesenterica Mouse con filo Myography

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