Name: murine myocardial infarction model using permanent ligation of left anterior descending coronary artery
Uploaded: 2019-08-16T13:00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery at JoVE.com

Este modelo foi desenvolvido com o apoio da Swiss National Science Foundation (Grants 310030_162629 to LL) e fundos departamentais dos serviços de cirurgia torácica e medicina intensiva do hospital universitário de Lausanne. JL é beneficiário de uma subvenção da Fundação Emma Muschamp. Reconhecemos o apoio crucial dos veterinários e da equipe de instalação de animais da faculdade de biologia e medicina da Universidade de Lausanne. Agradecemos ao Dr. Giuseppina Milano do serviço de cirurgia cardíaca do hospital universitário de Lausanne e do Dr. Alexandre Sarre da avaliação cardiovascular facilty da Universidade de Lausanne por suas dicas técnicas.

Experimentos com animais descritos neste protocolo foram revisados e aprovados pelo Comitê de ética animal do Cantão de Vaud.
Nota: para estes experimentos, utilizamos camundongos machos C57Bl/6J pesando entre 25 g e 30 g e uma idade de 8-12 semanas. Camundongos foram alimentados com pelotas de ração e água ad libitum e criados condições convencionais. O equipamento cirúrgico foi previamente esterilizado. O experimentador deve usar luvas cirúrgicas estéreis e uma máscara cirúrgica para limitar a contaminação e infecções pós-operatórias.
1. anestesia e canulação traqueal.
<ol><li>Pesar o mouse para determinar a dosagem de drogas anestésicas, medicação analgésica pós-operatória e volume corrente do ventilador. Pré-aqueça a almofada de aquecimento a 37 ° c. A configuração cirúrgica é descrita na Figura 1.</li>
	<li>Injete o rato intraperitonealmente com uma mistura de cetamina e xilazina numa dose de 80 mg/kg e 10 mg/kg, respetivamente.</li>
	<li>Raspar rapidamente o pêlo do rato na garganta e no lado esquerdo da caixa torácica usando uma navalha elétrica.</li>
	<li>Verificar a profundidade da anestesia por beliscar cauda e/ou patas traseiras e liquidar o animal em uma posição supina na almofada de aquecimento. Coloc uma compressa pequena da gaze a cabeça do animal para evitar o superaquecimento dos olhos. Aplique gel ocular para evitar a secura ocular.</li>
	<li>Fixe os quatro membros com fita adesiva na superfície da almofada de aquecimento. Passe um laço de 5-0 sutura de seda os incisivos superiores e furar a extremidade do laço com fita adesiva na almofada de aquecimento. Isto manterá a boca do animal aberta e facilitará o cannulation.</li>
	<li>Aplique o creme da remoção do cabelo nas áreas pre-raspadas e massageie delicadamente com um cotonete do algodão por 1 minuto. Limpe o excesso de pêlo e creme com uma gaze. Use gotas de 0,9% solução salina e gaze para limpar as áreas de incisão. Aplique pedaços de gaze estéril na garganta raspada e tórax e mergulhe-os em iodopovidona. Nota: Recomendamos a aplicação de um medicamento anestésico local (lidocaína ou bupivacaína) a sítios de incisões.</li>
	<li>Definir o ventilador em um volume corrente de 7 mL/kg e taxa de ventilação de 140 cursos/min. Nota: a partir de agora trabalho um estereomicroscópio de microcirurgia.</li>
	<li>Segure a pele no centro da garganta e realize uma incisão de 0,5 cm seguindo uma linha caudal/cefólica usando uma tesoura pequena. Separe os lóbulos da glândula salivar e, em seguida, separe suavemente a fáscia do músculo esternohióide com fórceps de dissecação curvada até que a laringe e a traquéia sejam visíveis. Bordas seguras da abertura com os afastadores Unidos às faixas elásticas. Nota: faça este passo sem incisão dos músculos. Um operador treinado será capaz de intubar o animal através da cavidade oral sem visualização da traqueia tornando esta etapa opcional.</li>
	<li>Segure suavemente a língua lateralmente. Com fórceps, insira a agulha interna Blunted de uma cânula de 16 G na traquéia. Visualize a inserção correta na traquéia através da incisão na garganta.</li>
	<li>Conecte a cânula ao ventilador e assegure a ventilação correta coloc a tubulação de exaustão na água. A presença de bolhas indica intubação correta. Nota: a fim de manter os tecidos molhados durante o local de operação gaze estéril embebido com 0,9% solução salina e iodopovidona na incisão da garganta. Controle a umidade durante o procedimento.</li>
</ol>2. ligadura da artéria coronária de LAD
<ol><li>Solte a pata anterior esquerda da fita adesiva e mova cuidadosamente o mouse para a posição decúbito do lado direito. Fixe o membro anterior esquerdo uma vez que o animal está na posição correta.</li>
	<li>Identifique a linha entre o peitoral esquerdo menor e os músculos principais e faça uma incisão oblíqua da pele em 1 cm com as tesouras que seguem a linha. Com dissecção Blunt micro tesoura, fáscia separado dos músculos peitorais sem incisão. Manter os músculos peitorais separados com retractores ligados a bandas elásticas.</li>
	<li>Ajuste o ventilador com uma pressão expiratória final positiva (PEEP) de 3 cm H2O.</li>
	<li>Abra a cavidade torácica usando fórceps sem corte no espaço intercostal 3RD entre 3RD e 4ª costelas. Evite tocar a artéria torácica interna, pois há perigo de sangramento. Não toque no coração ou no pulmão. Aplique dois retractores na caixa torácica, uma em cada costela (Figura 2a).</li>
	<li>Com uma pinça fina curvada, Retire cuidadosamente o pericárdio e puxe-o para além sem prejudicar o coração e os pulmões.</li>
	<li>Localize a artéria coronária descendente anterior esquerda (LAD). A artéria LAD aparece como uma linha vermelha brilhante superficial que corre da borda da aurícula esquerda em direção ao ápice.</li>
	<li>Use um suporte da agulha para passar uma sutura de seda 7-0 o LAD 2 a 3 milímetros abaixo dos átrios esquerdos. Puxe a seda lentamente para evitar um rasgo de tecido cardíaco. Amarre a ligadura com três nós. A parte inferior esquerda do ventrículo esquerdo ficará imediatamente pálida ao ligar a ligadura (Figura 2b-E). Nota: é importante não ir muito profundamente na cavidade ventricular ou ficar muito superficial. Para animais Sham-operated, puxe a seda da sutura o LAD e remova-a lentamente evitando rasgar do tecido.</li>
	<li>Solte os retractores costela, segure o 3RD costela com fórceps e fazer dois passes com uma sutura de seda 6-0 o 3RD e 4ª costelas. Cuidado: não o coração ou o pulmão perfurados. Não aperte nós ainda.</li>
	<li>Coloque três gotas de 37 ° c 0,9% solução salina para a abertura e feche o tubo de exaustão de expiração para 2 ou 3 ciclos respiratórios para inflar adequadamente os pulmões. Aperte a sutura e fixe com dois lances.</li>
	<li>Libere os afastadores que prendem os músculos e ajude-os a recuperar seu lugar correto.</li>
	<li>Feche a pele torácica com dois pontos de seda de sutura 5-0 e prenda com dois lances. Feche a pele da garganta com um ponto da seda da sutura 5-0 e prenda-a com dois lances.</li>
</ol>3. procedimentos e acompanhamento pós-operatórios.
<ol><li>Remover bandas de fita adesiva de membros. Coloque uma compressa na almofada de aquecimento do lado direito do animal. Nota: o procedimento geral da anestesia para este ponto não deve demorar mais de 40-45 min. opcionalmente injetar IP 0,2 mL de atipamezol em uma concentração de 0,1 mg/mL para acelerar o processo de acordar.</li>
	<li>Injectar intraperitonealmente 0,3 mL de solução de glucose a 5% pré-aquecida a 37 ° c.</li>
	<li>Gire com cuidado o animal no decúbito ventral na almofada da compressa.</li>
	<li>Pare o ventilador; Se o rato respirar espontaneamente, retire cautelosamente a cânula.</li>
	<li>Injetar subcutâneo (SC) 0,1 mg/kg buprenorfina e colocar camundongos em uma gaiola pré-aquecido aquecida a 30 ° c e ventilada com um 100% O2 para um mínimo de 1 h. monitore camundongos para qualquer condição potencialmente fatal, como dispneia excessiva ou hemorragia.</li>
	<li>Durante os dois primeiros dias após a cirurgia, monitore o mouse duas vezes ao dia. Injetar SC 0,1 mg/kg buprenorfina duas vezes por dia. Injectar intraperitonealmente 0,3 mL 0 de solução de glucose a 5% duas vezes por dia. Forneça ratos com dieta macia e água ad libitum. Aqueça o animal, se necessário. Nota: além de opioides, os animais devem ser fornecidos com anti-inflamatórios não esteroidais misturados na dieta ou diluídos em água potável.</li>
	<li>A partir do terceiro dia, injetar SC 0,1 mg/kg buprenorfina duas vezes ao dia se o animal exibe quaisquer sinais incomuns sobre a aparência geral, respiração ou comportamento. Intraperitoneally injetar 0,3 mL de solução de glicose a 5% duas vezes por dia, se o animal ainda está perdendo peso. Aqueça o animal, se necessário. Nota: aplique estritamente os critérios de interrupção predefinidos quando necessário para evitar o sofrimento excessivo. Geralmente os ratos perdem peso até o dia 3 e 4 e depois ganham peso. Após sete dias, os ratos geralmente recuperam o peso da pré-operação.</li>
</ol>

<ol>
	<li>GBD 2016 Causes of Death Collaborators. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=regional,+and+national+age-sex+specific+mortality+for+264+causes+of+death,+1980-2016:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study.">regional, and national age-sex specific mortality for 264 causes of death, 1980-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study.</a> Lancet. 390 (10100), 1151-1210 (2017).</li><li>Reed, G. W., Rossi, J. E., Cannon, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myocardial+infarction.">Acute myocardial infarction.</a> Lancet. 389 (10065), 197-210 (2017).</li><li>Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammatory+response+in+myocardial+injury,+repair,+and+remodelling.">The inflammatory response in myocardial injury, repair, and remodelling.</a> Nature Reviews Cardiology. 11 (5), 255-265 (2014).</li><li>Lugrin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+IL-1alpha+is+a+crucial+danger+signal+triggering+acute+myocardial+inflammation+during+myocardial+infarction.">Cutting edge: IL-1alpha is a crucial danger signal triggering acute myocardial inflammation during myocardial infarction.</a> Journal of Immunology. 194 (2), 499-503 (2015).</li><li>Hashmi, S., Al-Salam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myocardial+infarction+and+myocardial+ischemia-reperfusion+injury:+a+comparison.">Acute myocardial infarction and myocardial ischemia-reperfusion injury: a comparison.</a> International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 8 (8), 8786-8796 (2015).</li><li>van Zuylen, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+infarction+models+in+NOD/Scid+mice+for+cell+therapy+research:+permanent+ischemia+vs+ischemia-reperfusion.">Myocardial infarction models in NOD/Scid mice for cell therapy research: permanent ischemia vs ischemia-reperfusion.</a> Springerplus. 4, 336 (2015).</li><li>Yan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+dynamics+of+cardiac+immune+cell+accumulation+following+acute+myocardial+infarction.">Temporal dynamics of cardiac immune cell accumulation following acute myocardial infarction.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 62, 24-35 (2013).</li><li>Xu, Z., Alloush, J., Beck, E., Weisleder, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+myocardial+ischemia-reperfusion+injury+through+ligation+of+the+left+anterior+descending+artery.">A murine model of myocardial ischemia-reperfusion injury through ligation of the left anterior descending artery.</a> Journal of Visualized Experiments. 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(94), (2014).</li><li>Xu, Z., McElhanon, K. E., Beck, E. X., Weisleder, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Murine+Model+of+Myocardial+Ischemia-Reperfusion+Injury.">A Murine Model of Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury.</a> Methods in Molecular Biology. 1717, 145-153 (2018).</li><li>Parapanov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+5+deficiency+exacerbates+cardiac+injury+and+inflammation+induced+by+myocardial+ischaemia-reperfusion+in+the+mouse.">Toll-like receptor 5 deficiency exacerbates cardiac injury and inflammation induced by myocardial ischaemia-reperfusion in the mouse.</a> Clinical Science. 129 (2), 187-198 (2015).</li><li>Curaj, A., Simsekyilmaz, S., Staudt, M., Liehn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+invasive+surgical+procedure+of+inducing+myocardial+infarction+in+mice.">Minimal invasive surgical procedure of inducing myocardial infarction in mice.</a> Journal of Visualized Experiments. 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Os autores não têm nada a revelar.

A primeira etapa crítica deste procedimento é certamente a intubação. Nós usamos a agulha interna Blunted de um cateter de 16 G como um tubo tracheal. Nós não recomendamos usar esta configuração com camundongos que peso inferior a 22 g. Com esta configuração, pode ser difícil intubar os camundongos corretamente com menor peso corporal sem danificar a traquéia. Um outro ponto crítico é limitar incisões feitas ao músculo ao expor a traquéia e o ribcage. Reduzir os danos teciduais é de grande importância, especialmente ao estudar processos inflamatórios subsequentes ao im. É por isso que preferimos a disseminação suave do músculo e costelas com fórceps e retratores8,9. Nós não usamos o cauterizador elétrico para controlar o sangramento10. Isso pode causar queimaduras iatrogênicas e favorecer infecções. Tanto o trauma quanto as infecções podem viés de leitura inflamatória. Aplicação de uma PEEP extrínica de 3 cm H2o mergulhando a exaustão de ventilação em um tubo de água limita o colapso alveolar final expiratório durante a toracotomia. A localização do LAD é outra etapa crítica e deve-se ter em mente que a anatomia das artérias coronárias pode variar dependendo da cepa e do genótipo do mouse11. Exige alguma experiência para visualizar o LAD, porém coloc a sutura diretamente 2-3 milímetros abaixo dos átrios esquerdos como descrito no procedimento deve permitir o posicionamento correto da ligadura. A descoloração instantânea de grandes porções do ventrículo esquerdo a sutura confirma a exatidão. Finalmente, aplicando artificialmente o auto-PEEP bloqueando a exaustão da ventilação para 2-3 ciclos respiratórios durante o fechamento da caixa permite uma hiperinflação transiente do pulmão que ajudará a perseguir o ar da cavidade torácica12. Nós propositadamente não realizamos um toracocentese como mostrado em 9,10. Desta forma, limitamos o risco de lesões pulmonares e cardíacas e evitamos danos ou perfurações excessivas nos tecidos.
A isquemia-reperfusão miocárdica (I/R) é um modelo cirúrgico relacionado que imita a restauração do fluxo sanguíneo coronariano que é feito em pacientes com im em clínicas. Durante o modelo I/R, uma oclusão transitória da artéria coronária é feita apertando um pedaço de tubo no rapaz por uma duração de 20 a 45 min8,10. Em seguida, a oclusão é liberada para permitir a reperfusão do miocárdio para a duração desejada. Esta simples modificação aplicada ao nosso protocolo pode facilmente transformá-lo em um modelo I/R4,8,14,15. O infarto pode ser confirmado por um exame de sangue para a troponina cardíaca T8,10ou pela ecocardiografia15.
MI difere do modelo I/R porque a reperfusão por si só induz uma lesão. A im induz mais necrose tecidual e a apoptose é mais pronunciada no miocárdio reperfused5. A cinética de infiltração de células inflamatórias também é diferente entre em MI e IR com uma infiltração miocárdica tardia de células imunes no MI7. O tamanho e a posição da área infartada também diferirão entre a ligadura permanente e os modelos I/R15. Tendo isso em mente, é preciso ser cauteloso para escolher um modelo relevante, já que os modelos de I/R e de MI permanentes não são equivalentes. Outro modelo murino de infarto do miocárdio é o modelo de crio-infarto. A aplicação de uma sonda criogênica na parede anterior do ve induz o congelamento do tecido ventricular e a parada do fluxo sanguíneo na artéria LAD. Entretanto, essa técnica difere das técnicas de mi e I/R quanto ao tempo e amplitude de remodelação e respostas inflamatórias16,17.
A variabilidade é uma limitação quanto a qualquer procedimento cirúrgico. Essa variabilidade depende de diferenças biológicas. Um bom exemplo é a variação do arranjo arterial coronariano em camundongos11. Ele também se baseia em habilidades de experimentador. Vale ressaltar que a formação adequada dos experimentadores é obrigatória para alcançar resultados estáveis com esse modelo. Um experimentador bem treinado pode facilmente produzir tamanhos de enfarte que são reprodutíveis (Figura 3a-B). A mortalidade do modelo depende da posição do LAD, da duração dos experimentos (dias, semanas), da cepa do camundongo e dos genótipos. Os tipos de drogas anestésicas e analgésicas também podem afetar o desfecho dos experimentos com efeitos de cardioprotetores ou cardiodepressores putativos. Em nossas mãos, este modelo tem uma taxa de mortalidade global de 25-30%. Essa taxa de mortalidade compreende óbitos espontâneos e sacrifícios antes do término do experimento, independentemente das cepas e da duração do experimento. A maioria das mortes ou sacrifícios estão entre o segundo e o quarto dias após a cirurgia. A aplicação de um rigoroso manejo da dor e acompanhamento dos animais pode reduzir a mortalidade.
Aqui nós apresentamos resultados representativos do tamanho do enfarte analisado usando a coloração de TTC e a expressão da proteína e dos genes envolvidos em processos inflamatórios ou fibrótica no LV pelo borrão ocidental e pelo PCR do tempo real respectivamente (Figura 3C-G). Também é possível medir muitos desses parâmetros por meio de ensaios enzimáticos imunoenzimáticos (ELISA). É claro que, de acordo com a hipótese que precisa ser testada, esse método pode ser seguido por qualquer análise funcional por ultrassom, ressonância magnética ou medida de pressão e volume do cateter intraventricular. Também é possível extrair o coração e investigar ainda mais a biologia celular de células cardíacas isoladas. Globalmente, o modelo de IM com ligadura permanente da artéria coronária LAD é particularmente útil para avaliar processos inflamatórios e fibróticos, cicatrização de feridas e alterações na função cardíaca subsequente ao infarto do miocárdio.

O infarto agudo do miocárdio (IM) é a expressão mais severa das cardiopatias isquêmicas (DIC). A IHD é a principal causa de morbidades e mortes em todo o mundo, especialmente nos países ocidentais1. Consequentemente, tem um enorme impacto econômico nos sistemas de saúde2. A im caracteriza-se pela oclusão de uma artéria coronária por placa aterosclerótica e subsequente apreensão do fluxo sanguíneo em grandes partes do miocárdio. A falta de suprimento de oxigênio no miocárdio leva à morte isquêmica dos cardiomiócitos. Esta condição patológica desencadeia respostas no tecido ventricular que, em última análise, leva a deficiências nas funções ventriculares, remodelação e insuficiência cardíaca3. A im é uma condição fisiopatológica complexa que envolve múltiplos e intrincados processos biológicos compreendendo morte celular regulada, resposta ao estresse oxidativo, inflamação, cicatrização de feridas, fibrose e remodelação ventricular. Algumas dessas respostas biológicas são modeladas como processos individuais in vitro como liberação induzida por necrose de padrões moleculares associados a danos e respostas inflamatórias associadas4. Esses modelos simplificados são essenciais para a compreensão do IM. No entanto, apenas um modelo in vivo pode fornecer uma imagem realista da complexidade dos processos biológicos engajados em resposta ao im.
Mesmo que os modelos de im em animais maiores como suínos possam se relacionar mais estreitamente com a fisiopatologia humana do IM, o poder dos modelos murinos reside nas possibilidades oferecidas pela engenharia genética que é mais avançada do que em qualquer outra espécie de mamífero. Outros aspectos não-negligenciáveis são o baixo custo relativo e a simplicidade da configuração cirúrgica.
Vale ressaltar que os modelos de isquemia-reperfusão do miocárdio podem apresentar diferentes desfechos do que os modelos de im permanentes. Processos biológicos como o tipo de morte celular engajada, qualidade/amplitude ou cinética de respostas inflamatórias e de cicatrização de feridas no tecido miocárdico podem variar de acordo com o modelo5,6,7. No entanto, este protocolo de oclusão coronária permanente pode ser facilmente adaptado para obter um modelo de isquemia-reperfusão.
Este método é relevante para estudos relacionados à fisiopatologia do im sem reperfusão e permite o monitoramento de processos patológicos ocorridos desde a oclusão coronária (minutos) até a insuficiência cardíaca tardia (semanas) no tecido cardíaco local e sistêmica Níveis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:588px;" width="589">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:221px;">1 CC Syringe, Omnifix-F</td>
			<td style="width:73px;">B. Braun</td>
			<td style="width:123px;">9161406V</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:221px;">30G- Needle</td>
			<td style="width:73px;">BD Microlance 3</td>
			<td style="width:123px;">304000</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:221px;">70% Ethanol</td>
			<td style="width:73px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:221px;">Betadine 60 ml</td>
			<td style="width:73px;">MundiPharma</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:221px;">Blunt Retractors</td>
			<td style="width:73px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:123px;">18200-09</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:221px;">Castroviejo Needle Holder Straight with Lock</td>
			<td style="width:73px;">Roboz</td>
			<td style="width:123px;">RS-6416</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:221px;">Cotton Swabs</td>
			<td style="width:73px;">Applimed SA</td>
			<td style="width:123px;">6001109</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:221px;">Dissecting Scissors, Curved</td>
			<td style="width:73px;">Aesculap</td>
			<td style="width:123px;">BC603R</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:221px;">Electrical Razor</td>
			<td style="width:73px;">Remington</td>
			<td style="width:123px;">HC720</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:221px;">Glucose 5% B.Braun</td>
			<td style="width:73px;">B. Braun</td>
			<td style="width:123px;">531032</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:221px;">Hair Removal Cream, Veet</td>
			<td style="width:73px;">Silk &#38; Fresh Tech.</td>
			<td style="width:123px;">8218535</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:221px;">Iris Dissecting Forceps Full Curved</td>
			<td style="width:73px;">Aesculap</td>
			<td style="width:123px;">&#160;OC022R</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:221px;">Ketasol 100 (100 mg/ml)</td>
			<td style="width:73px;">Dr. E. Graeub AG</td>
			<td>QN01AX03</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:221px;">Micro Scissors, Curved Blunt/Blunt</td>
			<td style="width:73px;">Aesculap&#160;</td>
			<td style="width:123px;">FM013R</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:221px;">NaCl 0.9% B. Braun</td>
			<td style="width:73px;">B. Braun</td>
			<td style="width:123px;">534534</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:221px;">Short Fixator</td>
			<td style="width:73px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:123px;">18200-01</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:221px;">Silk Suture 5-0, BB</td>
			<td style="width:73px;">Ethicon</td>
			<td style="width:123px;">K880H</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:221px;">Silk Suture 6-0, P-1</td>
			<td style="width:73px;">Ethicon</td>
			<td style="width:123px;">639H</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:221px;">Silk Suture 7-0,BV-1</td>
			<td style="width:73px;">Ethicon</td>
			<td style="width:123px;">K804</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:221px;">Student Dumont #7 Forceps</td>
			<td style="width:73px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:123px;">91197-00</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:221px;">Student Fine Forceps-Angled</td>
			<td style="width:73px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:123px;">91110-10</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:221px;">Surgical Gloves</td>
			<td style="width:73px;">Weitacare</td>
			<td style="width:123px;">834301</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:221px;">Surgical heating pad</td>
			<td style="width:73px;">Personalized setting</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:221px;">Temgesic&#160; sol 0.3 mg/ml&#160; Buprenorphine</td>
			<td style="width:73px;">Indivior Schweiz AG</td>
			<td style="width:123px;">N02AE01</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:221px;">Tracheal tube inner needle of an 16G i.v. cat</td>
			<td style="width:73px;">Abbocath-T</td>
			<td style="width:123px;">G714-A01</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:221px;">Universal S3 Microscope, OMPIMD</td>
			<td style="width:73px;">Zeizz</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:221px;">Ventilator, MiniVent Model 845</td>
			<td style="width:73px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:123px;">73-0043</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:221px;">Viscotears</td>
			<td style="width:73px;">Alcon</td>
			<td style="width:123px;">1551535</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:221px;">Xylasol (1mg/ml)</td>
			<td style="width:73px;">Dr. E. Graeub AG</td>
			<td>QN05CM92</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

murine myocardial infarction model using permanent ligation of left anterior descending coronary artery

O infarto do miocárdio (IM) e as doenças coronarianas agudas estão entre as causas mais proeminentes de morte na população com estilo de vida ocidental. Os modelos murino do Mi com ligadura permanente da artéria coronária descendente esquerda-anterior (Lad) imita pròxima mi nos seres humanos. Os modelos murine se beneficiam da extensa engenharia genética disponível hoje em dia. Aqui nós propor um modelo cirúrgico murino reprodutível do infarction miocárdico pela ligadura coronária permanente do Lad. Nossa técnica compreende a anestesia com cetamina/xilazina que pode ser rapidamente revertida pela administração de um antagonista, intubação sem traqueotomia para ventilação mecânica assistida, ventilação com aplicação de positivo extrínmico pressão expiratória final (PEEP) para evitar o colapso alveolar, um método de toracotomia que limita as lesões cirúrgicas mínimas feitas aos músculos esqueléticos e a inflação pulmonar sem toracentese. Este método é escassamente invasivo, reprodutível e reduz a mortalidade e complicações pós-operatórias.

Camundongos foram eutanasiados sete dias após a cirurgia. Os animais foram anestesiados com 80 mg/kg de cetamina e 10 mg/kg de xilazina. anestesia, o sangue foi extraído da veia cava e o coração foi amostrado. Os átrios foram removidos, o miocárdio foi lavado em PBS gelo-frio. Para medições de áreas isquêmicas, os corações foram congelados a-20 ° c por 40 min, depois cortados e corados por 20 min a 37 ° c em PBS contendo 2% de cloreto de trifeniltetrazólio (TTC). As fatias cardíacas foram fixadas durante a noite em solução de paraformaldeído tamponado a 4% à temperatura ambiente. As áreas isquêmicas permaneceram não manchadas visto que o tecido vivo foi manchado no vermelho devido à presença de dehydrogenases. As áreas isquêmicas foram calculadas como percentual de área branca do ventrículo esquerdo (ve) com um software de imagem (Figura 3a, B). Para análises bioquímicas e de biologia molecular, os corações foram congelados em nitrogênio líquido. Após a moagem de corações em nitrogênio líquido, o pó de órgão foi utilizado para a extração de proteínas e mRNA. A extensão da fibrose no tecido miocárdico de corações infartados foi avaliada pela análise de Western blot da actina de músculo liso alfa (αSMA) e da fosforilação SMAD2, que são respectivamente grandes leituras de miofibroblastos e de ativação da sinalização TGFβ ( Figura 3C). a expressão de mRNA de TGFb, e alvos a jusante ctgf, postn e Il11 são todos os indicadores da fibrose miocárdica. Isso foi demonstrado pela análise da reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR) (Figura 3D).
As vias de sinalização pró-inflamatória e a expressão de genes pró-inflamatórios foram tipicamente ativadas na primeira semana após o infarto do miocárdio. A fosforilação do fator de transcrição NF-κB p65 é uma marca registrada da inflamação e foi observada em extratos de miocárdio inteiros dos camundongos MI (Figura 3E). a expressão de mRNA dos genes pró-inflamatórios Il1b, Il6 e Cxcl10 (Figura 3F) e dos marcadores monócitos/macrófagos Cd14 e Mertk foram analisadas por PCR em tempo real (Figura 3G). Note-se que houve uma variabilidade na extensão da fosforilação NF-κB p65 e SMAD2 (Figura 3C,e, Lanes 4-7). Esta variabilidade depende em grande parte do tamanho do enfarte.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59591/59591fig1.jpg"> Figura 1 : Descrição da configuração cirúrgica. (A) a instalação cirúrgica compreende uma almofada de aquecimento modificada, um ventilador e uns afastadores Unidos às faixas elásticas. (B) conjunto de tesouras, fórceps e suporte da agulha utilizados durante a cirurgia. (C) close-up dos mini-Retractors. Não mostrado: microscópio estéreo cirúrgico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59591/59591fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59591/59591fig2.jpg"> Figura 2 : Imagens representativas da cirurgia e ligadura de Lad. (A) peito aberto com Retractors. O ventrículo esquerdo era aparente. Os afastadores superiores, esquerdos e inferiores seguraram o retractor caixa torácica e direito segurou o músculo dos peitoral. (B) a agulha foi aprovada o Lad. (C) a seda da sutura foi passada o rapaz, no ventrículo esquerdo. (D) ponto único no rapaz. (E) fim do procedimento de ligadura, a sutura foi fixada com três nós. (F) representação de uma visão anterior do coração. A posição da ligadura do LAD era 2-3 milímetros abaixo dos átrios esquerdos e acima da filial diagonal do LAD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59591/59591fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59591/59591fig3.jpg"> Figura 3 : Fibrose e inflamação em todo o miocárdio extrai sete dias após a cirurgia. (A) imagens representativas da coloração de TTC de um coração infartado cortado sete dias após A cirurgia. As áreas isquêmicas pálidas permaneceram não manchadas e brancas visto que o tecido vivo era vermelho manchado. A ligadura era visível na terceira fatia da esquerda. (B) o tamanho das áreas isquêmicas de cinco corações infartados foi medido utilizando-se a técnica de coloração TTC. Os resultados foram a porcentagem de área branca do ventrículo esquerdo (ve). (C) análise de Western blot de SMAD2 fosforilação e expressão de alfa-sma em miocárdio inteiro como indicadores de fibrose. (D) expressão de mRNA de TGFb, ctgf, postn e Il11 em extratos de miocárdio inteiros. (E) Western blot de NF-κB p65 fosforilação em extratos de miocárdio inteiros. (F) expressão de mRNA de genes pró-inflamatórios Il1b, Il6 e Cxcl10 em extratos de miocárdio inteiros. (G) expressão de mRNA de Cd14 e mertk como indicadores da presença no miocárdio de monócitos/macrófagos e macrófagos fagocíticos, respectivamente. N = 3 em Sham e N = 4 no grupo MI. Para a análise da expressão de mRNA, a expressão foi relativa ao controle endógeno Rps18 e as comparações de grupo foram os testes T de Student não pareados, * p ≤ 0, 5, * * p ≤ 0, 1, * * * p ≤ 0, 1. Nos painéis as barras de erro B, D, F e G representam desvios padrão.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59591/59591fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery

Nisto nós descrevemos um procedimento cirúrgico que mostra como conseguir a ligadura permanente da artéria coronária descendente esquerdo-anterior nos ratos. Este modelo é de grande relevância para investigar a fisiopatologia do infarto do miocárdio e os processos biológicos concomitantes.

Modelo de infarto do miocárdio murino usando ligadura permanente da artéria coronária descendente anterior esquerda

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine ...

Este modelo murino de infração do miocárdio permite o monitoramento de processos patológicos que ocorrem desde a oclusão coronariana até a insuficiência cardíaca em estágio final nos níveis cardíacos e sistêmicos locais. Este método é compatível com qualquer leitura atualmente usada em biologia cardíaca e fisiologia. Além disso, beneficia-se da imensa diversidade de modelos genéticos murinos.A aquisição de habilidades cirúrgicas adequadas pode levar tempo para dominar. Esse procedimento é melhor aprendido passo a passo com um pesquisador experiente. A demonstração visual desse modelo murino permite o compartilhamento de dicas que podem ajudar no procedimento cirúrgico e acelerar o processo de aprendizagem.Use uma navalha elétrica para raspar rapidamente um anesterizado, 25 a 30 gramas, macho, C57-Black/6 na garganta e no lado esquerdo da caixa torácica. Confirme a falta de resposta ao aperto do dedo do dedo do dedo. Aplique pomada aos olhos do animal.Coloque o mouse na posição supina em uma almofada de aquecimento e coloque uma pequena compressa de gaze sob a cabeça para evitar superaquecimento dos olhos. Fixar os membros com fita adesiva. Passe um laço de sutura de seda 5-0 sob os incisivos superiores, e fixe a extremidade do laço na almofada de aquecimento para manter a boca aberta durante a cannulação.Aplique creme depilatório nas áreas pré-raspadas e massageie delicadamente com um cotonete por um minuto. Retire o excesso de pele e creme com gaze, e limpe a pele exposta com gotas de solução salina de 0,9% e gaze. Aplique pedaços de gaze estéril na garganta raspada e no tórax, e mergulhe a gaze com iodopovidona.Coloque o ventilador em um volume de maré de sete mililitros por quilograma e uma taxa de ventilação de 140 traçados por minuto. Mova o rato sob um microscópio estéreo de microcirurgia. Segurando a pele no centro da garganta, faça uma incisão de 0,5 centímetros ao longo da linha caudal/cefálica, e separe os lóbulos da glândula salivar.Use fórceps curvos para separar suavemente a fáscia do músculo esternoide até que a laringe e a traqueia sejam visíveis. Em seguida, fixe as bordas da abertura com retráteis ligados a bandas elásticas. Em seguida, puxe suavemente a língua para os lados, e use fórceps para inserir a agulha interna sem corte de uma cânula de 16 bitola na traqueia.Visualize uma inserção correta na traqueia através da incisão da garganta e conecte a cânula ao ventilador. Coloque a solução salina estéril de 0,9% suplementada com gaze encharcada de iodopovidona na incisão para manter os tecidos molhados durante a operação. Em seguida, coloque o tubo de escape em água.A presença de bolhas indica uma intubação bem sucedida. Para a ligadura da artéria coronária descendente anterior esquerda, ou LAD, mova cuidadosamente o mouse para a posição do decúbito do lado direito, e recure o membro anterior esquerdo na nova posição. Identifique a linha entre os músculos peitoral esquerdo menor e principal, e faça uma incisão oblíqua de um centímetro de pele ao longo da linha.Usando micro tesouras dissecando sem cortes, separe a fáscia dos músculos peitoral sem incisar os tecidos e use retráteis ligados a bandas elásticas para manter a separação. Coloque o ventilador com uma pressão final positiva de três centímetros de água. Use fórceps contundentes para abrir a cavidade torácica no terceiro espaço intercostal entre a terceira e a quarta costelas.Coloque dois retráteis na caixa torácica, um em cada costela, e use um fórceps fino curvo para remover cuidadosamente o pericárdio sem prejudicar o coração e os pulmões. Localize o LAD como uma linha vermelha superficial e brilhante que corre da borda da aurícula esquerda em direção ao ápice. Use um suporte de agulha para passar uma sutura de seda 7-0 sob o LAD dois a três milímetros abaixo da ária esquerda.Puxando a seda lentamente para evitar rasgar tecido cardíaco, amarre a ligadura com três nós. A parte inferior esquerda do ventrículo esquerdo ficará imediatamente pálida após a ligadura. Agora solte os retráteis da costela, e segurando a terceira costela com fórceps, faça dois passes com uma sutura de seda 6-0 sob a terceira e quarta costelas.Coloque três gotas de solução salina de 37 graus Celsius 0,9% na abertura e feche o tubo de escape de expiração por dois ou três ciclos respiratórios para inflar adequadamente os pulmões. Aperte e segure a sutura com dois lances, e solte os retráteis segurando os músculos, ajudando os músculos a retornar ao seu local anatômico correto. Em seguida, feche a pele torácica com dois pontos e dois arremessos de seda de sutura 5-0.Feche a pele da garganta com um ponto de seda de sutura 5-0 e dois arremessos. No final do procedimento, remova as faixas de fita dos membros, gire cuidadosamente o animal para decúbito ventral na almofada de compressa e coloque uma compressa na almofada de aquecimento do lado direito do animal. Injetar intraperitoneally 0,3 mililitros de solução de glicose aquecida de 37 graus Celsius.Pare o ventilador. Se o rato respirar espontaneamente, remova cautelosamente a cânula. Injete subcutâneamente 0,1 miligramas por quilograma de buprenorfina.Coloque o mouse em uma gaiola Celsius de 30 graus ventilada com 100% de oxigênio por pelo menos uma hora com monitoramento. Durante os dois primeiros dias após a cirurgia, forneça ao rato uma dieta macia e ad libitum de água, aquecendo o animal conforme necessário. Sete dias após a cirurgia, as áreas isquêmicas permanecem inaluentas pelo cloreto de tripheniltetrazolium, enquanto o tecido vivo mancha vermelho devido à presença de desidrogenases.As áreas isquêmicas podem então ser calculadas como a porcentagem da área branca do ventrículo esquerdo em um programa de software de imagem. A análise de manchas ocidentais para a actina muscular alfa-lisa e fosforilação SMAD2, que são respectivamente grandes leituras de miofibroblasts e de transformação do fator de crescimento beta sinalização ativação, podem ser usados para determinar a extensão da fibrose dentro do tecido miocárdio dos corações infartados. A análise de reação em cadeia de polimerase em tempo real da transformação do fator de crescimento beta e sua expressão mRNA alvo a jusante também podem ser realizadas para avaliar a presença de fibrose miocárdio.Vias de sinalização pró-inflamatória e a expressão de genes pró-inflamatórios são tipicamente ativadas na primeira semana após o infarto do miocárdio. A expressão mRNA de genes pró-inflamatórios e marcadores monocitos/macrófagos também é observada. A altura de ligadura influenciará criticamente a sobrevivência e deve ser adaptada a cada cepa ou genótipo, pois a ramificação LAD pode variar.As constantes na ligadura são fundamentais para obter resultados reprodutíveis. Este procedimento pode ser acoplado a qualquer método analítico e pode ser seguido por análise funcional, fixação tecidual, cultura celular ou qualquer técnica de interesse.

Research

JoVE Journal

Medicine

Coronary Artery Ligation and Intramyocardial Injection in a Murine Model of Infarction

Ligadura da artéria coronária e injeção intramiocárdica em um modelo murino de infarto

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo.  With the advent of genetic modifications to ...

Medicina

The Application Of Permanent Middle Cerebral Artery Ligation in the Mouse

A aplicação de ligadura da artéria Cerebral Média Permanente no mouse

Focal cerebral ischemia is among the most common type of stroke seen in patients. Due to the clinical significance there has been a prolonged effort to ...

Modified Technique for Coronary Artery Ligation in Mice

Técnica modificada para ligação da artéria coronária em ratos

Myocardial infarction (MI) is one of the most important causes of mortality in humans1-3. In order to improve morbidity and mortality in patients with MI ...

A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery

Um modelo murino de isquemia-reperfusão, através da ligadura da artéria Descendente Anterior Esquerda

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms ...

Permanent Ligation of the Left Anterior Descending Coronary Artery in Mice: A Model of Post-myocardial Infarction Remodelling and Heart Failure

A ligação permanente da artéria coronária descendente anterior esquerda em Ratos: Um Modelo de Remodelação pós-infarto do miocárdio e insuficiência cardíaca

Heart failure is a syndrome in which the heart fails to pump blood at a rate commensurate with cellular oxygen requirements at rest or during stress. It ...

Murine Echocardiography of Left Atrium, Aorta, and Pulmonary Artery

Murino Ecocardiografia de Esquerda Atrium, Aorta, ea artéria pulmonar

The present methodology teaches the investigator how to measure and use the LAV as a surrogate of chronic elevations in Left Ventricular diastolic ...

Murine Left Anterior Descending (LAD) Coronary Artery Ligation: An Improved and Simplified Model for Myocardial Infarction

Murine Left Anterior Descending LAD Coronary Artery Ligation: An Improved and Simplified Model for Myocardial Infarction

Murino Descendente Anterior Esquerda (LAD) ligação da artéria coronária: um modelo melhorado e simplificado para Infarto do Miocárdio

Ischemic heart disease (IHD), or acute coronary syndrome (ACS), is one of the leading causes of death in the United States. IHD is characterized by ...

Direct Re-implantation of Left Coronary Artery into the Aorta in Adults with Anomalous Origin of Left Coronary Artery from the Pulmonary Artery (ALCAPA)

Direct Re-implantation of Left Coronary Artery into the Aorta in Adults with Anomalous Origin of Left Coronary Artery from the Pulmonary Artery ALCAPA

Re-implantação direta de Esquerda da Artéria Coronária para a aorta em adultos com Origem Anômala da Coronária Esquerda da Artéria da artéria pulmonar (ALCAPA)

Anomalous origin of the left coronary artery from the pulmonary artery (ALCAPA) is a rare congenital anomaly which is one of leading causes of myocardial ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Medição de contratilidade isométrica da artéria mesentérica Mouse usando fio miografia

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Intramyocardial Transplantation of MSC-Loading Injectable Hydrogels after Myocardial Infarction in a Murine Model

Transplante intramial de hidrogéis injetáveis de carregamento de MSC após infarto do miocárdio em um modelo murino

One of the major issues facing current cardiac stem cell therapies for preventing postinfarct heart failure is the low retention and survival rates of ...