Name: flow cytometric analysis of mitochondrial reactive oxygen species in murine hematopoietic stem and progenitor cells and mll-af9 driven leukemia
Uploaded: 2019-09-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل من قبل مجلس إدارة مركز فوكس تشيس للسرطان (DDM)، وجائزة الجمعية الأمريكية لأمراض الدم (SMS)، الجمعية الأمريكية للسرطان RSG (SMS) ووزارة الدفاع (Award#: W81XWH-18-1-0472).

وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية الموصوفة في هذا البروتوكول من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) في مركز فوكس تشيس للسرطان.
ملاحظة: وينقسم سير عمل البروتوكول إلى 4 أجزاء كما هو موضح في الشكل 1 ويتم سرد الكواشف المطلو?...

<ol>
	<li>Dr&#246;se, S., Brandt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+superoxide+production+by+the+mitochondrial+respiratory+chain.">Molecular mechanisms of superoxide production by the mitochondrial respiratory chain.</a> Advances in experimental medicine and biology. 748, 145-169 (2012).</li><li>Gerber, P. A., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Oxidative+Stress+and+Hypoxia+in+Pancreatic+Beta-Cell+Dysfunction+in+Diabetes+Mellitus.">The Role of Oxidative Stress and Hypoxia in Pancreatic Beta-Cell Dysfunction in Diabetes Mellitus.</a> Antioxidant &amp; Redox Signaling. 26 (10), 501-518 (2017).</li><li>H&#246;hn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Happily+(n)ever+after:+Aging+in+the+context+of+oxidative+stress,+proteostasis+loss+and+cellular+senescence.">Happily (n)ever after: Aging in the context of oxidative stress, proteostasis loss and cellular senescence.</a> Redox Biology. 11, 482-501 (2017).</li><li>Reuter, S., Gupta, S. C., Chaturvedi, M. M., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress,+inflammation,+and+cancer:+how+are+they+linked.">Oxidative stress, inflammation, and cancer: how are they linked.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 49 (11), 1603-1616 (2010).</li><li>Lee, B. W. L., Ghode, P., Ong, D. S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+regulation+of+cell+state+and+fate.">Redox regulation of cell state and fate.</a> Redox Biology. 2213-2317 (18), 30899 (2018).</li><li>Harris, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+metabolism+impacts+the+spatiotemporal+onset+and+magnitude+of+HSC+induction+in+vivo.">Glucose metabolism impacts the spatiotemporal onset and magnitude of HSC induction in vivo.</a> Blood. 121, 2483-2493 (2013).</li><li>Hole, P. S., Darley, R. L., Tonks, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+reactive+oxygen+species+play+a+role+in+myeloid+leukemias.">Do reactive oxygen species play a role in myeloid leukemias.</a> Blood. 117, 5816-5826 (2011).</li><li>Lagadinou, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BCL-2+inhibition+targets+oxidative+phosphorylation+and+selectively+eradicates+quiescent+human+leukemia+stem+cells.">BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (3), 329-341 (2013).</li><li>Di Marcantonio, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Kinase+C+Epsilon+Is+a+Key+Regulator+of+Mitochondrial+Redox+Homeostasis+in+Acute+Myeloid+Leukemia.">Protein Kinase C Epsilon Is a Key Regulator of Mitochondrial Redox Homeostasis in Acute Myeloid Leukemia.</a> Clinical Cancer Research. 24 (3), 608-618 (2018).</li><li>Glasauer, A., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+antioxidants+for+cancer+therapy.">Targeting antioxidants for cancer therapy.</a> Biochemical Pharmacology. 92 (1), 90-101 (2014).</li><li>Krivtsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+from+committed+progenitor+to+leukaemia+stem+cell+initiated+by+MLL-AF9.">Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9.</a> Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).</li><li>Frascoli, M., Proietti, M., Grassi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+and+isolation+of+murine+hematopoietic+stem+cells+and+lineage-committed+progenitors.">Phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li><li>Lo Celso, C., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transplantation+of+hematopoietic+stem+cells+(HSCs).">Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs).</a> Journal of Visualized Experiments. (157), (2007).</li><li>Kalaitzidis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+complex+1+plays+critical+roles+in+hematopoiesis+and+Pten-loss-evoked+leukemogenesis.">mTOR complex 1 plays critical roles in hematopoiesis and Pten-loss-evoked leukemogenesis.</a> Cell Stem Cell. 11 (3), 429-439 (2012).</li><li>Sykes, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AKT/FOXO+signaling+enforces+reversible+differentiation+blockade+in+myeloid+leukemias.">AKT/FOXO signaling enforces reversible differentiation blockade in myeloid leukemias.</a> Cell. 146 (5), 697-708 (2011).</li><li>Kalaitzidis, D., Neel, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-cytometric+phosphoprotein+analysis+reveals+agonist+and+temporal+differences+in+responses+of+murine+hematopoietic+stem/progenitor+cells.">Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells.</a> PLoS One. 3 (11), 3776 (2008).</li><li>Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Yilmaz, O. H., Terhorst, C., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells.">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).</li><li>Mooney, C. J., Cunningham, A., Tsapogas, P., Toellner, K. M., Brown, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+expression+of+flt3+within+the+mouse+hematopoietic+stem+cell+compartment.">Selective expression of flt3 within the mouse hematopoietic stem cell compartment.</a> International Journal Molecular Sciences. 18 (5), (2017).</li><li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+markers+resolve+functional+distinct+sub-populations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors.">SLAM family markers resolve functional distinct sub-populations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li><li>Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+lymphohematopoietic+reconstitution+by+a+single+CD34-low/negative+hematopoietic+stem+cell.">Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.</a> Science. 273 (5272), 242-245 (1996).</li><li>Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+and+hierarchy+within+the+most+primitive+hematopoietic+stem+cell+compartment.">Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1178 (2010).</li><li>Mukhopadhyay, P., Rajesh, M., Hask&#243;, G., Hawkins, B. J., Madesh, M., Pacher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+apoptosis+and+mitochondrial+superoxide+production+in+live+cells+by+flow+cytometry+and+confocal+microscopy.">Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy.</a> Nature Protocols. 2 (9), 2295-2301 (2007).</li><li>Camargo, F. D., Chambers, S. M., Drew, E., McNagny, K. M., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+do+not+engraft+with+absolute+efficiencies.">Hematopoietic stem cells do not engraft with absolute efficiencies.</a> Blood. 107 (2), 501-507 (2006).</li><li>Morita, Y., Ema, H., Yamazaki, S., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-side-population+hematopoietic+stem+cells+in+mouse+bone+marrow.">Non-side-population hematopoietic stem cells in mouse bone marrow.</a> Blood. 108 (8), 2850-2856 (2006).</li><li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye-Independent+Methods+Reveal+Elevated+Mitochondrial+Mass+in+Hematopoietic+Stem+Cells.">Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li><li>Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-potential+compensation+reveals+mitochondrial+volume+expansion+during+HSC+commitment.">Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment.</a> Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).</li><li>Somervaille, T. C., Cleary, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+leukemia+stem+cells+in+murine+MLL-AF9+acute+myeloid+leukemia.">Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).</li><li>Hao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Imaging+Reveals+a+Unique+Preference+of+Symmetric+Cell+Division+and+Homing+of+Leukemia-Initiating+Cells+in+an+Endosteal+Niche.">Metabolic Imaging Reveals a Unique Preference of Symmetric Cell Division and Homing of Leukemia-Initiating Cells in an Endosteal Niche.</a> Cell Metabolism. 29 (4), 950-965 (2019).</li></ol>

الأصباغ الفلورية التي تم تطويرها للكشف عن ROS يتم تقييمها في كثير من الأحيان في الخلايا الثابتة عن طريق الفحص المجهري أو في الخلايا الحية عن طريق قياس التدفق22. تدفق التقييم الخلوي من ROS الميتوكوندريا في خلايا BM باستخدام الميتوكوندريا ROS الأصباغ الفلورية له ميزتان رئيسيتان: 1) وه...

أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) هي جزيئات تفاعلية عالية مشتقة من الأكسجين الجزيئي. الموقع الخلوي الأكثر تحديدا من إنتاج ROS هو الميتوكوندريا، حيث يتم امتصاص الإلكترونات التي تمر عبر سلسلة نقل الإلكترون (ETC) أثناء الفسفورية التأكسدية (OXPHOS) عن طريق الأكسجين الجزيئي مما يؤدي إلى تشكيل محددة نوع من ROS يسمى الأكاسيد الفائقة1. من خلال إجراءات سلسلة من الإنزيمات، تسمى ديسموتاسيس فوق أكسيد أو SODs، يتم تحويل الأكاسيد الفوقية إلى بيروكسيد الهيدروجين، والتي يتم تحييدها في وقت لاحق في الماء بواسطة إنزيمات مثل الكاتالاز أو الجلوتاثيون بيروكسيداسيس (GPX). يمكن أن تؤدي الاضطرابات في آليات تنظيم ROS إلى الإنتاج الزائد من ROS، والتي غالباً ما يشار إليها باسم الإجهاد التأكسدي، والتي لها عواقب خلوية ضارة وقاتلة مثل تلف جزيء الماكرو (أي الحمض النووي والبروتين والدهون). وعلاوة على ذلك، يرتبط الإجهاد التأكسدي إلى العديد من الأمراض، مثل مرض السكري والأمراض الالتهابية والشيخوخة والأورام2،3،4. للحفاظ على التوازن الأكسدة ومنع الإجهاد التأكسدي، والخلايا تمتلك مجموعة متنوعة من آليات تنظيم ROS5.
المستويات الفسيولوجية لبعض ROS ضرورية للسلّم الأوّل والبالغين 6. ومع ذلك، يرتبط ROS الزائدة مع تلف الحمض النووي، والتمايز الخلوي واستنفاد الجذعية المكونة للدم وتجمع السلف. وهناك أيضا أدلة على أن التعديلات في علم الأحياء الأكسدة قد تختلف بين سرطان الدم والخلايا السليمة. على سبيل المثال، مستويات ROS تميل إلى أن تكون أعلى في خلايا ابيضاض الدم النقوي الحاد (AML) نسبة إلى نظرائهم الأصحاء ودراسات أخرى قد اقترحت أن الخلايا الجذعية سرطان الدم الحفاظ على مستوى ثابت منخفض من ROS للبقاء على قيد الحياة7،8. الأهم من ذلك، وقد أظهرت استراتيجيات للاستفادة العلاجية على هذه الاختلافات الأكسدة الوعد في العديد من إعدادات السرطان البشري9،10. لذلك، فإن الاختبارات التي تسمح بتقييم مستويات ROS في نماذج الماوس قد تحسن فهمنا لكيفية مساهمة هذه الأنواع في علم وظائف الأعضاء الخلوية ومسببات الأمراض، فضلا عن إمكانية توفير منصة لتقييم فعالية العلاجات الجديدة التي تستهدف السرطان.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1109px;" width="1110">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Heat inactivated FBS</td>
			<td style="width:279px;">VWR Seradigm LIFE SCIENCE</td>
			<td style="width:393px;">97068-085</td>
			<td style="width:191px;">Media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-20</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">15 mL conical tube</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">50 mL conical tube</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">40 &#956;m cell strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RBC Lysis Buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-112-9751</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Menadione sodium Bisulfite</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>M5750</td>
			<td>Pro-oxidant</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NAC</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>A7250</td>
			<td>Anti-oxidant</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100310</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">CD4 PE-Cy5 clone RM4-5</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>15-0041-81</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>15-0081-81</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">CD19 PE-Cy5 clone 6D5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115510</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103210</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108410</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116210</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD48 PE-Cy5 clone HM48-1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103420</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD117&#160; APC-Cy7 clone 2B8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105825</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sca1 peacific Blue clone D7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108120</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD150 APC clone TC15-12F12.2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115909</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD34 FITC clone RAM34</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553733</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD45.2 APC clone 104</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>1098313</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MitoSOX Red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M36008</td>
			<td>Dye</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mitotracker Green</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M7514</td>
			<td>Dye</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Live/dead Yellow Dye</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L34967</td>
			<td>Dye</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of mitochondrial reactive oxygen species in murine hematopoietic stem and progenitor cells and mll-af9 driven leukemia

نقدم نهج قياس التدفق لتحليل الميتوكوندريا ROS في مختلف النخاع العظمي الحي (BM) المستمدة من الجذعية وخلايا السلف من الفئران السليمة وكذلك الفئران مع مكافحة غسل الأموال التي يقودها MLL-AF9. على وجه التحديد، ونحن نصف عملية تلطيخ الخلايا من خطوتين، حيث يتم تلوين الخلايا BM صحية أو سرطان الدم أولا مع صبغة فلورية التي تكشف عن الأكاسيد الفائقة الميتوكوندريا، تليها تلطيخ مع الأجسام المضادة أحادية النسيلة المرتبطة بالفلوروكروم التي تستخدم للتمييز بين مختلف السكان السلف المكونة للدم صحية وخبيثة. كما نقدم استراتيجية للحصول على العينات وتحليلها عن طريق قياس التدفق. ويمكن تنفيذ البروتوكول بأكمله في إطار زمني قصير يصل إلى 3-4 ح. كما نسلط الضوء على المتغيرات الرئيسية التي يجب أخذها في الاعتبار وكذلك مزايا وقيود مراقبة إنتاج ROS في المقصورة الميتوكوندريا للخلايا الحية وجذع ابيضاض الدم والخلايا الفرعية السلف باستخدام الأصباغ الفلورية عن طريق قياس التدفق . وعلاوة على ذلك، نقدم بيانات أن وفرة ROS الميتوكوندريا تختلف بين السكان الفرعيين HSPC صحية متميزة وذرية سرطان الدم ومناقشة التطبيقات المحتملة لهذه التقنية في بحوث الدم.

قدم هو وسيلة لتحليل ROS في الميتوكوندريا من العديد من السكان سرطان الدم صحية وMLL-AF9 التعبير عن. يعرض الشكل 1 طريقة عرض تخطيطية لسير عمل البروتوكول، والذي يتكون من 4 خطوات رئيسية: (1) عزل BM عن الفئران؛ (2) عزل BM عن الفئران؛ (3) عزل BM عن الفئران؛ (3) عزل BM عن الفئران؛ (3) عزل BM عن الفئران؛ ...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia at JoVE.com

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

نحن نصف طريقة لاستخدام قياس التدفق متعدد المعلمات للكشف عن أنواع الأكسجين التفاعليالميتوكوندريا (ROS) في الجذعية المكونة للدم الصحية والخلايا السلف الصحية (HSPCs) وخلايا سرطان الدم من نموذج الماوس من ابيضاض الدم النقوي الحاد (AML) مدفوعا MLL-AF9.

تحليل مقياس التدفق لأنواع الأكسجين التفاعلي الميتوكوندريا في الجذعية المكونة للدم وخلايا البروجينوتريو وابيضاض الدم المدفوع MLL-AF9

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

أنواع الأكسجين التفاعلية أو ROS ، هي أنواع الأكسجين التفاعلية للغاية التي تنتجها الخلايا ، وتؤثر على سلوكها. على الرغم من أن روز الزائدة يمكن أن يسبب أيضا الخراب الخلوية على نطاق واسع، وفي الحالات الشديدة، وفاة الخلايا. وبالتالي ، فإن الحفاظ على نظام التوازن ROS له أهمية أساسية لوظيفة الخلوية والبقاء على قيد الحياة.البروتوكول المقدم هنا، يركز على قياس نوع محدد من ROS، التي يتم إنشاؤها بواسطة الميتوكوندريا، أساسا كمنتج عرضي الأيض في الحية، طبيعية، أو صحية الجذعية الدموية والخلايا السلف، وكذلك في خلايا سرطان الدم من نموذج الماوس لسرطان الدم، سرطان الدم النخاعي الحاد أو AML. ويمكن استخدام هذا البروتوكول أيضا لتقييم كيفية تأثير التلاعب الجيني، مثل حذف الجينات أو فرط التعبير، على الميتوكوندريا ROS في العديد من السكان الأصحاء والخبيثين لدم الدم. ونتيجة لذلك، يحتمل أن توفر معلومات الثاقبة حول الدولة redux وربما التمثيل الغذائي للخلايا.هذه التقنية يأذن تدفق تسوية التحليل متري من مسبار protogenic لرصد إنتاج روس الميتوكوندريا في الحية صحية والخبيثة الجذعية الكبدية والنسل دون السكان. هذا البروتوكول هو مباشر ويمكن أن تكتمل في غضون ساعات قليلة. وعلاوة على ذلك، فإنه هو مناسبة لتحليل الخلايا الحية ويسمح لتمييز وتحليل ROS الميتوكوندريا في مجموعات الخلايا الجذعية في نخاع العظام، وذلك باستخدام علامة سطح تلطيخ.بعد جمع خلايا نخاع العظام أحادية النية من الفئران الضيقة البرية وفئران MLL-AF9 للويوكيمي، وفقا للمخطوطة، aliquot 200 ميكرولترات من تعليق الخلية في كل من تسعة أنابيب تحكم لون واحد. Aliquot الخلايا المتبقية في أنابيب تجريبية أخرى، 200 ميكرولترات لكل من. ثم ضع في جهاز طرد مركزي أنبوبين تجريبيين يحتويان على خلايا نخاع العظم وخلايا اللوكيميا على التوالي، وأنبوب تحكم واحد.جهاز طرد مركزي في 300 مرة G لمدة خمس دقائق. المقبل، decant المافق، وإعادة تعليق الخلايا في درجة حرارة الغرفة F-PBS مع بقعة خلية حية / ميتة، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.بعد ذلك، إضافة 1 ملليلتر من درجة حرارة الغرفة F-PBS إلى الأنابيب الثلاثة الملطخة الحية / الميتة، وأنبوب واحد للتحكم في اللون لتلطيخ صبغة الدايكة الوردية الميتوكوندريا. ضع الأنابيب في جهاز الطرد المركزي بمعدل 300 مرة من G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم, الحصول على 5 ملولار الميتوكوندريا روس صبغ الأسهم حل عن طريق إعادة تعليق 50 ميكروغرام من صبغة روس الميتوكوندريا في 13 ميكرولترات من DMSO.ثم إضافة 13 ملليلتر من درجة حرارة الغرفة F-PBS إلى صبغة 13 ميكرولتر روس للميتوكوندريا لتخفيف إلى تركيز نهائي من خمسة ميكرومولار. إذا لزم الأمر، إضافة 13 ميكرولترات من 50 ملليمتر فيراباميل إلى الحل لمنع مضخات الميتوكوندريا efflux. الحصول على أنابيب من جهاز الطرد المركزي وpirate قبالة غسل بقعة الخلية الحية / الميتة.إضافة 200 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني F في السيطرة على تلطيخ حية / ميتة والاحتفاظ بها في الجليد حتى جاهزة لبدء التحليل. إضافة 200 ميكرولترات من وصمة عار صبغة روس الميتوكوندريا التي تحتوي على فيراباميل، إلى كل أنبوب تجريبي، فضلا عن أنبوب التحكم في تلطيخ الميتوكوندريا ROS. دوامة لخلط واحتضان لمدة 10 دقائق في 37 درجة مئوية في الظلام.ثم إضافة 1 ملليلتر من درجة حرارة الغرفة F-PBS إلى التحكم والأنابيب التجريبية. جهاز طرد مركزي خمس دقائق في 300 مرة G في درجة حرارة الغرفة. التعرق قبالة supernatent وغسل الخلايا مع ملليلتر واحد إضافية من درجة حرارة الغرفة F-PBS.أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى لمدة خمس دقائق في 300 مرة G، في درجة حرارة الغرفة. أولاً، أعدّي كوكتيلات الجسم المضاد لخلايا نخاع العظام الصحية وسرطان الدم. اضمّر المُنْطَر من الأنبوب التجريبي الذي يحتوي على خلايا نخاع عظمي صحية، وأضف 200 ميكرولترات من كوكتيل الأجسام المضادة رقم واحد إلى الأنبوب.دوامة لخلط. أيضا إعداد أنابيب التحكم اللون واحد عن طريق إضافة 200 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني F وميكر واحد من الأجسام المضادة المقابلة. احتضان لمدة 60 دقيقة على الجليد في الظلام.اضمّر المُنْطَل من الأنبوب التجريبي الذي يحتوي على نخاع العظام لسرطان الدم، وأضيف 200 ميكرولترات من كوكتيل الأجسام المضادة رقم اثنين، إلى الأنبوب. دوامة لخلط. احتضان لمدة 60 دقيقة على الجليد في الظلام.بعد ذلك، اغسل جميع الأنابيب بـ 1 ملليلتر من F-PBS الباردة والطرد المركزي لمدة خمس دقائق بمعدل 300 مرة في درجة حرارة الغرفة. إعادة تعليق الخلايا في 500 ميكرولترات من F-PBS الباردة. نقل تعليق الخلية إلى كل أنبوب تدفق مقياس الخلايا مع مرشح 40 ميكرومتر لاستبعاد المجاميع.أولا، إدراج واحد أي أنبوب التحكم في وصمة عار في آلة تدفق القياسات اللوترية وبدء عملية الاستحواذ لتعويض تدفق آلة القياسات. كرر لأنابيب التحكم الأخرى. بعد ذلك، اقرأ الأنابيب التجريبية لإعداد البوابات.لتحليل حجم وتعقيد مجموعة الخلايا ، أولاً من أجل HSPC صحية ، تعيين منطقة مبعثر إلى الأمام ومنطقة الجانب مبعثر مساحات السكان. اضغط على زر بوابة مربعة، إلى بوابة خارج الحطام الدخيلة من مؤامرة مبعثر إلى الأمام والجانب. ثم، على منطقة مبعثر إلى الأمام والمؤامرة الارتفاع، واستخدام التمييز المزدوج لبوابة من doublets.حدد الخلايا الحية، والخلايا المنخفضة النسب، ومختلف HSPC صحية. لكل مجموعة من السكان من الفائدة، وتحليل متوسط كثافة الفلورنس من قناة TRPE في مؤامرة الهدوغرافية، لتقييم الاختلافات في إشارة ROS الميتوكوندريا. كرر نفس الإجراء من تحليل الحجم، والبوابات والجرات الرسم البياني التآمر للسكان سرطان الدم.كانت خلايا نخاع العظام المعزولة عن الفئران السليمة ملطخة بصبغة حية / ميتة وصبغة روس الميتوكوندريا ، وتلطخت لاحقًا بأجساد مضادة تعترف بعلامات النسب: بالإضافة إلى CD48 و C-kit و Sca-1 و CD34 و CD150. بالإضافة إلى ذلك، كانت خلايا نخاع العظام من فئران سرطان الدم ملطخة أيضاً بـ CD45.2 للتمييز بين خلايا سرطان الدم MLL-AF9 من خلايا نخاع العظام السليمة الملطخة بـ CD45.1. مقارنة من تلطيخ ROS الميتوكوندريا, بين صحي CD48 LSK السلبية, ونسل النخاع, تبين أن النسل النخاعي عرض مستويات أعلى بكثير من تلطيخ ROS الميتوكوندريا.وعلاوة على ذلك, ج كيت عالية سرطان الدم السلف عرض مستويات أعلى بكثير من تلطيخ ROS الميتوكوندريا, بالمقارنة مع c-كيت المتوسطة خلايا سرطان الدم منخفضة, صحي CD48 LSK السلبية ونسل النخاع. C-كيت المتوسطة خلايا سرطان الدم منخفضة, كما عرض قيمة أعلى بكثير بالمقارنة مع خلايا LSK السلبية CD48, ولكن ليس لنسل النخاع. أصباغ روس الميتوكوندريا هي عالية التفاعل وخطوات الغسيل المناسبة ضرورية لضمان إزالة أي فائض من الصبغة قبل البدء في الخطوات التالية.هناك العديد من الأصباغ الفلوروجينية ROS متميزة كيميائيا التي يمكن استخدامها في هذا البروتوكول، لتحقيق قليلا من المعرفة من حالة redux في الخلايا الدموية الحية. وقد استخدمت هذه التقنية على نطاق واسع في الأدب، ويمكن أن توفر رؤى مفيدة على مسارات التمثيل الغذائي وإشارات التي يتم تنظيمها بشكل تفاضلي في خلايا سرطان الدم، إذا ما قورنت مع نظرائهم العاديين.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

بروتوكول مفصل للتميز الخط خلية الفئران C1498 ونموذج أسوشيتد اللوكيميا ماوس ل

The intravenous injection of C1498 cells into syngeneic or congenic mice has been performed since 1941. These injections result in the development of ...

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

بروتوكول شامل للعينة ونخاع العظام عملية قياس الأمراض المتبقية قابلة للقياس والخلايا الجذعية ليوكيميك في سرطان الدم النقوي الحاد

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

التدفق الخلوي لتقدير لوكيميا الخلايا الجذعية في الابتدائي سرطان الدم النقوي الحاد والمريض-المشتقة-تكثيفها، في التشخيص والمتابعة حتى

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation

غلوبيولين مناعي تحليل تسلسل الجين في اللوكيميا اللمفاوية المزمنة: من المواد المريض إلى تفسير التسلسل

During B cell maturation, the complex process of immunoglobulin (IG) gene V(D)J recombination coupled with somatic hypermutation (SHM) gives rise to a ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

تقييم الأيضية للخلايا اللوكيميا الرئيسية

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

تدفق سيتوميتريك الكشف عن خلايا شبيهة بالخلايا الجذعية سرطان الثدي التي شكلت حديثا بعد عكس المبرمج

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

التحكم المكاني والزماني للبدء من الميلانوما من الخلايا الجذعية المتحولة للخلايا الصباغية

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

تقييم موت الخلية باستخدام الخلايا الخالية من البروبيوتيك في الثقافات الكروية ثلاثية الأبعاد للخلايا السرطانية القولون والمستقيم

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

نهجين تدفق القياسات الخلوية من NKG2D ليغاند الكشف عن السطح لتمييز الخلايا الجذعية من الخلايا الفرعية السائبة في سرطان الدم النخاعي الحاد

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Flow Cytometric Analysis of Apoptotic Biomarkers in Actinomycin D-Treated SiHa Cervical Cancer Cells

تحليل التدفق الخلوي للمؤشرات الحيوية لموت الخلايا المبرمج في خلايا سرطان عنق الرحم SiHa المعالجة بالأكتينومايسين D

Apoptosis biomarkers were investigated in actinomycin D-treated SiHa cervical cancer cells using a benchtop flow cytometer. Early biomarkers (Annexin V ...