Name: flow cytometric analysis of mitochondrial reactive oxygen species in murine hematopoietic stem and progenitor cells and mll-af9 driven leukemia
Uploaded: 2019-09-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Fox Chase Cancer Center bestyrelse (DDM), American Society of Hematology Scholar Award (SMS), American Cancer Society RSG (SMS) og Department of Defense (Award #: W81XWH-18-1-0472).

Alle de dyreforsøg, der er beskrevet i denne protokol, er blevet godkendt af Udvalget for institutionel dyrepasning og-anvendelse (IACUC) hos Fox Chase Cancer Center.
Bemærk: Protokol arbejdsgangen er inddelt i 4 dele som vist i figur 1 , og de påkrævede reagenser er anført i tabellen over materialer.
1. isolering af knoglemarv (BM)
Bemærk: MLL-AF9 leukæ...

<ol>
	<li>Dr&#246;se, S., Brandt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+superoxide+production+by+the+mitochondrial+respiratory+chain.">Molecular mechanisms of superoxide production by the mitochondrial respiratory chain.</a> Advances in experimental medicine and biology. 748, 145-169 (2012).</li><li>Gerber, P. A., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Oxidative+Stress+and+Hypoxia+in+Pancreatic+Beta-Cell+Dysfunction+in+Diabetes+Mellitus.">The Role of Oxidative Stress and Hypoxia in Pancreatic Beta-Cell Dysfunction in Diabetes Mellitus.</a> Antioxidant &amp; Redox Signaling. 26 (10), 501-518 (2017).</li><li>H&#246;hn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Happily+(n)ever+after:+Aging+in+the+context+of+oxidative+stress,+proteostasis+loss+and+cellular+senescence.">Happily (n)ever after: Aging in the context of oxidative stress, proteostasis loss and cellular senescence.</a> Redox Biology. 11, 482-501 (2017).</li><li>Reuter, S., Gupta, S. C., Chaturvedi, M. M., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress,+inflammation,+and+cancer:+how+are+they+linked.">Oxidative stress, inflammation, and cancer: how are they linked.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 49 (11), 1603-1616 (2010).</li><li>Lee, B. W. L., Ghode, P., Ong, D. S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+regulation+of+cell+state+and+fate.">Redox regulation of cell state and fate.</a> Redox Biology. 2213-2317 (18), 30899 (2018).</li><li>Harris, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+metabolism+impacts+the+spatiotemporal+onset+and+magnitude+of+HSC+induction+in+vivo.">Glucose metabolism impacts the spatiotemporal onset and magnitude of HSC induction in vivo.</a> Blood. 121, 2483-2493 (2013).</li><li>Hole, P. S., Darley, R. L., Tonks, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+reactive+oxygen+species+play+a+role+in+myeloid+leukemias.">Do reactive oxygen species play a role in myeloid leukemias.</a> Blood. 117, 5816-5826 (2011).</li><li>Lagadinou, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BCL-2+inhibition+targets+oxidative+phosphorylation+and+selectively+eradicates+quiescent+human+leukemia+stem+cells.">BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (3), 329-341 (2013).</li><li>Di Marcantonio, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Kinase+C+Epsilon+Is+a+Key+Regulator+of+Mitochondrial+Redox+Homeostasis+in+Acute+Myeloid+Leukemia.">Protein Kinase C Epsilon Is a Key Regulator of Mitochondrial Redox Homeostasis in Acute Myeloid Leukemia.</a> Clinical Cancer Research. 24 (3), 608-618 (2018).</li><li>Glasauer, A., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+antioxidants+for+cancer+therapy.">Targeting antioxidants for cancer therapy.</a> Biochemical Pharmacology. 92 (1), 90-101 (2014).</li><li>Krivtsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+from+committed+progenitor+to+leukaemia+stem+cell+initiated+by+MLL-AF9.">Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9.</a> Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).</li><li>Frascoli, M., Proietti, M., Grassi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+and+isolation+of+murine+hematopoietic+stem+cells+and+lineage-committed+progenitors.">Phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li><li>Lo Celso, C., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transplantation+of+hematopoietic+stem+cells+(HSCs).">Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs).</a> Journal of Visualized Experiments. (157), (2007).</li><li>Kalaitzidis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+complex+1+plays+critical+roles+in+hematopoiesis+and+Pten-loss-evoked+leukemogenesis.">mTOR complex 1 plays critical roles in hematopoiesis and Pten-loss-evoked leukemogenesis.</a> Cell Stem Cell. 11 (3), 429-439 (2012).</li><li>Sykes, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AKT/FOXO+signaling+enforces+reversible+differentiation+blockade+in+myeloid+leukemias.">AKT/FOXO signaling enforces reversible differentiation blockade in myeloid leukemias.</a> Cell. 146 (5), 697-708 (2011).</li><li>Kalaitzidis, D., Neel, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-cytometric+phosphoprotein+analysis+reveals+agonist+and+temporal+differences+in+responses+of+murine+hematopoietic+stem/progenitor+cells.">Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells.</a> PLoS One. 3 (11), 3776 (2008).</li><li>Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Yilmaz, O. H., Terhorst, C., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells.">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).</li><li>Mooney, C. J., Cunningham, A., Tsapogas, P., Toellner, K. M., Brown, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+expression+of+flt3+within+the+mouse+hematopoietic+stem+cell+compartment.">Selective expression of flt3 within the mouse hematopoietic stem cell compartment.</a> International Journal Molecular Sciences. 18 (5), (2017).</li><li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+markers+resolve+functional+distinct+sub-populations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors.">SLAM family markers resolve functional distinct sub-populations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li><li>Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+lymphohematopoietic+reconstitution+by+a+single+CD34-low/negative+hematopoietic+stem+cell.">Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.</a> Science. 273 (5272), 242-245 (1996).</li><li>Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+and+hierarchy+within+the+most+primitive+hematopoietic+stem+cell+compartment.">Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1178 (2010).</li><li>Mukhopadhyay, P., Rajesh, M., Hask&#243;, G., Hawkins, B. J., Madesh, M., Pacher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+apoptosis+and+mitochondrial+superoxide+production+in+live+cells+by+flow+cytometry+and+confocal+microscopy.">Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy.</a> Nature Protocols. 2 (9), 2295-2301 (2007).</li><li>Camargo, F. D., Chambers, S. M., Drew, E., McNagny, K. M., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+do+not+engraft+with+absolute+efficiencies.">Hematopoietic stem cells do not engraft with absolute efficiencies.</a> Blood. 107 (2), 501-507 (2006).</li><li>Morita, Y., Ema, H., Yamazaki, S., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-side-population+hematopoietic+stem+cells+in+mouse+bone+marrow.">Non-side-population hematopoietic stem cells in mouse bone marrow.</a> Blood. 108 (8), 2850-2856 (2006).</li><li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye-Independent+Methods+Reveal+Elevated+Mitochondrial+Mass+in+Hematopoietic+Stem+Cells.">Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li><li>Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-potential+compensation+reveals+mitochondrial+volume+expansion+during+HSC+commitment.">Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment.</a> Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).</li><li>Somervaille, T. C., Cleary, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+leukemia+stem+cells+in+murine+MLL-AF9+acute+myeloid+leukemia.">Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).</li><li>Hao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Imaging+Reveals+a+Unique+Preference+of+Symmetric+Cell+Division+and+Homing+of+Leukemia-Initiating+Cells+in+an+Endosteal+Niche.">Metabolic Imaging Reveals a Unique Preference of Symmetric Cell Division and Homing of Leukemia-Initiating Cells in an Endosteal Niche.</a> Cell Metabolism. 29 (4), 950-965 (2019).</li></ol>

Fluorogene farvestoffer, der er udviklet til påvisning af ROS, evalueres ofte i faste celler ved mikroskopi eller i levende celler ved flow cytometri22. Flow cytometrisk evaluering af mitokondrie ROS i BM-celler ved hjælp af mitokondrie ROS fluorogene farvestoffer har to store fordele: 1) det er en hurtig og enkel teknik, der er egnet til levende celle analyse og 2) det giver mulighed for at skelne og analysere sjældne populationer på enkelt celleniveau i BM ved hjælp af overflade markør far...

Reaktive Oxygenarter (ROS) er meget reaktive molekyler afledt af Molekylær ilt. Den mest veldefinerede cellulære placering af ROS produktion er mitokondrierne, hvor elektroner, der passerer gennem elektrontransportkæden (ETC) under oxidativ fosforylering (OXPHOS) absorberes af Molekylær ilt fører til dannelsen af en specifik type af ROS kaldet superoxider1. Gennem handlinger af en række enzymer, kaldet superoxiddismutases eller sod'er, omdannes super oxider til hydrogenperoxider, som efterfølgende neutraliseres i vand af enzymer som katalase eller glutathion peroxidaser (GPX). Forstyrrelser i ROS-reguleringsmekanismer kan føre til den overskydende produktion af ROS, der ofte omtales som oxidativt stress, som har skadelige og potentielt dødbringende cellulære konsekvenser, såsom makromolekyle skade (dvs. DNA, protein, fedtstoffer). Desuden er oxidativ stress relateret til flere patologier, såsom diabetes, inflammatoriske sygdomme, aldring og tumorer2,3,4. For at opretholde redox homøostase og forebygge oxidativ stress, celler besidder en række ROS-regulerende mekanismer5.
Fysiologiske niveauer af visse ROS er nødvendige for ordentlig embryonale og voksne hæmatopoiese6. Men overskydende ROS er forbundet med DNA-skader, cellulær differentiering og udmattelse af den hæmatopoietiske stilk og progenitorceller pool. Der er også tegn på, at ændringer i redox biologi kan variere mellem leukæmi og raske celler. For eksempel, ros niveauer tendens til at være højere i akut myeloid leukæmi (AML) celler i forhold til deres sunde modparter og andre undersøgelser har antydet, at leukæmi stamceller opretholde en lav Steady-State niveau af ros for overlevelse7,8. Vigtigere, strategier for terapeutisk kapitalisering på disse redox forskelle har vist løfte i flere menneskelige kræft indstillinger9,10. Derfor kan analyser, der giver mulighed for at vurdere ROS-niveauer i musemodeller, forbedre vores forståelse af, hvordan disse arter bidrager til cellulær fysiologi og sygdoms patogenese samt potentielt udgøre en platform til vurdering af effektiviteten af nye redox-målrettede anti-cancer terapier.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1109px;" width="1110">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Heat inactivated FBS</td>
			<td style="width:279px;">VWR Seradigm LIFE SCIENCE</td>
			<td style="width:393px;">97068-085</td>
			<td style="width:191px;">Media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-20</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">15 mL conical tube</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">50 mL conical tube</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">40 &#956;m cell strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RBC Lysis Buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-112-9751</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Menadione sodium Bisulfite</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>M5750</td>
			<td>Pro-oxidant</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NAC</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>A7250</td>
			<td>Anti-oxidant</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100310</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">CD4 PE-Cy5 clone RM4-5</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>15-0041-81</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>15-0081-81</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">CD19 PE-Cy5 clone 6D5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115510</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103210</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108410</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116210</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD48 PE-Cy5 clone HM48-1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103420</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD117&#160; APC-Cy7 clone 2B8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105825</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sca1 peacific Blue clone D7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108120</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD150 APC clone TC15-12F12.2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115909</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD34 FITC clone RAM34</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553733</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD45.2 APC clone 104</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>1098313</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MitoSOX Red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M36008</td>
			<td>Dye</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mitotracker Green</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M7514</td>
			<td>Dye</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Live/dead Yellow Dye</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L34967</td>
			<td>Dye</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of mitochondrial reactive oxygen species in murine hematopoietic stem and progenitor cells and mll-af9 driven leukemia

Vi præsenterer en flow cytometrisk tilgang til analyse af mitokondrie ROS i forskellige levende knoglemarv (BM)-afledte stamceller og progenitorcelle populationer fra raske mus samt mus med AML drevet af MLL-AF9. Specifikt beskriver vi en to-trins celle farvningsproces, hvor raske eller leukæmi-BM-celler først farves med et fluorogent farvestof, der detekterer mitokondrie-super oxider, efterfulgt af farvning med fluorochrome-forbundne monoklonale antistoffer, der anvendes at skelne mellem forskellige sunde og maligne hæmatopoietiske stamceller populationer. Vi tilbyder også en strategi for at erhverve og analysere prøverne ved flow cytometri. Hele protokollen kan gennemføres i en tidsramme så kort som 3-4 h. Vi fremhæver også de vigtigste variabler til at overveje, samt de fordele og begrænsninger af overvågning ros produktion i mitokondrie rum af levende hæmatopoietiske og leukæmi stamme og progenitorsubpopulationer ved hjælp af fluorogene farvestoffer ved flow flowcytometri . Desuden præsenterer vi data, som mitokondrie ros overflod varierer blandt forskellige sunde HSPC sub-populationer og leukæmi forfædre og diskutere mulige anvendelser af denne teknik i Hæmatologisk forskning.

Præsenteret er en metode til at analysere ROS i mitokondrier af flere sunde og MLL-AF9-udtrykker leukæmi stamceller populationer. Figur 1 viser en skematisk visning af protokollen workflow, som består af 4 store trin: 1) BM isolation fra mus; 2) farvning BM celler med et fluorogent farvestof, der genkender mitokondrie ROS, især super oxider; 3) overflade markør antistof farvning til afgrænse forskellige raske og leukæmi hæmatopoietiske populationer; og 4) flow cytometri erhvervelse o...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia at JoVE.com

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Vi beskriver en metode til brug af multiparametrflow cytometri til at detektere mitokondrie reaktive oxygenarter (ROS) i murine sund hæmatopoietisk stamcelle-og progenitorceller (Hspc'er) og leukæmiceller fra en musemodel af akut myeloid leukæmi (AML) drevet af MLL-AF9.

Flow Cytometrisk analyse af mitokondrie reaktive oxygen arter i murine hæmatopoietiske stamceller og Progenitorcellerne og MLL-AF9 drevet leukæmi

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Reaktive ilt arter eller ROS, er meget reaktive ilt arter, der er produceret af celler, og påvirker deres adfærd. Selvom overskydende ROS også kan forårsage udbredt cellulære ravage, og i alvorlige tilfælde, celledød. Således er vedligeholdelsen af ROS homøostase af grundlæggende betydning for cellulære funktion og overlevelse.Protokollen præsenteres her, fokuserer på at måle en bestemt type ROS, der er genereret af mitokondrier, primært som en metabolisk biprodukt i levende, normal, eller sund hæmatopoietisk stamceller og stamfader cellepopulationer, samt i leukæmi celler fra musemodellen af blodkræft, Akut Myeloid leukæmi eller AML. Denne protokol kan også bruges til at vurdere, hvordan genetisk manipulation, såsom gensletning eller overekspression, påvirker mitokondriel ROS i flere sunde og ondartede hæmatopoietiske populationer. Og som et resultat, potentielt give indsigtsfulde oplysninger om redux tilstand og muligvis metabolismen af cellerne.Denne teknik tillader flow afregne metrisk analyse af en protogen sonde til at overvåge mitokondrielle ROS produktion i levende sunde og ondartede hæmatopoietiske stilk og stamfader sub-populationer. Denne protokol er ligetil og kan udfyldes i et par timer. Desuden er det velegnet til levende celle analyse og giver mulighed for at skelne og analysere mitokondrielle ROS i stamcellepopulationen i knoglemarven, ved hjælp af overflade mærke farvning.Efter indsamling mononukleare knoglemarvsceller fra vilde stramme mus og leukæmiske MLL-AF9 mus, ifølge manuskriptet, aliquot 200 mikroliter af cellen suspension i hver af ni enkelt farve kontrol rør. Aliquot de resterende celler i andre eksperimentelle rør, 200 mikroliter hver. Derefter anbringes i en centrifuge to eksperimentelle rør, der indeholder knoglemarvsceller og leukæmiske celler henholdsvis, og en kontrol rør.Centrifuge ved 300 gange G i fem minutter. Dernæst dekantere supernatant, og re-suspendere cellerne i stuetemperatur F-PBS med en levende / død celle plet, i henhold til producentens anvisninger. Inkuber på is i 30 minutter.Derefter tilsættes 1 milliliter rumtemperatur F-PBS til de tre levende/ døde farvede rør og et enkelt farvekontrolrør til mitokondriel ROS farvefarvning. Rørene anbringes i centrifugen ved 300 gange G i fem minutter ved stuetemperatur. Derefter opnås en 5 millimolar mitokondrie ROS farvestof lager opløsning ved re-suspension 50 mikrogram mitokondrielle ROS farvestof i 13 mikroliter af DMSO.Derefter tilsættes 13 milliliter rumtemperatur F-PBS til det 13 mikroliter mitokondrielle ROS farvestof for at fortynde til en endelig koncentration af fem mikromolar. Om nødvendigt tilsættes 13 mikroliter på 50 millimolar Verapamil til opløsningen for at hæmme mitokondrielle efflux pumper. Rør fra centrifugen udsugning, og indsugning af vask af den levende/døde celleplet.Der tilsættes 200 mikroliter F-PBS i den levende/døde farvningskontrol, og den opbevares i is, indtil de er klar til at starte analysen. Tilsæt 200 mikroliter af mitokondrielle ROS farvestof plet, der indeholder Verapamil, til hver eksperimentel tube, samt mitokondrielle ROS farvning kontrolrør. Vortex at blande og inkubere i 10 minutter ved 37 grader Celsius i mørke.Derefter tilsættes 1 milliliter rumtemperatur F-PBS til kontrol og eksperimentelle rør. Centrifuge fem minutter ved 300 gange G ved stuetemperatur. Inspirer supernatenten af og vask cellerne med yderligere en milliliter rumtemperatur F-PBS.Centrifuge igen i fem minutter ved 300 gange G, ved stuetemperatur. Først forberede to antistof cocktails til sunde og leukæmi knoglemarvsceller. Inspirer supernatanten fra forsøgsrøret, der indeholder sunde knoglemarvsceller, og tilsæt 200 mikroliter af antistofcocktail nummer et til røret.Vortex at blande. Forbered også enkelt farvekontrolrørene ved at tilsætte 200 mikroliter F-PBS og en mikroliter af det tilsvarende antistof. Inkuber i 60 minutter på is i mørke.Inspirer supernatanten fra det eksperimentelle rør, der indeholder leukæmi knoglemarv, og tilsæt 200 mikroliter af antistofcocktail nummer to, til røret. Vortex at blande. Inkuber i 60 minutter på is i mørke.Derefter vaskes alle rørene med 1 ml kold F-PBS og centrifuge i fem minutter ved 300 gange G ved stuetemperatur. Re-suspendere cellerne i 500 mikroliter af koldt F-PBS. Cellesuspension overføres til hvert flowcytometerrør med et 40 mikrometerfilter, der ikke er aggregater.Først skal du indsætte en ingen pletkontrolrør i flow cytometri maskinen og starte erhvervelsen for at kompensere flow cytometri maskine. Gentag for andre kontrolrør. Derefter skal du læse de eksperimentelle rør for at oprette portene.Hvis du vil analysere størrelsen og kompleksiteten af cellepopulationen, skal du først for at sikre en sund HSPC indstille populationerne for det fremadrettede scatterområde og side scatter-områdeområder. Tryk på Square Gate-knappen for at fjerne uvedkommende snavs fra det fremadrettede og sidespr.-plot. Så på en fremad scatter område og højde plot, skal du bruge en dobbelt diskriminator til gate out doublets.Vælg levende celler, afstamning lave celler, og de forskellige sunde HSPC. For hver population af interesse, analysere median fluorescens intensitet af TRPE kanal i en histagram plot, at vurdere forskelle i mitokondrielle ROS signal. Gentag den samme procedure for størrelse analyse, gating og histogram plotte for leukæmi populationer.Knoglemarvsceller isoleret fra raske mus blev plettet med en levende / død farvestof og et mitokondrielt ROS farvestof, og efterfølgende farves med antistoffer anerkende afstamning markører:plus CD48, C-kit, Sca-1, CD34 og CD150. Desuden blev knoglemarvsceller fra leukæmi mus også farves med CD45.2 at skelne mellem MLL-AF9 leukæmi celler fra raske modtager knoglemarvsceller plettet med CD45.1. En sammenligning af mitokondriel ROS farvning, mellem sunde CD48 negative LSK, og myeloid stamfader, viser, at myeloid stamfader vise betydeligt højere niveauer af mitokondrielle ROS farvning.Desuden c-Kit høj leukæmi stamfader vise betydeligt højere niveauer af mitokondrielle ROS farvning, sammenlignet med c-Kit mellemliggende lav leukæmi celler, sunde CD48 negative LSK og myeloid stamfædre. C-Kit mellemliggende lav leukæmi celler, også vist en betydeligt højere værdi i forhold til CD48 negative LSK celler, men ikke til myeloid stamfader. Mitokondrielle ROS farvestoffer er meget reaktive og passende vask trin er nødvendige for at sikre, at eventuelle overskydende af farvestoffet er blevet fjernet, før du starter følgende trin.Der er flere kemisk adskilte ROS fluorogene farvestoffer, der kan bruges i denne protokol, for at opnå en smule viden om redux status i levende hæmatopoietiske celler. Denne teknik er blevet flittigt brugt i litteraturen, og kan give nyttige indsigter på metaboliske og signalering veje, der er differentieret reguleret i leukæmi celler, hvis man sammenligner med deres normale kolleger.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

En detaljeret protokol til karakterisering af murine C1498 Cell Line og dets associerede Leukæmi Mouse Model

The intravenous injection of C1498 cells into syngeneic or congenic mice has been performed since 1941. These injections result in the development of ...

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Omfattende protokol til prøven og proces knoglemarven til at måle målbare Residual sygdom og Leukemic stamceller i akut Myeloid leukæmi

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Flow flowcytometri for at vurdere leukæmi stamceller i primære akut Myeloid leukæmi og Patient-afledt-xenografts, på diagnose og følg op

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation

Immunglobulin-gen Sekvensanalyse i kronisk lymfatisk leukæmi: Fra Patient materiale til sekvens fortolkning

During B cell maturation, the complex process of immunoglobulin (IG) gene V(D)J recombination coupled with somatic hypermutation (SHM) gives rise to a ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Vurdering af primære leukæmiceller metaboliske profil

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

Flow Cytometric påvisning af nydannede brystkræft stamceller-lignende celler efter apoptose tilbageførsel

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

Rumlig og tidsmæssig kontrol af murine melanom initiering fra mutant melanocyte stamceller

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Evaluering cell død ved hjælp af cellefri supernatant af probiotika i tre-dimensionelle sfæroid kulturer colorectal cancerceller

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

To Flow cytometriske tilgange af NKG2D Ligand Surface Detection at skelne stamceller fra Bulk Subpopulations i akut myeloid leukæmi

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Flow Cytometric Analysis of Apoptotic Biomarkers in Actinomycin D-Treated SiHa Cervical Cancer Cells

Flowcytometrisk analyse af apoptotiske biomarkører i actinomycin D-behandlede SiHa livmoderhalskræftceller

Apoptosis biomarkers were investigated in actinomycin D-treated SiHa cervical cancer cells using a benchtop flow cytometer. Early biomarkers (Annexin V ...