Name: flow cytometric analysis of mitochondrial reactive oxygen species in murine hematopoietic stem and progenitor cells and mll-af9 driven leukemia
Uploaded: 2019-09-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door de Fox Chase Cancer Center Raad van bestuur (DDM), de American Society of Hematology Scholar Award (SMS), American Cancer Society RSG (SMS) en het Department of Defense (Award #: W81XWH-18-1-0472).

Alle in dit protocol beschreven dier procedures zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) bij Fox Chase Cancer Center.
Opmerking: De protocol-workflow is verdeeld in 4 delen zoals weergegeven in Figuur 1 en de vereiste reagentia worden vermeld in de Inhoudsopgave.
1. scheiding van beenmerg (BM)
Opmerking: MLL-AF9 leukemie m...

<ol>
	<li>Dr&#246;se, S., Brandt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+superoxide+production+by+the+mitochondrial+respiratory+chain.">Molecular mechanisms of superoxide production by the mitochondrial respiratory chain.</a> Advances in experimental medicine and biology. 748, 145-169 (2012).</li><li>Gerber, P. A., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Oxidative+Stress+and+Hypoxia+in+Pancreatic+Beta-Cell+Dysfunction+in+Diabetes+Mellitus.">The Role of Oxidative Stress and Hypoxia in Pancreatic Beta-Cell Dysfunction in Diabetes Mellitus.</a> Antioxidant &amp; Redox Signaling. 26 (10), 501-518 (2017).</li><li>H&#246;hn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Happily+(n)ever+after:+Aging+in+the+context+of+oxidative+stress,+proteostasis+loss+and+cellular+senescence.">Happily (n)ever after: Aging in the context of oxidative stress, proteostasis loss and cellular senescence.</a> Redox Biology. 11, 482-501 (2017).</li><li>Reuter, S., Gupta, S. C., Chaturvedi, M. M., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress,+inflammation,+and+cancer:+how+are+they+linked.">Oxidative stress, inflammation, and cancer: how are they linked.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 49 (11), 1603-1616 (2010).</li><li>Lee, B. W. L., Ghode, P., Ong, D. S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+regulation+of+cell+state+and+fate.">Redox regulation of cell state and fate.</a> Redox Biology. 2213-2317 (18), 30899 (2018).</li><li>Harris, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+metabolism+impacts+the+spatiotemporal+onset+and+magnitude+of+HSC+induction+in+vivo.">Glucose metabolism impacts the spatiotemporal onset and magnitude of HSC induction in vivo.</a> Blood. 121, 2483-2493 (2013).</li><li>Hole, P. S., Darley, R. L., Tonks, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+reactive+oxygen+species+play+a+role+in+myeloid+leukemias.">Do reactive oxygen species play a role in myeloid leukemias.</a> Blood. 117, 5816-5826 (2011).</li><li>Lagadinou, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BCL-2+inhibition+targets+oxidative+phosphorylation+and+selectively+eradicates+quiescent+human+leukemia+stem+cells.">BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (3), 329-341 (2013).</li><li>Di Marcantonio, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Kinase+C+Epsilon+Is+a+Key+Regulator+of+Mitochondrial+Redox+Homeostasis+in+Acute+Myeloid+Leukemia.">Protein Kinase C Epsilon Is a Key Regulator of Mitochondrial Redox Homeostasis in Acute Myeloid Leukemia.</a> Clinical Cancer Research. 24 (3), 608-618 (2018).</li><li>Glasauer, A., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+antioxidants+for+cancer+therapy.">Targeting antioxidants for cancer therapy.</a> Biochemical Pharmacology. 92 (1), 90-101 (2014).</li><li>Krivtsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+from+committed+progenitor+to+leukaemia+stem+cell+initiated+by+MLL-AF9.">Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9.</a> Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).</li><li>Frascoli, M., Proietti, M., Grassi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+and+isolation+of+murine+hematopoietic+stem+cells+and+lineage-committed+progenitors.">Phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li><li>Lo Celso, C., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transplantation+of+hematopoietic+stem+cells+(HSCs).">Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs).</a> Journal of Visualized Experiments. (157), (2007).</li><li>Kalaitzidis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+complex+1+plays+critical+roles+in+hematopoiesis+and+Pten-loss-evoked+leukemogenesis.">mTOR complex 1 plays critical roles in hematopoiesis and Pten-loss-evoked leukemogenesis.</a> Cell Stem Cell. 11 (3), 429-439 (2012).</li><li>Sykes, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AKT/FOXO+signaling+enforces+reversible+differentiation+blockade+in+myeloid+leukemias.">AKT/FOXO signaling enforces reversible differentiation blockade in myeloid leukemias.</a> Cell. 146 (5), 697-708 (2011).</li><li>Kalaitzidis, D., Neel, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-cytometric+phosphoprotein+analysis+reveals+agonist+and+temporal+differences+in+responses+of+murine+hematopoietic+stem/progenitor+cells.">Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells.</a> PLoS One. 3 (11), 3776 (2008).</li><li>Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Yilmaz, O. H., Terhorst, C., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells.">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).</li><li>Mooney, C. J., Cunningham, A., Tsapogas, P., Toellner, K. M., Brown, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+expression+of+flt3+within+the+mouse+hematopoietic+stem+cell+compartment.">Selective expression of flt3 within the mouse hematopoietic stem cell compartment.</a> International Journal Molecular Sciences. 18 (5), (2017).</li><li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+markers+resolve+functional+distinct+sub-populations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors.">SLAM family markers resolve functional distinct sub-populations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li><li>Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+lymphohematopoietic+reconstitution+by+a+single+CD34-low/negative+hematopoietic+stem+cell.">Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.</a> Science. 273 (5272), 242-245 (1996).</li><li>Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+and+hierarchy+within+the+most+primitive+hematopoietic+stem+cell+compartment.">Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1178 (2010).</li><li>Mukhopadhyay, P., Rajesh, M., Hask&#243;, G., Hawkins, B. J., Madesh, M., Pacher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+apoptosis+and+mitochondrial+superoxide+production+in+live+cells+by+flow+cytometry+and+confocal+microscopy.">Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy.</a> Nature Protocols. 2 (9), 2295-2301 (2007).</li><li>Camargo, F. D., Chambers, S. M., Drew, E., McNagny, K. M., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+do+not+engraft+with+absolute+efficiencies.">Hematopoietic stem cells do not engraft with absolute efficiencies.</a> Blood. 107 (2), 501-507 (2006).</li><li>Morita, Y., Ema, H., Yamazaki, S., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-side-population+hematopoietic+stem+cells+in+mouse+bone+marrow.">Non-side-population hematopoietic stem cells in mouse bone marrow.</a> Blood. 108 (8), 2850-2856 (2006).</li><li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye-Independent+Methods+Reveal+Elevated+Mitochondrial+Mass+in+Hematopoietic+Stem+Cells.">Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li><li>Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-potential+compensation+reveals+mitochondrial+volume+expansion+during+HSC+commitment.">Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment.</a> Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).</li><li>Somervaille, T. C., Cleary, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+leukemia+stem+cells+in+murine+MLL-AF9+acute+myeloid+leukemia.">Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).</li><li>Hao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Imaging+Reveals+a+Unique+Preference+of+Symmetric+Cell+Division+and+Homing+of+Leukemia-Initiating+Cells+in+an+Endosteal+Niche.">Metabolic Imaging Reveals a Unique Preference of Symmetric Cell Division and Homing of Leukemia-Initiating Cells in an Endosteal Niche.</a> Cell Metabolism. 29 (4), 950-965 (2019).</li></ol>

Fluorogene kleurstoffen die zijn ontwikkeld voor de detectie van Ros worden vaak geëvalueerd in vaste cellen door microscopie of in levende cellen door flow flowcytometrieonderzoeken22. Flow cytometrische evaluatie van mitochondriale ROS in BM-cellen met behulp van mitochondriale ROS fluorogenic kleurstoffen heeft twee belangrijke voordelen: 1) het is een snelle en eenvoudige techniek die geschikt is voor Live-celanalyse en 2) het maakt het mogelijk om te onderscheiden en te analyseren zeldzame p...

Reactieve zuurstof soorten (ROS) zijn zeer reactieve moleculen afgeleid van moleculaire zuurstof. De meest goed gedefinieerde cellulaire locatie van ROS productie is de mitochondriën, waar elektronen die passeren de elektronentransport keten (ETC) tijdens oxidatieve fosforylering (OXPHOS) worden geabsorbeerd door moleculaire zuurstof die leidt tot de vorming van een specifieke type ROS genaamd Super oxiden1. Door de acties van een reeks enzymen, genaamd superoxide dismutases of sod's, worden super oxiden omgezet in waterstof peroxiden, die vervolgens worden geneutraliseerd in water door enzymen zoals katalase of glutathion peroxiasen (GPX). Verstoringen in ROS-regelgevende mechanismen kunnen leiden tot de overtollige productie van ROS, vaak aangeduid als oxidatieve stress, die schadelijke en potentieel dodelijke cellulaire gevolgen zoals Macromolecuul schade hebben (dat wil zeggen, DNA, eiwitten, lipiden). Bovendien is oxidatieve stress gerelateerd aan verschillende pathologieën, zoals diabetes, ontstekingsziekten, veroudering en tumoren2,3,4. Te handhaven redox homeostase en oxidatieve stress te voorkomen, cellen bezitten een verscheidenheid van ROS-regulerende mechanismen5.
Fysiologische niveaus van bepaalde ROS zijn noodzakelijk voor goede embryonale en volwassen Hematopoiesis6. Echter, overtollige ROS wordt geassocieerd met DNA-schade, cellulaire differentiatie en uitputting van het hematopoietische stam en voorlopercellen pool. Er is ook bewijs dat veranderingen in redox biologie kunnen verschillen tussen leukemie en gezonde cellen. Bijvoorbeeld, Ros niveaus neigen te zijn hoger in acute myeloïde leukemie (AML) cellen ten opzichte van hun gezonde tegenhangers en andere studies hebben gesuggereerd dat leukemie stamcellen een lage steady-state niveau van Ros voor overleving7,8behouden. Belangrijk, strategieën voor therapeutisch kapitaliseren op deze redox verschillen hebben aangetoond belofte in verschillende menselijke kanker instellingen9,10. Daarom, assays die het mogelijk maken voor de beoordeling van ROS niveaus in muismodellen kunnen verbeteren ons begrip van hoe deze soorten bijdragen aan cellulaire fysiologie en ziekte pathogenese, alsmede mogelijk bieden een platform voor de beoordeling van de effectiviteit van nieuwe redox-gerichte anti-kankertherapieën.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1109px;" width="1110">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Heat inactivated FBS</td>
			<td style="width:279px;">VWR Seradigm LIFE SCIENCE</td>
			<td style="width:393px;">97068-085</td>
			<td style="width:191px;">Media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-20</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">15 mL conical tube</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">50 mL conical tube</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">40 &#956;m cell strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RBC Lysis Buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-112-9751</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Menadione sodium Bisulfite</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>M5750</td>
			<td>Pro-oxidant</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NAC</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>A7250</td>
			<td>Anti-oxidant</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100310</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">CD4 PE-Cy5 clone RM4-5</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>15-0041-81</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>15-0081-81</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">CD19 PE-Cy5 clone 6D5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115510</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103210</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108410</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116210</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD48 PE-Cy5 clone HM48-1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103420</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD117&#160; APC-Cy7 clone 2B8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105825</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sca1 peacific Blue clone D7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108120</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD150 APC clone TC15-12F12.2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115909</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD34 FITC clone RAM34</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553733</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD45.2 APC clone 104</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>1098313</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MitoSOX Red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M36008</td>
			<td>Dye</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mitotracker Green</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M7514</td>
			<td>Dye</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Live/dead Yellow Dye</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L34967</td>
			<td>Dye</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of mitochondrial reactive oxygen species in murine hematopoietic stem and progenitor cells and mll-af9 driven leukemia

We presenteren een flowcytometrische benadering voor het analyseren van mitochondriale ROS in diverse levende beenmerg (BM)-afgeleide stam-en voorlopercellen van gezonde muizen en muizen met AML aangedreven door MLL-AF9. Specifiek beschrijven we een tweestapskleurings proces, waarbij gezonde of leukemie BM-cellen eerst worden gekleurd met een fluorogene kleurstof die mitochondriale Super oxiden detecteert, gevolgd door kleuring met met fluorochrome verbonden monoklonale antilichamen die worden gebruikt verschillende gezonde en kwaadaardige hematopoietische voorlopercellen te onderscheiden. We bieden ook een strategie voor het verwerven en analyseren van de monsters door flow Cytometry. Het gehele protocol kan worden uitgevoerd in een tijdsbestek van slechts 3-4 h. We markeren ook de belangrijkste variabelen om te overwegen, evenals de voordelen en beperkingen van het bewaken van ROS productie in het mitochondriale compartiment van levende hematopoietische en leukemie stam en voorlopercellen subpopulaties met behulp van fluorogenic kleurstoffen doorstroming cytometrie . Bovendien presenteren we gegevens die mitochondriale ROS overvloed varieert tussen verschillende gezonde HSPC subpopulaties en leukemie voor ouders en bespreken de mogelijke toepassingen van deze techniek in hematologisch onderzoek.

Gepresenteerd is een methode voor het analyseren van ROS in de mitochondriën van meerdere gezonde en MLL-AF9-uitdrukken leukemie populaties. Figuur 1 geeft een schematische weergave van de protocol workflow, die bestaat uit 4 belangrijke stappen: 1) BM-isolatie van muizen; 2) kleuring BM-cellen met een fluorogenic kleurstof die mitochondriale ROS herkent, met name Super oxiden; 3) oppervlak marker antilichaam kleuring te afbakenen verschillende gezonde en leukemie hematopoietische populatie...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia at JoVE.com

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

We beschrijven een methode voor het gebruik van Multi parameter flow cytometrie te detecteren mitochondriale reactieve zuurstof soorten (ROS) in Murine gezonde hematopoietische stam en voorlopercellen (HSPCs) en leukemie cellen van een muismodel van acute myeloïde leukemie (AML) gedreven door MLL-AF9.

Flow cytometrische analyse van mitochondriale reactieve zuurstof soorten in Muriene hematopoietische stam en voorlopercellen en MLL-AF9 gedreven leukemie

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Reactieve zuurstofsoorten of ROS, zijn zeer reactieve zuurstofsoorten die worden geproduceerd door cellen, en beïnvloedt hun gedrag. Hoewel overtollige ROS kan ook leiden tot wijdverbreide cellulaire ravage, en in ernstige gevallen, celdood. Zo is het behoud van ROS homeostase van fundamenteel belang voor cellulaire functie en overleving.Het protocol dat hier wordt gepresenteerd, richt zich op het meten van een specifiek type ROS, dat wordt gegenereerd door mitochondriën, voornamelijk als een metabolisch bijproduct in levende, normale of gezonde hematopoietische stam- en voorlopercelpopulaties, evenals in leukemiecellen uit het muismodel van bloedkanker, Acute Myeloïde Leukemie of AML. Dit protocol kan ook worden gebruikt om te evalueren hoe genetische manipulatie, zoals gendesletie of overexpressie, invloeden mitochondriale ROS in verschillende gezonde en kwaadaardige hematopoietische populaties. En als gevolg daarvan, potentieel inzichtelijke informatie over redux staat en eventueel het metabolisme van de cellen.Deze techniek machtigt flow regelen metrische analyse van een protogene sonde te controleren mitochondriale ROS productie in levende gezonde en kwaadaardige hematopoietische stengel en voorvader subpopulaties. Dit protocol is eenvoudig en kan in een paar uur worden voltooid. Bovendien is het geschikt voor live celanalyse en maakt het mogelijk om mitochondriale ROS in stamcelpopulatie in het beenmerg te onderscheiden en te analyseren, met behulp van oppervlaktemarkering van kleuring.Na het verzamelen van mononucleaire beenmergcellen van wilde strakke muizen en leukemische MLL-AF9 muizen, volgens het manuscript, aliquot 200 microliters van de cel suspensie in elk van de negen enkele kleuren controle buizen. Aliquot de resterende cellen in andere experimentele buizen, 200 microliters elk. Plaats vervolgens in een centrifuge twee experimentele buizen met beenmergcellen en leukemische cellen, en een controlebuis.Centrifuge op 300 keer G gedurende vijf minuten. Vervolgens decanteren de supernatant, en opnieuw op te schorten de cellen in kamertemperatuur F-PBS met een levende / dode cel vlek, volgens de instructies van de fabrikant. Incubeer op ijs gedurende 30 minuten.Voeg daarna 1 milliliter kamertemperatuur F-PBS toe aan de drie levende/dode gekleurde buizen en één enkele kleurcontrolebuis voor mitochondriale ROS-kleurstof. Plaats de buizen in de centrifuge op 300 keer G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Dan, verkrijg een 5 millimolar mitochondriale ROS kleurstof voorraad oplossing door opnieuw schorsing van 50 microgram mitochondriale ROS kleurstof in 13 microliters van DMSO.Voeg vervolgens 13 milliliter kamertemperatuur F-PBS toe aan de 13 microliter mitochondriale ROS-kleurstof om te verdunnen tot een uiteindelijke concentratie van vijf micromolar. Voeg indien nodig 13 microliter van 50 millimolar Verapamil toe aan de oplossing om mitochondriale effluxpompen te remmen. Haal de buizen uit de centrifuge en aspirate uit de was van de levende / dode cel vlek.Voeg 200 microliters F-PBS toe in de live/dode kleuringscontrole en houd het in ijs tot het klaar is om de analyse te starten. Voeg 200 microliters van de mitochondriale ROS kleurstofvlek met Verapamil toe aan elke experimentele buis, evenals de mitochondriale ROS-kleuringsbuis. Vortex te mengen en uitbroeden gedurende 10 minuten op 37 graden Celsius in het donker.Voeg vervolgens 1 milliliter kamertemperatuur F-PBS toe aan de besturing en experimentele buizen. Vijf minuten centrifugeren bij 300 keer G bij kamertemperatuur. Aspirate uit de supernatent en was de cellen met een extra een milliliter kamertemperatuur F-PBS.Centrifuge opnieuw gedurende vijf minuten op 300 keer G, bij kamertemperatuur. Bereid eerst twee antilichaamcocktails voor gezonde en leukemie beenmergcellen. Aspirate de supernatant uit de experimentele buis met gezonde beenmergcellen, en voeg 200 microliter van de antilichaam cocktail nummer een aan de buis.Vortex om te mengen. Bereid ook de single color control tubes voor door 200 microliters van F-PBS en één microliter van het bijbehorende antilichaam toe te voegen. 60 minuten incuberen op ijs in het donker.Aspirate de supernatant uit de experimentele buis met leukemie beenmerg, en voeg 200 microliters van de antilichaam cocktail nummer twee, aan de buis. Vortex om te mengen. 60 minuten incuberen op ijs in het donker.Daarna was je alle buizen met 1 milliliter koude F-PBS en centrifuge vijf minuten bij 300 keer G bij kamertemperatuur. Schort de cellen opnieuw op in 500 microliter koude F-PBS. Breng de celsuspensie over in elke stroomcytometerbuis met een filter van 40 micrometer voor het uitsluiten van aggregaten.Plaats eerst een geen vlek controle buis in de stroom cytometrie machine en start de overname om de stroom cytometrie machine te compenseren. Herhaal dit voor andere controlebuizen. Lees daarna de experimentele buizen om de poorten op te zetten.Als u de grootte en complexiteit van de celpopulatie wilt analyseren, stelt u eerst voor een gezonde HSPC het voorwaartse spreidingsgebied in en stelt u populaties van het gebied voor spreidingsgebied in. Druk op de Square Gate-knop, om vreemde brokstukken van het voorste en zijverstrooiende perceel te verwijderen. Dan, op een voorwaartse strooigebied en hoogteperceel, gebruik een dubbele discriminator om doubletten uit te gate.Selecteer levende cellen, afstamming lage cellen, en de verschillende gezonde HSPC. Voor elke populatie van belang, analyseren van de mediane fluorescentie intensiteit van het TRPE-kanaal in een histagram plot, om verschillen in de mitochondriale ROS signaal te evalueren. Herhaal dezelfde procedure van grootteanalyse, gating en histogram plotten voor leukemiepopulaties.Beenmergcellen geïsoleerd van gezonde muizen werden gekleurd met een levende / dode kleurstof en een mitochondriale ROS kleurstof, en vervolgens gekleurd met antilichamen herkennen afstamming markers: plus CD48, C-kit, Sca-1, CD34 en CD150. Bovendien werden beenmergcellen van leukemiemuizen ook bevlekt met CD45.2 om onderscheid te maken tussen MLL-AF9 leukemiecellen van gezonde beenmergcellen met cd45.1. Een vergelijking van mitochondriale ROS kleuring, tussen gezonde CD48 negatieve LSK, en myeloïde voorlopers, toont aan dat myeloïde voorlopers aanzienlijk hogere niveaus van mitochondriale ROS kleuring vertonen.Bovendien, c-Kit hoge leukemie voorlopers vertonen aanzienlijk hogere niveaus van mitochondriale ROS kleuring, in vergelijking met c-Kit intermediaire lage leukemie cellen, gezonde CD48 negatieve LSK en myeloïde voorlopers. C-Kit intermediaire lage leukemiecellen, ook weergegeven een aanzienlijk hogere waarde in vergelijking met CD48 negatieve LSK cellen, maar niet aan myeloïde voorlopers. Mitochondriale ROS-kleurstoffen zijn zeer reactief en passende wasstappen zijn nodig om ervoor te zorgen dat een overmaat aan de kleurstof is verwijderd voordat u met de volgende stappen begint.Er zijn verschillende chemisch verschillende ROS fluorogene kleurstoffen die kunnen worden gebruikt in dit protocol, om een beetje kennis van de redux status in levende hematopoietische cellen te bereiken. Deze techniek is op grote schaal gebruikt in de literatuur, en kan nuttige inzichten geven over de metabole en signalering trajecten die differentieel zijn geregeld in leukemie cellen, in vergelijking met hun normale tegenhangers.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

Een gedetailleerd protocol voor het karakteriseren van het Muizen C1498 Cell Line en de bijbehorende Leukemie muismodel

The intravenous injection of C1498 cells into syngeneic or congenic mice has been performed since 1941. These injections result in the development of ...

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Uitgebreide Protocol bij monster en proces beenmerg voor het meten van meetbare residuele ziekte en leukemische cellen van de stam in Acute myeloïde leukemie

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Stroom Cytometry om te schatten leukemie cellen van de stam in primaire Acute myeloïde leukemie en patiënt-afgeleid-xenografts, bij diagnose en Follow Up

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation

Immunoglobuline Gene sequentieanalyse In chronische lymfatische leukemie: Van patiënt materiaal reeks interpretatie

During B cell maturation, the complex process of immunoglobulin (IG) gene V(D)J recombination coupled with somatic hypermutation (SHM) gives rise to a ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Beoordeling van de metabole Profiel van primaire leukemie cellen

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

Stroom cytometrische detectie van nieuwgevormde stamcel-achtige borstkankercellen na Apoptosis omkering

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

Ruimtelijke en temporele controle van muizen melanoom initiatie van mutant melanocyt stamcellen

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Celdood evalueren met celvrije supernatant van probiotica in driedimensionale sferoïde culturen van colorectale kankercellen

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

Twee flow cytometrische benaderingen van NKG2D Ligand-oppervlaktedetectie om stamcellen te onderscheiden van bulksubpopulaties bij acute myeloïde leukemie

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Flow Cytometric Analysis of Apoptotic Biomarkers in Actinomycin D-Treated SiHa Cervical Cancer Cells

Flowcytometrische analyse van apoptotische biomarkers in actinomycine D-behandelde SiHa baarmoederhalskankercellen

Apoptosis biomarkers were investigated in actinomycin D-treated SiHa cervical cancer cells using a benchtop flow cytometer. Early biomarkers (Annexin V ...