Name: flow cytometric analysis of mitochondrial reactive oxygen species in murine hematopoietic stem and progenitor cells and mll-af9 driven leukemia
Uploaded: 2019-09-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia at JoVE.com

Diese Arbeit wurde vom Fox Chase Cancer Center Board of Directors (DDM), dem American Society of Hematology Scholar Award (SMS), der American Cancer Society RSG (SMS) und dem Department of Defense (Auszeichnung: W81XWH-18-1-0472) unterstützt.

Alle in diesem Protokoll beschriebenen tierexperimentellen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am Fox Chase Cancer Center genehmigt.
HINWEIS: Der Protokollworkflow ist in 4 Teile unterteilt, wie in Abbildung 1 dargestellt, und die erforderlichen Reagenzien sind in der Tabelle der Materialienaufgeführt.
1. Knochenmark (BM) Isolierung
<strong...

<ol>
	<li>Dr&#246;se, S., Brandt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+superoxide+production+by+the+mitochondrial+respiratory+chain.">Molecular mechanisms of superoxide production by the mitochondrial respiratory chain.</a> Advances in experimental medicine and biology. 748, 145-169 (2012).</li><li>Gerber, P. A., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Oxidative+Stress+and+Hypoxia+in+Pancreatic+Beta-Cell+Dysfunction+in+Diabetes+Mellitus.">The Role of Oxidative Stress and Hypoxia in Pancreatic Beta-Cell Dysfunction in Diabetes Mellitus.</a> Antioxidant &amp; Redox Signaling. 26 (10), 501-518 (2017).</li><li>H&#246;hn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Happily+(n)ever+after:+Aging+in+the+context+of+oxidative+stress,+proteostasis+loss+and+cellular+senescence.">Happily (n)ever after: Aging in the context of oxidative stress, proteostasis loss and cellular senescence.</a> Redox Biology. 11, 482-501 (2017).</li><li>Reuter, S., Gupta, S. C., Chaturvedi, M. M., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress,+inflammation,+and+cancer:+how+are+they+linked.">Oxidative stress, inflammation, and cancer: how are they linked.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 49 (11), 1603-1616 (2010).</li><li>Lee, B. W. L., Ghode, P., Ong, D. S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+regulation+of+cell+state+and+fate.">Redox regulation of cell state and fate.</a> Redox Biology. 2213-2317 (18), 30899 (2018).</li><li>Harris, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+metabolism+impacts+the+spatiotemporal+onset+and+magnitude+of+HSC+induction+in+vivo.">Glucose metabolism impacts the spatiotemporal onset and magnitude of HSC induction in vivo.</a> Blood. 121, 2483-2493 (2013).</li><li>Hole, P. S., Darley, R. L., Tonks, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+reactive+oxygen+species+play+a+role+in+myeloid+leukemias.">Do reactive oxygen species play a role in myeloid leukemias.</a> Blood. 117, 5816-5826 (2011).</li><li>Lagadinou, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BCL-2+inhibition+targets+oxidative+phosphorylation+and+selectively+eradicates+quiescent+human+leukemia+stem+cells.">BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (3), 329-341 (2013).</li><li>Di Marcantonio, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Kinase+C+Epsilon+Is+a+Key+Regulator+of+Mitochondrial+Redox+Homeostasis+in+Acute+Myeloid+Leukemia.">Protein Kinase C Epsilon Is a Key Regulator of Mitochondrial Redox Homeostasis in Acute Myeloid Leukemia.</a> Clinical Cancer Research. 24 (3), 608-618 (2018).</li><li>Glasauer, A., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+antioxidants+for+cancer+therapy.">Targeting antioxidants for cancer therapy.</a> Biochemical Pharmacology. 92 (1), 90-101 (2014).</li><li>Krivtsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+from+committed+progenitor+to+leukaemia+stem+cell+initiated+by+MLL-AF9.">Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9.</a> Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).</li><li>Frascoli, M., Proietti, M., Grassi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+and+isolation+of+murine+hematopoietic+stem+cells+and+lineage-committed+progenitors.">Phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li><li>Lo Celso, C., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transplantation+of+hematopoietic+stem+cells+(HSCs).">Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs).</a> Journal of Visualized Experiments. (157), (2007).</li><li>Kalaitzidis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+complex+1+plays+critical+roles+in+hematopoiesis+and+Pten-loss-evoked+leukemogenesis.">mTOR complex 1 plays critical roles in hematopoiesis and Pten-loss-evoked leukemogenesis.</a> Cell Stem Cell. 11 (3), 429-439 (2012).</li><li>Sykes, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AKT/FOXO+signaling+enforces+reversible+differentiation+blockade+in+myeloid+leukemias.">AKT/FOXO signaling enforces reversible differentiation blockade in myeloid leukemias.</a> Cell. 146 (5), 697-708 (2011).</li><li>Kalaitzidis, D., Neel, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-cytometric+phosphoprotein+analysis+reveals+agonist+and+temporal+differences+in+responses+of+murine+hematopoietic+stem/progenitor+cells.">Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells.</a> PLoS One. 3 (11), 3776 (2008).</li><li>Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Yilmaz, O. H., Terhorst, C., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells.">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).</li><li>Mooney, C. J., Cunningham, A., Tsapogas, P., Toellner, K. M., Brown, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+expression+of+flt3+within+the+mouse+hematopoietic+stem+cell+compartment.">Selective expression of flt3 within the mouse hematopoietic stem cell compartment.</a> International Journal Molecular Sciences. 18 (5), (2017).</li><li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+markers+resolve+functional+distinct+sub-populations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors.">SLAM family markers resolve functional distinct sub-populations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li><li>Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+lymphohematopoietic+reconstitution+by+a+single+CD34-low/negative+hematopoietic+stem+cell.">Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.</a> Science. 273 (5272), 242-245 (1996).</li><li>Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+and+hierarchy+within+the+most+primitive+hematopoietic+stem+cell+compartment.">Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1178 (2010).</li><li>Mukhopadhyay, P., Rajesh, M., Hask&#243;, G., Hawkins, B. J., Madesh, M., Pacher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+apoptosis+and+mitochondrial+superoxide+production+in+live+cells+by+flow+cytometry+and+confocal+microscopy.">Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy.</a> Nature Protocols. 2 (9), 2295-2301 (2007).</li><li>Camargo, F. D., Chambers, S. M., Drew, E., McNagny, K. M., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+do+not+engraft+with+absolute+efficiencies.">Hematopoietic stem cells do not engraft with absolute efficiencies.</a> Blood. 107 (2), 501-507 (2006).</li><li>Morita, Y., Ema, H., Yamazaki, S., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-side-population+hematopoietic+stem+cells+in+mouse+bone+marrow.">Non-side-population hematopoietic stem cells in mouse bone marrow.</a> Blood. 108 (8), 2850-2856 (2006).</li><li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye-Independent+Methods+Reveal+Elevated+Mitochondrial+Mass+in+Hematopoietic+Stem+Cells.">Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li><li>Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-potential+compensation+reveals+mitochondrial+volume+expansion+during+HSC+commitment.">Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment.</a> Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).</li><li>Somervaille, T. C., Cleary, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+leukemia+stem+cells+in+murine+MLL-AF9+acute+myeloid+leukemia.">Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).</li><li>Hao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Imaging+Reveals+a+Unique+Preference+of+Symmetric+Cell+Division+and+Homing+of+Leukemia-Initiating+Cells+in+an+Endosteal+Niche.">Metabolic Imaging Reveals a Unique Preference of Symmetric Cell Division and Homing of Leukemia-Initiating Cells in an Endosteal Niche.</a> Cell Metabolism. 29 (4), 950-965 (2019).</li></ol>

Fluorogene Farbstoffe, die für den Nachweis von ROS entwickelt wurden, werden häufig in festen Zellen durch Mikroskopie oder in lebenden Zellen durch Durchflusszytometrie22ausgewertet. Die zytometrische Fließbewertung von mitochondrialem ROS in BM-Zellen mit mitochondrialen ROS-Fluorenfarbstoffen hat zwei wesentliche Vorteile: 1) Es ist eine schnelle und einfache Technik, die für die Analyse von lebenden Zellen geeignet ist und 2) es ermöglicht, seltene Populationen auf einzelzeller Ebene im ...

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sind hochreaktive Moleküle, die aus molekularem Sauerstoff gewonnen werden. Der am besten definierte zelluläre Standort der ROS-Produktion ist die Mitochondrien, wo Elektronen, die während der oxidativen Phosphorylierung (OXPHOS) durch die Elektronentransportkette (ETC) gehen, von molekularem Sauerstoff absorbiert werden, was zur Bildung einer spezifischen Art von ROS genannt Superoxide1. Durch die Aktionen einer Reihe von Enzymen, sogenannten Superoxid-Dismutasen oder SODs, werden Superoxide in Wasserstoffperoxide umgewandelt, die anschließend durch Enzyme wie Kataalase oder Glutathionperoxidasen (GPX) in Wasser neutralisiert werden. Störungen in ROS-Regulierungsmechanismen können zu einer übermäßigen Produktion von ROS führen, der oft als oxidativer Stress bezeichnet wird und schädliche und potenziell tödliche zelluläre Folgen wie Makromolekülschäden (z. B. DNA, Protein, Lipide) hat. Darüber hinaus ist oxidativer Stress mit mehreren Pathologien verbunden, wie Diabetes, entzündliche Erkrankungen, Alterung und Tumoren2,3,4. Um Die Homöostase von Redox aufrecht zu erhalten und oxidativen Stress zu verhindern, besitzen die Zellen eine Vielzahl von ROS-regulierenden Mechanismen5.
Physiologische Konzentrationen bestimmter ROS sind für eine ordnungsgemäße embryonale und erwachsene Hämatopoese6notwendig. Überschüssiges ROS ist jedoch mit DNA-Schäden, zellulärer Differenzierung und Erschöpfung des hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferpools verbunden. Es gibt auch Hinweise darauf, dass Veränderungen in der Redoxbiologie zwischen Leukämie und gesunden Zellen unterscheiden können. Zum Beispiel, ROS-Spiegel neigen dazu, höher in akuten myeloischen Leukämie (AML) Zellen im Vergleich zu ihren gesunden Gegenstücken und andere Studien haben vorgeschlagen, dass Leukämie-Stammzellen halten einen niedrigen stationären Zustand ROS für das Überleben7,8. Wichtig ist, Strategien zur therapeutischen Kapitalisierung dieser Redoxunterschiede haben in mehreren menschlichen Krebsumgebungen versprechend gezeigt9,10. Daher können Assays, die die Bewertung der ROS-Spiegel in Mausmodellen ermöglichen, unser Verständnis darüber verbessern, wie diese Arten zur zellulären Physiologie und Krankheitspathogenese beitragen, und potenziell eine Plattform für die Bewertung der Wirksamkeit von neuartige Nobox-targeting-Anti-Krebs-Therapien.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1109px;" width="1110">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Heat inactivated FBS</td>
			<td style="width:279px;">VWR Seradigm LIFE SCIENCE</td>
			<td style="width:393px;">97068-085</td>
			<td style="width:191px;">Media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-20</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">15 mL conical tube</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">50 mL conical tube</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">40 &#956;m cell strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RBC Lysis Buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-112-9751</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Menadione sodium Bisulfite</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>M5750</td>
			<td>Pro-oxidant</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NAC</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>A7250</td>
			<td>Anti-oxidant</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100310</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">CD4 PE-Cy5 clone RM4-5</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>15-0041-81</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>15-0081-81</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">CD19 PE-Cy5 clone 6D5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115510</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103210</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108410</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116210</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD48 PE-Cy5 clone HM48-1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103420</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD117&#160; APC-Cy7 clone 2B8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105825</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sca1 peacific Blue clone D7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108120</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD150 APC clone TC15-12F12.2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115909</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD34 FITC clone RAM34</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553733</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD45.2 APC clone 104</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>1098313</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MitoSOX Red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M36008</td>
			<td>Dye</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mitotracker Green</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M7514</td>
			<td>Dye</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Live/dead Yellow Dye</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L34967</td>
			<td>Dye</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of mitochondrial reactive oxygen species in murine hematopoietic stem and progenitor cells and mll-af9 driven leukemia

Wir präsentieren einen flow cytometrischen Ansatz zur Analyse von mitochondrialem ROS in verschiedenen lebenden Knochenmark (BM)-abgeleiteten Stamm- und Vorläuferzellpopulationen von gesunden Mäusen sowie Mäusen mit AML, die von MLL-AF9 angetrieben werden. Insbesondere beschreiben wir einen zweistufigen Zellfärbeprozess, bei dem gesunde oder Leukämie-BM-Zellen zuerst mit einem fluorogenen Farbstoff gefärbt werden, der mitochondriale Superoxide erkennt, gefolgt von der Färbung mit fluorchromegebundenen monoklonalen Antikörpern, die verwendet werden. verschiedene gesunde und bösartige hämatopoetische Vorläuferpopulationen zu unterscheiden. Wir bieten auch eine Strategie für den Erwerb und die Analyse der Proben durch Durchflusszytometrie. Das gesamte Protokoll kann in einem Zeitrahmen von nur 3-4 h durchgeführt werden. Wir heben auch die wichtigsten zu berücksichtigenden Variablen sowie die Vorteile und Grenzen der Überwachung der ROS-Produktion im mitochondrialen Teil von lebenden hämatopoetischen und Leukämiestamm- und Vorläufersubpopulationen mit fluorogenen Farbstoffen durch Durchflusszytometrie hervor. . Darüber hinaus präsentieren wir Daten, dass die mitochondriale ROS-Fülle zwischen verschiedenen gesunden HSPC-Subpopulationen und Leukämie-Vorläufern variiert, und diskutieren die möglichen Anwendungen dieser Technik in der hämatologischen Forschung.

Präsentiert wird eine Methode zur Analyse von ROS in den Mitochondrien mehrerer gesunder und MLL-AF9-exemittierender Leukämie-Vorläuferpopulationen. Abbildung 1 zeigt eine schematische Ansicht des Protokollworkflows, die aus 4 Hauptschritten besteht: 1) BM-Isolierung von Mäusen; 2) Färbung von BM-Zellen mit einem fluorogenen Farbstoff, der mitochondriale ROS, insbesondere Superoxide erkennt; 3) Oberflächenmarker-Antikörperfärbung zur Abgrenzung verschiedener gesunder und Leukämie h?...

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Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Wir beschreiben eine Methode zur Verwendung von Multiparameter-Durchflusszytometrie zum Nachweis von mitochondrialen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in murinen gesunden hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) und Leukämiezellen aus einem Mausmodell akuter myeloischer Leukämie (AML), das von MLL-AF9.

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Reaktive Sauerstoffspezies oder ROS sind hochreaktive Sauerstoffspezies, die von Zellen produziert werden und ihr Verhalten beeinflussen. Obwohl überschüssiges ROS kann auch weit verbreitete zelluläre Verwüstung verursachen, und in schweren Fällen, Zelltod. Daher ist die Aufrechterhaltung der ROS-Homöostase von grundlegender Bedeutung für die Zellfunktion und das Überleben.Das hier vorgestellte Protokoll konzentriert sich auf die Messung einer bestimmten Art von ROS, die von Mitochondrien erzeugt wird, hauptsächlich als metabolisches Nebenprodukt in lebenden, normalen oder gesunden hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellpopulationen sowie in Leukämiezellen aus dem Mausmodell von Blutkrebs, akuter myeloischer Leukämie oder AML. Dieses Protokoll kann auch verwendet werden, um zu bewerten, wie genetische Manipulation, wie Gen-Deletion oder Überexpression, mitochondriale ROS in mehreren gesunden und bösartigen hämatopoetischen Populationen beeinflusst. Und als Ergebnis, potenziell geben aufschlussreiche Informationen über Redux Zustand und möglicherweise den Stoffwechsel der Zellen.Diese Technik erlaubt die Strömungsabgleichs-Metrikanalyse einer protogenen Sonde zur Überwachung der mitochondrialen ROS-Produktion in lebenden gesunden und bösartigen hämatopoetischen Stamm- und Vorläufer-Subpopulationen. Dieses Protokoll ist einfach und kann in wenigen Stunden abgeschlossen werden. Darüber hinaus eignet es sich für die Analyse von lebenden Zellen und ermöglicht die Unterscheidung und Analyse von mitochondrialem ROS in der Stammzellpopulation im Knochenmark unter Verwendung von Oberflächenmarkierungen der Färbung.Nach dem Sammeln mononuklearer Knochenmarkzellen von wilden engen Mäusen und leukämischen MLL-AF9-Mäusen, laut Manuskript, aliquot 200 Mikroliter der Zellsuspension in jedem der neun einfarbigen Kontrollröhren. Aliquot die verbleibenden Zellen in andere experimentelle Röhren, jeweils 200 Mikroliter. Legen Sie dann in eine Zentrifuge zwei Versuchsröhren mit Knochenmarkzellen bzw. leukämischen Zellen und ein Kontrollrohr.Zentrifuge bei 300 mal G für fünf Minuten. Als nächstes dekantieren Sie den Überstand und hängen Sie die Zellen bei Raumtemperatur F-PBS mit einem Lebenden/toten Zellfleck nach den Anweisungen des Herstellers wieder auf. 30 Minuten auf Eis bebrüten.Fügen Sie danach 1 Milliliter Raumtemperatur F-PBS zu den drei lebenden/toten gebeizten Röhren und ein einziges Farbkontrollrohr für mitochondriale ROS-Färbung hinzu. Legen Sie die Rohre bei 300 mal G für fünf Minuten bei Raumtemperatur in die Zentrifuge. Dann erhalten Sie eine 5 Millimolar mitochondriale ROS Farbstoff-Stock-Lösung durch erneutes Suspendieren von 50 Mikrogramm mitochondrialen ROS-Farbstoff in 13 Mikroliter DMSO.Fügen Sie dann 13 Milliliter Raumtemperatur F-PBS in den 13 Mikroliter mitochondrialen ROS-Farbstoff, um eine endgültige Konzentration von fünf Mikromolaren zu verdünnen. Falls erforderlich, fügen Sie 13 Mikroliter 50 Millimolar Verapamil in die Lösung, um mitochondriale Efflux-Pumpen zu hemmen. Die Rohre aus der Zentrifuge beziehen und die Wäsche des lebenden/toten Zellflecks absaugen.Fügen Sie 200 Mikroliter F-PBS in die Live/Dead-Färbungskontrolle ein und halten Sie sie im Eis, bis sie bereit sind, die Analyse zu starten. Fügen Sie 200 Mikroliter des mitochondrialen ROS-Farbstoffflecks, der Verapamil enthält, zu jedem Versuchsröhrchen sowie dem mitochondrialen ROS-Färbungskontrollrohr hinzu. Wirbel zu mischen und inkubieren für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius in der Dunkelheit.Dann fügen Sie 1 Milliliter Raumtemperatur F-PBS in die Steuer- und Versuchsrohre. Zentrifuge fünf Minuten bei 300 mal G bei Raumtemperatur. Apirieren Sie das Überstand und waschen Sie die Zellen mit einem zusätzlichen Milliliter Raumtemperatur F-PBS.Zentrifuge wieder für fünf Minuten bei 300 mal G, bei Raumtemperatur. Bereiten Sie zunächst zwei Antikörpercocktails für gesunde und Leukämie-Knochenmarkzellen zu. Aspirieren Sie den Überstand aus dem Versuchsröhrchen, der gesunde Knochenmarkzellen enthält, und fügen Sie 200 Mikroliter des Antikörpercocktails Nummer eins in die Röhre ein.Wirbel zu mischen. Bereiten Sie auch die einzelnen Farbkontrollröhrchen vor, indem Sie 200 Mikroliter F-PBS und einen Mikroliter des entsprechenden Antikörpers hinzufügen. 60 Minuten auf Eis im Dunkeln bebrüten.Aspirieren Sie den Überstand aus dem Versuchsröhre, das Leukämieknochenmark enthält, und fügen Sie 200 Mikroliter des Antikörpercocktails Nummer zwei in die Röhre ein. Wirbel zu mischen. 60 Minuten auf Eis im Dunkeln bebrüten.Danach alle Schläuche mit 1 Milliliter kaltem F-PBS und Zentrifuge fünf Minuten bei 300-fachem G bei Raumtemperatur waschen. Die Zellen in 500 Mikroliter kaltem F-PBS wieder aussetzen. Übertragen Sie die Zellsuspension in jedes Durchflusszytometerrohr mit einem 40-Mikrometer-Filter zum Ausschließen von Aggregaten.Legen Sie zunächst ein Fleckenregelrohr in die Durchflusszytometriemaschine und starten Sie die Erfassung, um die Durchflusszytometriemaschine zu kompensieren. Wiederholen Sie dies für andere Steuerrohre. Danach lesen Sie die Versuchsrohre, um die Tore aufzustellen.Um die Größe und Komplexität der Zellpopulation zu analysieren, zuerst für gesunde HSPC, legen Sie die Vorwärtsstreufläche und die Seitenstreuungsflächen zu, die Populationen darstellen. Drücken Sie die Quadratische Tor-Taste, um fremde Trümmer aus dem vorderen und seitlichen Streudiagramm herauszuräumen. Verwenden Sie dann auf einem vorderen Streubereich und Höhendiagramm einen doppelten Diskriminator, um Doublets auszuschalten.Wählen Sie lebende Zellen, Linien-niedrige Zellen und die verschiedenen gesunden HSPC. Analysieren Sie für jede Voninteressespopulation die mediane Fluoreszenzintensität des TRPE-Kanals in einem Histagram-Plot, um Unterschiede im mitochondrialen ROS-Signal zu bewerten. Wiederholen Sie das gleiche Verfahren der Größenanalyse, Gating und Histogramm-Plotting für Leukämiepopulationen.Knochenmarkzellen, die von gesunden Mäusen isoliert wurden, wurden mit einem lebenden/toten Farbstoff und einem mitochondrialen ROS-Farbstoff gefärbt und anschließend mit Antikörpern gefärbt, die Linienmarker erkennen:plus CD48, C-Kit, Sca-1, CD34 und CD150. Darüber hinaus wurden Knochenmarkzellen von Leukämiemäusen auch mit CD45.2 gefärbt, um zwischen MLL-AF9-Leukämiezellen aus gesunden Empfängerknochenmarkzellen zu unterscheiden, die mit CD45.1 gefärbt sind. Ein Vergleich der mitochondrialen ROS-Färbung, zwischen gesunden CD48 negativen LSK, und myeloiden Vorläufern, zeigt, dass myeloische Vorläufer deutlich höhere Konzentrationen von mitochondrialer ROS-Färbung aufweisen.Darüber hinaus zeigen c-Kit-Vorläufer mit hoher Leukämie signifikant höhere Konzentrationen von mitochondrialer ROS-Färbung im Vergleich zu c-Kit-Mittel-Niederleukämiezellen, gesunden CD48-negativen LSK- und myeloischen Vorläufern. C-Kit-Mittel-Niedrigleukämie-Zellen, zeigte auch einen deutlich höheren Wert im Vergleich zu CD48 negativen LSK-Zellen, aber nicht zu myeloischen Vorläufern. Mitochondriale ROS-Farbstoffe sind hochreaktiv und geeignete Waschschritte sind erforderlich, um sicherzustellen, dass ein Überschuss des Farbstoffs entfernt wurde, bevor die folgenden Schritte beginnen.Es gibt mehrere chemisch unterschiedliche ROS fluorogene Farbstoffe, die in diesem Protokoll verwendet werden können, um ein wenig Wissen über den Redux-Status in lebenden hämatopoetischen Zellen zu erreichen. Diese Technik wurde in der Literatur ausgiebig verwendet und kann nützliche Einblicke in die stoffwechsel- und Signalwege liefern, die in Leukämiezellen differential reguliert werden, wenn sie mit ihren normalen Gegenstücken verglichen werden.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

Ein detailliertes Protokoll der murinen C1498-Zelllinie und der damit verbundenen Leukämie Maus-Modell für Charakterisieren

The intravenous injection of C1498 cells into syngeneic or congenic mice has been performed since 1941. These injections result in the development of ...

Forschung

Krebsforschung

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Umfassendes Protokoll zur Probe und Prozess des Knochenmarks zur Messung von messbaren Resterkrankung und leukämischen Stammzellen in der akuten myeloischen Leukämie

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Flow Cytometry um Leukämie-Stammzellen in primäre akute myeloische Leukämie und Patienten-abgeleitet-Xenotransplantate bei Diagnose und folgen bis zu schätzen

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation

Immunglobulin-gen-Sequenzanalyse In chronischer lymphatischer Leukämie: Aus Patientenmaterial Sequenz Interpretation

During B cell maturation, the complex process of immunoglobulin (IG) gene V(D)J recombination coupled with somatic hypermutation (SHM) gives rise to a ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Bewertung des metabolischen Profils der primäre Leukämie-Zellen

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

Flow durchflusszytometrischen Erkennung von neu gebildeten Stammzellen-wie Brustkrebszellen nach Apoptose Umkehr

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

Räumliche und zeitweilige Kontrolle der Murine Melanom-Initiation aus Mutant Melanocyte Stammzellen

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Evaluierung des Zelltods mit zellfreiem Überstand von Probiotika in dreidimensionalen sphäroiden Kulturen von Darmkrebszellen

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

Zwei durchflusszytometrische Ansätze der NKG2D-Ligandenoberflächendetektion zur Unterscheidung von Stammzellen von Massensubpopulationen bei akuter myeloischer Leukämie

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Flow Cytometric Analysis of Apoptotic Biomarkers in Actinomycin D-Treated SiHa Cervical Cancer Cells

Durchflusszytometrische Analyse von apoptotischen Biomarkern in Actinomycin-D-behandelten SiHa-Gebärmutterhalskrebszellen

Apoptosis biomarkers were investigated in actinomycin D-treated SiHa cervical cancer cells using a benchtop flow cytometer. Early biomarkers (Annexin V ...