Name: flow cytometric analysis of mitochondrial reactive oxygen species in murine hematopoietic stem and progenitor cells and mll-af9 driven leukemia
Uploaded: 2019-09-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia at JoVE.com

עבודה זו היתה נתמכת על ידי הדירקטוריון פוקס מרדף מרכז מנהלים (DDM), האגודה האמריקנית להמטולוגיה פרס המלומד (SMS), האגודה האמריקנית לסרטן RSG (SMS) ומשרד ההגנה (הפרס: W81XWH-18-1-0472).

כל ההליכים בעלי החיים המתוארים בפרוטוקול זה אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) במרכז הסרטן של פוקס צ'ייס.
הערה: תהליך העבודה של הפרוטוקול מחולק ל -4 חלקים כפי שמוצג באיור 1 והריאגנטים הנדרש מפורטים בטבלת החומרים.
<p class="jove_titl...

<ol>
	<li>Dr&#246;se, S., Brandt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+superoxide+production+by+the+mitochondrial+respiratory+chain.">Molecular mechanisms of superoxide production by the mitochondrial respiratory chain.</a> Advances in experimental medicine and biology. 748, 145-169 (2012).</li><li>Gerber, P. A., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Oxidative+Stress+and+Hypoxia+in+Pancreatic+Beta-Cell+Dysfunction+in+Diabetes+Mellitus.">The Role of Oxidative Stress and Hypoxia in Pancreatic Beta-Cell Dysfunction in Diabetes Mellitus.</a> Antioxidant &amp; Redox Signaling. 26 (10), 501-518 (2017).</li><li>H&#246;hn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Happily+(n)ever+after:+Aging+in+the+context+of+oxidative+stress,+proteostasis+loss+and+cellular+senescence.">Happily (n)ever after: Aging in the context of oxidative stress, proteostasis loss and cellular senescence.</a> Redox Biology. 11, 482-501 (2017).</li><li>Reuter, S., Gupta, S. C., Chaturvedi, M. M., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress,+inflammation,+and+cancer:+how+are+they+linked.">Oxidative stress, inflammation, and cancer: how are they linked.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 49 (11), 1603-1616 (2010).</li><li>Lee, B. W. L., Ghode, P., Ong, D. S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+regulation+of+cell+state+and+fate.">Redox regulation of cell state and fate.</a> Redox Biology. 2213-2317 (18), 30899 (2018).</li><li>Harris, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+metabolism+impacts+the+spatiotemporal+onset+and+magnitude+of+HSC+induction+in+vivo.">Glucose metabolism impacts the spatiotemporal onset and magnitude of HSC induction in vivo.</a> Blood. 121, 2483-2493 (2013).</li><li>Hole, P. S., Darley, R. L., Tonks, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+reactive+oxygen+species+play+a+role+in+myeloid+leukemias.">Do reactive oxygen species play a role in myeloid leukemias.</a> Blood. 117, 5816-5826 (2011).</li><li>Lagadinou, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BCL-2+inhibition+targets+oxidative+phosphorylation+and+selectively+eradicates+quiescent+human+leukemia+stem+cells.">BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (3), 329-341 (2013).</li><li>Di Marcantonio, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Kinase+C+Epsilon+Is+a+Key+Regulator+of+Mitochondrial+Redox+Homeostasis+in+Acute+Myeloid+Leukemia.">Protein Kinase C Epsilon Is a Key Regulator of Mitochondrial Redox Homeostasis in Acute Myeloid Leukemia.</a> Clinical Cancer Research. 24 (3), 608-618 (2018).</li><li>Glasauer, A., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+antioxidants+for+cancer+therapy.">Targeting antioxidants for cancer therapy.</a> Biochemical Pharmacology. 92 (1), 90-101 (2014).</li><li>Krivtsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+from+committed+progenitor+to+leukaemia+stem+cell+initiated+by+MLL-AF9.">Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9.</a> Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).</li><li>Frascoli, M., Proietti, M., Grassi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+and+isolation+of+murine+hematopoietic+stem+cells+and+lineage-committed+progenitors.">Phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li><li>Lo Celso, C., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transplantation+of+hematopoietic+stem+cells+(HSCs).">Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs).</a> Journal of Visualized Experiments. (157), (2007).</li><li>Kalaitzidis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+complex+1+plays+critical+roles+in+hematopoiesis+and+Pten-loss-evoked+leukemogenesis.">mTOR complex 1 plays critical roles in hematopoiesis and Pten-loss-evoked leukemogenesis.</a> Cell Stem Cell. 11 (3), 429-439 (2012).</li><li>Sykes, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AKT/FOXO+signaling+enforces+reversible+differentiation+blockade+in+myeloid+leukemias.">AKT/FOXO signaling enforces reversible differentiation blockade in myeloid leukemias.</a> Cell. 146 (5), 697-708 (2011).</li><li>Kalaitzidis, D., Neel, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-cytometric+phosphoprotein+analysis+reveals+agonist+and+temporal+differences+in+responses+of+murine+hematopoietic+stem/progenitor+cells.">Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells.</a> PLoS One. 3 (11), 3776 (2008).</li><li>Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Yilmaz, O. H., Terhorst, C., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells.">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).</li><li>Mooney, C. J., Cunningham, A., Tsapogas, P., Toellner, K. M., Brown, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+expression+of+flt3+within+the+mouse+hematopoietic+stem+cell+compartment.">Selective expression of flt3 within the mouse hematopoietic stem cell compartment.</a> International Journal Molecular Sciences. 18 (5), (2017).</li><li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+markers+resolve+functional+distinct+sub-populations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors.">SLAM family markers resolve functional distinct sub-populations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li><li>Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+lymphohematopoietic+reconstitution+by+a+single+CD34-low/negative+hematopoietic+stem+cell.">Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.</a> Science. 273 (5272), 242-245 (1996).</li><li>Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+and+hierarchy+within+the+most+primitive+hematopoietic+stem+cell+compartment.">Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1178 (2010).</li><li>Mukhopadhyay, P., Rajesh, M., Hask&#243;, G., Hawkins, B. J., Madesh, M., Pacher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+apoptosis+and+mitochondrial+superoxide+production+in+live+cells+by+flow+cytometry+and+confocal+microscopy.">Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy.</a> Nature Protocols. 2 (9), 2295-2301 (2007).</li><li>Camargo, F. D., Chambers, S. M., Drew, E., McNagny, K. M., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+do+not+engraft+with+absolute+efficiencies.">Hematopoietic stem cells do not engraft with absolute efficiencies.</a> Blood. 107 (2), 501-507 (2006).</li><li>Morita, Y., Ema, H., Yamazaki, S., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-side-population+hematopoietic+stem+cells+in+mouse+bone+marrow.">Non-side-population hematopoietic stem cells in mouse bone marrow.</a> Blood. 108 (8), 2850-2856 (2006).</li><li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye-Independent+Methods+Reveal+Elevated+Mitochondrial+Mass+in+Hematopoietic+Stem+Cells.">Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li><li>Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-potential+compensation+reveals+mitochondrial+volume+expansion+during+HSC+commitment.">Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment.</a> Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).</li><li>Somervaille, T. C., Cleary, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+leukemia+stem+cells+in+murine+MLL-AF9+acute+myeloid+leukemia.">Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).</li><li>Hao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Imaging+Reveals+a+Unique+Preference+of+Symmetric+Cell+Division+and+Homing+of+Leukemia-Initiating+Cells+in+an+Endosteal+Niche.">Metabolic Imaging Reveals a Unique Preference of Symmetric Cell Division and Homing of Leukemia-Initiating Cells in an Endosteal Niche.</a> Cell Metabolism. 29 (4), 950-965 (2019).</li></ol>

צבעים fluorogenic כי פותחו לאיתור של ROS מוערכים לעתים קרובות בתאים קבועים על ידי מיקרוסקופ או בתאים חיים על ידי הזרימה cy, try22. הערכת הערכה לזרימה של רוס מיטוכונדריאלי בתאי BM באמצעות צבעי fluorogenic מיטוכונדריאלי יש שני יתרונות עיקריים: 1) זוהי טכניקה מהירה ופשוטה המתאימה לניתוח תאים חיים...

מינים חמצן תגובתי (ROS) הם מולקולות תגובתי מאוד הנגזרות חמצן מולקולרי. המיקום הסלולארי המוגדר ביותר של הייצור של ROS הוא המיטוגיה, שם אלקטרונים העוברים דרך שרשרת התחבורה אלקטרון (וכו ') במהלך זירחון חמצוני (OXPHOS) נספגים על ידי חמצן מולקולרי המוביל היווצרות של מסוים סוג של רוס שנקרא סופרתחמוצות1. באמצעות הפעולות של סדרה של אנזימים, שנקרא סופראוקסיד dismutases או sods, סופראוקסיד מומרים לתוך מימן, אשר מנוטרלים לאחר מכן לתוך מים על ידי אנזימים כגון קטלאז או peroxidases גלוטתיון (gpx). רטבאליות במנגנונים ROS-רגולטוריות יכול להוביל לייצור עודף של ROS, המכונה לעתים קרובות לחץ חמצוני, אשר יש תוצאות מזיקות וקטלניות פוטנציאל הסלולר כגון נזק מקרומולקולה (כלומר, DNA, חלבון, שומנים). יתר על כן, לחץ חמצוני קשורה מספר פתווגיות, כגון סוכרת, מחלות דלקתיות, הזדקנות וגידולים2,3,4. כדי לשמור על הומאוסטזיס מחדש ולמנוע לחץ חמצוני, התאים בעלי מגוון של מנגנונים ROS-ויסות5.
רמות פיסיולוגיים של ROS מסוימים נחוצים עבור המטפיאה המתאימה ומבוגרים6. עם זאת, העודפים ROS קשורה עם נזק DNA, בידול הסלולר ותשישות של גזע המטפאות ובריכת מחולל קדמון. יש גם ראיות כי שינויים בביולוגיה החמצון עשוי להיות שונה בין לוקמיה ותאים בריאים. לדוגמה, רמות ROS נוטים להיות גבוהים יותר בלוקמיה של לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) ביחס לעמיתיהם הבריאים שלהם ומחקרים אחרים הציעו כי תאי גזע לוקמיה לשמור על רמה נמוכה יציבה המדינה של רוס להישרדות7,8. חשוב מכך, אסטרטגיות לקבלת הבדלי מחלות מבחינה רפואית בהבדלים הללו הראו הבטחה במספר הגדרות סרטןהאדם 9,10. לכן, בחני אומר כי לאפשר הערכה של רמות ROS בדגמי העכבר עשוי לשפר את ההבנה שלנו איך מינים אלה תורמים לפיזיולוגיה הסלולר מחלות פתוגנזה, כמו גם פוטנציאל לספק פלטפורמה להערכת האפקטיביות של הרומן נגד חמצון-מיקוד טיפולים נגד סרטן.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1109px;" width="1110">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Heat inactivated FBS</td>
			<td style="width:279px;">VWR Seradigm LIFE SCIENCE</td>
			<td style="width:393px;">97068-085</td>
			<td style="width:191px;">Media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-20</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">15 mL conical tube</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">50 mL conical tube</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">40 &#956;m cell strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RBC Lysis Buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-112-9751</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Menadione sodium Bisulfite</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>M5750</td>
			<td>Pro-oxidant</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NAC</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>A7250</td>
			<td>Anti-oxidant</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100310</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">CD4 PE-Cy5 clone RM4-5</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>15-0041-81</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>15-0081-81</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">CD19 PE-Cy5 clone 6D5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115510</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103210</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108410</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116210</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD48 PE-Cy5 clone HM48-1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103420</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD117&#160; APC-Cy7 clone 2B8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105825</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sca1 peacific Blue clone D7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108120</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD150 APC clone TC15-12F12.2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115909</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD34 FITC clone RAM34</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553733</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD45.2 APC clone 104</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>1098313</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MitoSOX Red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M36008</td>
			<td>Dye</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mitotracker Green</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M7514</td>
			<td>Dye</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Live/dead Yellow Dye</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L34967</td>
			<td>Dye</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of mitochondrial reactive oxygen species in murine hematopoietic stem and progenitor cells and mll-af9 driven leukemia

אנו מציגים את הגישה cytometric הזרימה עבור ניתוח מיטוכונדריאלי של רוס החיים שונים מח עצם (BM)-גזע נגזר ואוכלוסיות תאים מחולל שונות עכברים בריאים, כמו גם עכברים עם AML מונע על ידי MLL-AF9. באופן ספציפי, אנו מתארים תהליך מכתים של שני שלבים, לפיו תאים בריאים או לוקמיה מוכתמים הראשון עם צבע פלואורוגנטי המזהה על-ידי מיטוכונדריאלי, ואחריו כתמים עם נוגדנים monoochrome מקושרים המקושרים המשמשים כדי להבחין בין אוכלוסיות שונות בריאות וממאירות של המטפאות. כמו כן, אנו מספקים אסטרטגיה לרכישת וניתוח הדגימות על-ידי הזרמת cy, try. הפרוטוקול כולו יכול להתבצע בתוך פרק זמן קצר כמו 3-4 h. אנו גם להדגיש את המשתנים מפתח לשקול, כמו גם את היתרונות ואת המגבלות של ניטור הייצור של ROS בתוך תא מיטוכונדריאלי של לחיות המטפאות לוקמיה גזע ומתת באמצעות צבעים fluorogenic על ידי הזרמת cy, . יתר על כן, אנו מציגים נתונים כי השפע מיטוכונדריאלי משתנה בין אוכלוסיות משנה בריאה HSPC בריא ו לוקמיה ושלתי ולדון ביישומים האפשריים של טכניקה זו במחקר המטקולוגי.

הציג הוא שיטה לניתוח ROS ב המיטו, בריאות מרובות ו-MLL-AF9-ביטוי של אוכלוסיות לוקמיה. איור 1 מציג תצוגה סכמטית של זרימת העבודה של הפרוטוקול, המורכבת מ-4 שלבים עיקריים: 1) בידוד מעכברים; 2) צביעת תאי מוניטור עם צבע פלואורוגנטי המזהה ROS מיטוכונדריאלי, במיוחד סופרתחמוצות; 3) לסמן את הנוגד...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia at JoVE.com

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

אנו מתארים שיטה עבור שימוש בזרימה רב פרמטרים cy, לנסות לזהות מיני מיטוכונדריאלי מינים חמצן (ROS) ב מורטין גזע בריא המטבית ובתאי מחולל (HSPCs) ותאי לוקמיה ממודל העכבר של לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) מונע על ידי MLL-AF9.

הזרמת כדוריות הדם של מיני חמצן מיטוכונדריאלי מורטין בגזע ובתאי מחולל ולוקמיה מונחה AF9

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

מיני חמצן תגובתי או ROS, הם מיני חמצן תגובתי מאוד המיוצרים על ידי תאים, ומשפיע על התנהגותם. למרות עודף ROS יכול גם לגרום הרס תאי נרחב, במקרים חמורים, מוות תאי. לכן, התחזוקה של הוקמפוס ROS היא בעלת חשיבות בסיסית לתפקוד הסלולר והישרדות.הפרוטוקול המוצג כאן, מתמקד במדידת סוג מסוים של ROS, שנוצר על ידי מיטוכונדריה, בעיקר כמוצר משנה מטבולי בגזע חי, נורמלי, או בריא hematopoietic גזע אוכלוסיות תאים אבי, כמו גם בתאי לוקמיה ממודל העכבר של סרטן הדם, לוקמיה מיאלואידית חריפה או AML. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי להעריך כיצד מניפולציה גנטית, כגון מחיקת גנים או לחץ יתר, משפיעה על ROS המיטוכונדריאלי במספר אוכלוסיות hematopoietic בריאים ממאירים. וכתוצאה מכך, פוטנציאל לספק מידע תובנה על מצב redux ואולי חילוף החומרים של התאים.טכניקה זו מאשרת ניתוח מטרי של גשוש פרוטוגניים כדי לפקח על ייצור ROS מיטוכונדריאלי בגזע ההמוטופיאטי בריא וממאאיר חי ותת-אוכלוסיות של צאצאים. פרוטוקול זה הוא פשוט ו ניתן להשלים אותו בעוד מספר שעות. יתר על כן, הוא מתאים לניתוח תאים חיים ומאפשר להבחין ולנתח ROS מיטוכונדריאלי באוכלוסיית תאי גזע במח העצם, באמצעות סימן פני השטח של כתמים.לאחר איסוף תאי מח עצם מונונוקליריים מעכברים הדוקים פראיים ועכברי MLL-AF9 לויקמיים, על פי כתב היד, aliquot 200 microliters של ההשעיה התא לתוך כל אחד מתשעה צינורות בקרת צבע יחיד. עלה על התאים הנותרים לצינורות ניסוי אחרים, 200 מיקרוליטרים כל אחד. לאחר מכן מניחים לתוך צנטריפוגה שני צינורות ניסיוניים המכילים תאי מח עצם ותאים לויקמיים בהתאמה, וצינור בקרה אחד.צנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך חמש דקות. לאחר מכן, decant supernatant, ולהשעות מחדש את התאים בטמפרטורת החדר F-PBS עם כתם תא חי / מת, על פי הוראות היצרן. דגירה על קרח במשך 30 דקות.לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר של טמפרטורת החדר F-PBS לשלושת הצינורות המוכתמים חיים/מתים, וצינור בקרה אחד בצבע יחיד להכתמת צבע ROS מיטוכונדריאלי. מניחים את הצינורות לתוך הצנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להשיג 5 מילימולרי פתרון מלאי צבע ROS מיטוכונדריאלי על ידי השעיה מחדש 50 מיקרוגרם של צבע ROS מיטוכונדריאלי ב 13 microliters של DMSO.לאחר מכן הוסיפו 13 מיליליטר של טמפרטורת החדר F-PBS לצבע ROS המיטוכונדריאלי 13 מיקרוליטר כדי לדלל לריכוז סופי של חמישה מיקרומולרים. במידת הצורך, להוסיף 13 microliters של 50 מילימול Verapamil לפתרון כדי לעכב משאבות efflux מיטוכונדריאלי. להשיג את הצינורות מן הצנטריפוגה ולשאוף את לשטוף את הכתם תא חי / מת.הוסף 200 microliters של F-PBS בבקרת הכתמים חיים / מתים ולשמור אותו בקרח עד מוכן להתחיל את הניתוח. הוסף 200 microliters של כתם צבע ROS המיטוכונדריאלי המכיל Verapamil, לכל צינור ניסיוני, כמו גם את צינור בקרת הכתמים ROS המיטוכונדריאלי. מערבולת לערבב דגירה במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בחושך.לאחר מכן הוסיפו מיליליטר של טמפרטורת החדר F-PBS לבקרה ולצינורות הניסוי. צנטריפוגה חמש דקות ב 300 פעמים G בטמפרטורת החדר. שאפו את העל-טבעי ושטפו את התאים במיליליטר נוסף של טמפרטורת החדר F-PBS.צנטריפוגה שוב במשך חמש דקות ב 300 פעמים G, בטמפרטורת החדר. ראשית, להכין שני קוקטיילים נוגדנים לתאי מח עצם בריאים לוקמיה. שאפו את העל-טבעי מהצינור הניסיוני המכיל תאי מח עצם בריאים, והוסיפו לצינור 200 מיקרוליטרים של קוקטייל הנוגדנים מספר אחת.וורטקס לערבב. כמו כן להכין את צינורות בקרת צבע יחיד על ידי הוספת 200 microliters של F-PBS ומיקרוליטר אחד של הנוגדן המתאים. דגירה במשך 60 דקות על קרח בחושך.שאפו את העל-טבעי מהצינור הניסיוני המכיל מח עצם לוקמיה, והוסיפו לצינור 200 מיקרוליטרים של קוקטייל הנוגדנים מספר שתיים. וורטקס לערבב. דגירה במשך 60 דקות על קרח בחושך.לאחר מכן, לשטוף את כל הצינורות עם 1 מיליליטר של F-PBS קר צנטריפוגה במשך חמש דקות ב 300 פעמים G בטמפרטורת החדר. להשעות מחדש את התאים ב 500 microliters של F-PBS קר. העבר את מתלי התא לתוך כל צינור ציטומטר זרימה עם מסנן 40 מיקרומטר עבור אי הכללת אגרגטים.ראשית, להכניס אחד אין צינור בקרת כתם לתוך מכונת cytometry זרימה ולהתחיל את הרכישה כדי לפצות על מכונת cytometry זרימה. חזור על הפעולה עבור צינורות בקרה אחרים. לאחר מכן, קרא את צינורות הניסוי כדי להקים את השערים.כדי לנתח את הגודל והמורכבות של אוכלוסיית התאים, תחילה עבור HSPC בריא, הגדר את אזור פיזור קדימה ואת אזור פיזור הצד חלקות אוכלוסיות. לחץ על כפתור השער המרובע, כדי לשער פסולת מיותרת מהמגרש של פיזור קדימה וצד. לאחר מכן, באזור פיזור קדמי ובמגרש גובה, השתמש במבדיל כפול כדי לתפוז כפילים.בחר תאים חיים, תאים נמוכים שושלת, ואת HSPC בריא שונים. עבור כל אוכלוסייה של עניין, לנתח את עוצמת הפלואורסצנטיות החציונית של ערוץ TRPE בעלילת היסטגרם, כדי להעריך את ההבדלים באות ROS המיטוכונדריאלי. חזור על אותו הליך של ניתוח גודל, gating והיסטוגרמה התוויית עבור אוכלוסיות לוקמיה.תאי מח עצם מבודדים מעכברים בריאים היו מוכתמים בצבע חי/מת וצבע ROS מיטוכונדריאלי, ולאחר מכן מוכתמים בנוגדנים המכירים סמני שושלת:בתוספת CD48, C-kit, Sca-1, CD34 ו- CD150. בנוסף, תאי מח עצם מעכברי לוקמיה היו מוכתמים גם ב- CD45.2 כדי להפלות בין תאי לוקמיה MLL-AF9 מתאים בריאים למח העצם מוכתמים ב- CD45.1. השוואה של כתמי ROS מיטוכונדריאליים, בין LSK שלילי CD48 בריא, לבין מיאלואידים, מראה כי מיאלואידים progenitors להציג רמות גבוהות באופן משמעותי של כתמי ROS מיטוכונדריאלי.יתר על כן, c-Kit לויקמיה גבוהה progenitors להציג רמות גבוהות באופן משמעותי של כתמי ROS מיטוכונדריאלי, לעומת c-Kit בינוני תאים לוקמיה נמוכה, LSK שלילי CD48 בריא, מיאלואידים. C-Kit ביניים תאי לוקמיה נמוכה, גם הציג ערך גבוה משמעותית בהשוואה לתאי LSK שליליים CD48, אבל לא לאב מיאלואידים. צבעי ROS מיטוכונדריאלי מגיבים מאוד ויש צורך בצעדי שטיפה מתאימים כדי להבטיח שכל עודף של הצבע הוסר לפני תחילת השלבים הבאים.ישנם מספר צבעים פלואורוגניים ROS ברור מבחינה כימית שניתן להשתמש בהם בפרוטוקול זה, כדי להשיג קצת ידע על מצב redux בתאים hematopoietic חיים. טכניקה זו שימשה בהרחבה בספרות, ועשויה לספק תובנות שימושיות על מסלולי חילוף החומרים ואיתות כי הם מוסדרים באופן דיפרנציאלי בתאי לוקמיה, אם בהשוואה לעמיתיהם הרגילים.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

פרוטוקול מפורט לאפיון לקו הסלולרי Murine C1498 דגם Associated לוקמיה העכבר שלה

The intravenous injection of C1498 cells into syngeneic or congenic mice has been performed since 1941. These injections result in the development of ...

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

פרוטוקולים מקיפה לדוגמה, מח עצם תהליך למדידת מחלה שיורית מדיד, לוקמיה בתאי גזע לוקמיה מיאלואידית חריפה

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Flow Cytometry להעריך לוקמיה תאי גזע ראשי לוקמיה מיאלואידית חריפה, החולה-נגזר-xenografts, אבחון, מעקב.

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation

ניתוח רצף גנטי בנוגדנים בלוקמיה לימפוציטית כרונית: מחומר החולה לפרשנות רצף

During B cell maturation, the complex process of immunoglobulin (IG) gene V(D)J recombination coupled with somatic hypermutation (SHM) gives rise to a ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

הערכה של פרופיל מטבולי של תאי סרטן ראשוני

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

גילוי Cytometric זרימה של תאים, כמו תאי גזע סרטניים בשד החדשה לאחר היפוך אפופטוזיס

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

שליטה מרחבית וטמפורלית של מלנומה מורין ייזום מוטציה תאי גזע מלנוציט

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

הערכת מוות תאים באמצעות Supernatant ללא תאים של פרוביוטיקה בתרביות כדוריות תלת מימדיות של תאים סרטניים המעי הגס

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

שתי גישות ציטומטריות זרימה של גילוי משטח ליגנד NKG2D כדי להבחין בין תאי גזע לבין תת אוכלוסין בתפזורת בלוקמיה מיאלואידית חריפה

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Flow Cytometric Analysis of Apoptotic Biomarkers in Actinomycin D-Treated SiHa Cervical Cancer Cells

ניתוח ציטומטרי זרימה של סמנים ביולוגיים אפופטוטיים בתאי סרטן צוואר הרחם SiHa שטופלו ב- Actinomycin D

Apoptosis biomarkers were investigated in actinomycin D-treated SiHa cervical cancer cells using a benchtop flow cytometer. Early biomarkers (Annexin V ...