Name: flow cytometric analysis of mitochondrial reactive oxygen species in murine hematopoietic stem and progenitor cells and mll-af9 driven leukemia
Uploaded: 2019-09-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato dal Fox Chase Cancer Center Board of Directors (DDM), l'American Society of Hematology Scholar Award (SMS), American Cancer Society RSG (SMS) e dal Department of Defense (Award: W81XWH-18-1-0472).

Tutte le procedure sugli animali descritte in questo protocollo sono state approvate dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) del Fox Chase Cancer Center.
 NOT:</</c0> Il flusso di lavoro del protocollo è suddiviso in 4 parti, come illustrato nella Figura 1 e i reagenti necessari sono elencati nella tabella dei materiali.
1. Isolamento del midollo osseo (BM)
<p class="jove...

<ol>
	<li>Dr&#246;se, S., Brandt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+superoxide+production+by+the+mitochondrial+respiratory+chain.">Molecular mechanisms of superoxide production by the mitochondrial respiratory chain.</a> Advances in experimental medicine and biology. 748, 145-169 (2012).</li><li>Gerber, P. A., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Oxidative+Stress+and+Hypoxia+in+Pancreatic+Beta-Cell+Dysfunction+in+Diabetes+Mellitus.">The Role of Oxidative Stress and Hypoxia in Pancreatic Beta-Cell Dysfunction in Diabetes Mellitus.</a> Antioxidant &amp; Redox Signaling. 26 (10), 501-518 (2017).</li><li>H&#246;hn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Happily+(n)ever+after:+Aging+in+the+context+of+oxidative+stress,+proteostasis+loss+and+cellular+senescence.">Happily (n)ever after: Aging in the context of oxidative stress, proteostasis loss and cellular senescence.</a> Redox Biology. 11, 482-501 (2017).</li><li>Reuter, S., Gupta, S. C., Chaturvedi, M. M., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress,+inflammation,+and+cancer:+how+are+they+linked.">Oxidative stress, inflammation, and cancer: how are they linked.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 49 (11), 1603-1616 (2010).</li><li>Lee, B. W. L., Ghode, P., Ong, D. S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+regulation+of+cell+state+and+fate.">Redox regulation of cell state and fate.</a> Redox Biology. 2213-2317 (18), 30899 (2018).</li><li>Harris, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+metabolism+impacts+the+spatiotemporal+onset+and+magnitude+of+HSC+induction+in+vivo.">Glucose metabolism impacts the spatiotemporal onset and magnitude of HSC induction in vivo.</a> Blood. 121, 2483-2493 (2013).</li><li>Hole, P. S., Darley, R. L., Tonks, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+reactive+oxygen+species+play+a+role+in+myeloid+leukemias.">Do reactive oxygen species play a role in myeloid leukemias.</a> Blood. 117, 5816-5826 (2011).</li><li>Lagadinou, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BCL-2+inhibition+targets+oxidative+phosphorylation+and+selectively+eradicates+quiescent+human+leukemia+stem+cells.">BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (3), 329-341 (2013).</li><li>Di Marcantonio, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Kinase+C+Epsilon+Is+a+Key+Regulator+of+Mitochondrial+Redox+Homeostasis+in+Acute+Myeloid+Leukemia.">Protein Kinase C Epsilon Is a Key Regulator of Mitochondrial Redox Homeostasis in Acute Myeloid Leukemia.</a> Clinical Cancer Research. 24 (3), 608-618 (2018).</li><li>Glasauer, A., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+antioxidants+for+cancer+therapy.">Targeting antioxidants for cancer therapy.</a> Biochemical Pharmacology. 92 (1), 90-101 (2014).</li><li>Krivtsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+from+committed+progenitor+to+leukaemia+stem+cell+initiated+by+MLL-AF9.">Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9.</a> Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).</li><li>Frascoli, M., Proietti, M., Grassi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+and+isolation+of+murine+hematopoietic+stem+cells+and+lineage-committed+progenitors.">Phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li><li>Lo Celso, C., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transplantation+of+hematopoietic+stem+cells+(HSCs).">Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs).</a> Journal of Visualized Experiments. (157), (2007).</li><li>Kalaitzidis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+complex+1+plays+critical+roles+in+hematopoiesis+and+Pten-loss-evoked+leukemogenesis.">mTOR complex 1 plays critical roles in hematopoiesis and Pten-loss-evoked leukemogenesis.</a> Cell Stem Cell. 11 (3), 429-439 (2012).</li><li>Sykes, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AKT/FOXO+signaling+enforces+reversible+differentiation+blockade+in+myeloid+leukemias.">AKT/FOXO signaling enforces reversible differentiation blockade in myeloid leukemias.</a> Cell. 146 (5), 697-708 (2011).</li><li>Kalaitzidis, D., Neel, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-cytometric+phosphoprotein+analysis+reveals+agonist+and+temporal+differences+in+responses+of+murine+hematopoietic+stem/progenitor+cells.">Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells.</a> PLoS One. 3 (11), 3776 (2008).</li><li>Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Yilmaz, O. H., Terhorst, C., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells.">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).</li><li>Mooney, C. J., Cunningham, A., Tsapogas, P., Toellner, K. M., Brown, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+expression+of+flt3+within+the+mouse+hematopoietic+stem+cell+compartment.">Selective expression of flt3 within the mouse hematopoietic stem cell compartment.</a> International Journal Molecular Sciences. 18 (5), (2017).</li><li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+markers+resolve+functional+distinct+sub-populations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors.">SLAM family markers resolve functional distinct sub-populations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li><li>Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+lymphohematopoietic+reconstitution+by+a+single+CD34-low/negative+hematopoietic+stem+cell.">Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.</a> Science. 273 (5272), 242-245 (1996).</li><li>Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+and+hierarchy+within+the+most+primitive+hematopoietic+stem+cell+compartment.">Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1178 (2010).</li><li>Mukhopadhyay, P., Rajesh, M., Hask&#243;, G., Hawkins, B. J., Madesh, M., Pacher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+apoptosis+and+mitochondrial+superoxide+production+in+live+cells+by+flow+cytometry+and+confocal+microscopy.">Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy.</a> Nature Protocols. 2 (9), 2295-2301 (2007).</li><li>Camargo, F. D., Chambers, S. M., Drew, E., McNagny, K. M., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+do+not+engraft+with+absolute+efficiencies.">Hematopoietic stem cells do not engraft with absolute efficiencies.</a> Blood. 107 (2), 501-507 (2006).</li><li>Morita, Y., Ema, H., Yamazaki, S., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-side-population+hematopoietic+stem+cells+in+mouse+bone+marrow.">Non-side-population hematopoietic stem cells in mouse bone marrow.</a> Blood. 108 (8), 2850-2856 (2006).</li><li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye-Independent+Methods+Reveal+Elevated+Mitochondrial+Mass+in+Hematopoietic+Stem+Cells.">Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li><li>Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-potential+compensation+reveals+mitochondrial+volume+expansion+during+HSC+commitment.">Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment.</a> Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).</li><li>Somervaille, T. C., Cleary, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+leukemia+stem+cells+in+murine+MLL-AF9+acute+myeloid+leukemia.">Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).</li><li>Hao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Imaging+Reveals+a+Unique+Preference+of+Symmetric+Cell+Division+and+Homing+of+Leukemia-Initiating+Cells+in+an+Endosteal+Niche.">Metabolic Imaging Reveals a Unique Preference of Symmetric Cell Division and Homing of Leukemia-Initiating Cells in an Endosteal Niche.</a> Cell Metabolism. 29 (4), 950-965 (2019).</li></ol>

I coloranti fluorogenici che sono stati sviluppati per la rilevazione di ROS sono spesso valutati in cellule fisse mediante microscopia o in cellule vive per citometria di flusso22. La valutazione citometrica del flusso del ROS mitocondriale nelle cellule BM che utilizza nodi fluorogeniche MItocondriali ROS ha due vantaggi principali: 1) Si tratta di una tecnica semplice e veloce adatta per l'analisi delle cellule vive e 2) consente di distinguere e analizzare raro a livello di singola cellula nel...

Le specie REattive dell'ossigeno (ROS) sono molecole altamente reattive derivate dall'ossigeno molecolare. La posizione cellulare più ben definita della produzione di ROS è il mitocondria, dove gli elettroni che passano attraverso la catena di trasporto degli elettroni (ETC) durante il fosforoostoslazione ossidativa (OXPHOS) vengono assorbiti dall'ossigeno molecolare che porta alla formazione di uno specifico tipo di ROS chiamato superoossidi1. Attraverso le azioni di una serie di enzimi, chiamati disinmutasi di superossido o SOD, i superolisi vengono convertiti in perossidi di idrogeno, che vengono successivamente neutralizzati in acqua da enzimi come catalasi o perossioni glutathione (GPX). Le perturbazioni nei meccanismi di regolazione del ROS possono portare all'eccesso di produzione di ROS, spesso indicato come stress ossidativo, che hanno conseguenze cellulari dannose e potenzialmente letali come il danno da macromolecola (cioè DNA, proteine, lipidi). Inoltre, lo stress ossidativo è legato a diverse patologie, come il diabete, le malattie infiammatorie, l'invecchiamento e i tumori2,3,4. Per mantenere l'omeostasi redox e prevenire lo stress ossidativo, le cellule possiedono una varietà di meccanismi di regolazione ROS5.
I livelli fisiologici di alcuni ROS sono necessari per una corretta ematopoiesi embrionale e adulta6. Tuttavia, l'eccesso di ROS è associato al danno al DNA, alla differenziazione cellulare e all'esaurimento dello stelo ematopoietico e del pool progenitore. Ci sono anche prove che le alterazioni nella biologia redox possono differire tra leucemia e cellule sane. Ad esempio, i livelli di ROS tendono ad essere più elevati nelle cellule acute di leucemia mieloide (AML) rispetto alle loro controparti sane e altri studi hanno suggerito che le cellule staminali della leucemia mantengono un basso livello costante di ROS per la sopravvivenza7,8. È importante sottolineare che le strategie per capitalizzare terapeuticamente queste differenze redox hanno mostrato promessa in diverse impostazioni di cancro umano9,10. Pertanto, i saggi che consentono la valutazione dei livelli di ROS nei modelli murini possono migliorare la nostra comprensione di come queste specie contribuiscono alla fisiologia cellulare e alla patogenesi della malattia, nonché potenzialmente fornire una piattaforma per valutare l'efficacia nuove terapie anti-cancro di mira redox.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1109px;" width="1110">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Heat inactivated FBS</td>
			<td style="width:279px;">VWR Seradigm LIFE SCIENCE</td>
			<td style="width:393px;">97068-085</td>
			<td style="width:191px;">Media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-20</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">15 mL conical tube</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">50 mL conical tube</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">40 &#956;m cell strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RBC Lysis Buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-112-9751</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Menadione sodium Bisulfite</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>M5750</td>
			<td>Pro-oxidant</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NAC</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>A7250</td>
			<td>Anti-oxidant</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100310</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">CD4 PE-Cy5 clone RM4-5</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>15-0041-81</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>15-0081-81</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">CD19 PE-Cy5 clone 6D5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115510</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103210</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108410</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116210</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD48 PE-Cy5 clone HM48-1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103420</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD117&#160; APC-Cy7 clone 2B8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105825</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sca1 peacific Blue clone D7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108120</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD150 APC clone TC15-12F12.2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115909</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD34 FITC clone RAM34</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553733</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD45.2 APC clone 104</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>1098313</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MitoSOX Red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M36008</td>
			<td>Dye</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mitotracker Green</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M7514</td>
			<td>Dye</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Live/dead Yellow Dye</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L34967</td>
			<td>Dye</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of mitochondrial reactive oxygen species in murine hematopoietic stem and progenitor cells and mll-af9 driven leukemia

Vi presentiamo un approccio citometrico a flusso per analizzare il ROS mitocondriale in varie popolazioni di cellule staminali e progenitrici derivate da mandorone vivo (BM) da topi sani e topi con AML guidati da MLL-AF9. In particolare, descriviamo un processo di colorazione delle cellule in due fasi, in base al quale le cellule BM sane o leucemia vengono prima macchiate con un colorante fluorogenico che rileva i superossidi mitocondriali, seguito dalla colorazione con anticorpi monoclonali fluoromemici che vengono utilizzati per distinguere varie popolazioni di progenitori ematopoietici sani e maligni. Forniamo anche una strategia per l'acquisizione e l'analisi dei campioni per citometria di flusso. L'intero protocollo può essere eseguito in un lasso di tempo Mettiamo inoltre in evidenza le variabili chiave da considerare, nonché i vantaggi e i limiti del monitoraggio della produzione ROS nel compartimento mitocondriale delle sottopopolazioni di stelo e leucemia e progenie vive utilizzando coloranti fluogenici per citometria di flusso . Inoltre, presentiamo dati che l'abbondanza mitocondriale ROS varia tra distinti sottopopolazioni HSPC sani e progenitori di leucemia e discutiamo le possibili applicazioni di questa tecnica nella ricerca ematologica.

Presentato è un metodo per analizzare ROS nei mitocondri di più popolazioni progenie leucemia sane e MLL-AF9-esprimente. Figura 1 viene visualizzata una visualizzazione schematica del flusso di lavoro protocollo, che consiste di 4 passaggi principali: 1) isolamento BM dai mouse; 2) colorare le cellule BM con un colorante fluorogenico che riconosce ROS mitocondriale, in particolare superossidi; 3) Colorazione anticorpo marcatore di superficie per delineare varie popolazioni sane e leucemia ...

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Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Descriviamo un metodo per l'utilizzo di citometria a flusso multiparametrico per rilevare le specie di ossigeno reattivo mitocondriale (ROS) in cellule staminali e progenitrici (HSPC) e cellule leucemiche da un modello murino di leucemia mieloide acuta (AML) MLL-AF9.

Flusso Analisi citometrica delle specie di ossigeno reattivo mitocondriale nelle cellule staminali e semigeniche Murine Hematopoietic e MLL-AF9 Driven Leucemia

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Le specie reattive dell'ossigeno o ROS, sono specie di ossigeno altamente reattive prodotte dalle cellule e influenzano il loro comportamento. Sebbene l'eccesso di ROS possa anche causare un diffuso caos cellulare e, nei casi più gravi, la morte cellulare. Pertanto, il mantenimento dell'omeostasi del ROS è di fondamentale importanza per la funzione cellulare e la sopravvivenza.Il protocollo qui presentato, si concentra sulla misurazione di un tipo specifico di ROS, che è generato dai mitocondri, principalmente come prodotto metabolico nelle popolazioni di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche vive, normali o sane, nonché nelle cellule leucemie del modello di topo del cancro del sangue, leucemia mieloide acuta o AML. Questo protocollo può anche essere utilizzato per valutare come la manipolazione genetica, come la delezione genica o la sovraespressione, abbia un impatto sul ROS mitocondriale in diverse popolazioni ematopoietiche sane e maligne. E di conseguenza, potenzialmente fornire informazioni perspicaci sullo stato redux e possibilmente sul metabolismo delle cellule.Questa tecnica autorizza l'analisi metrica del sistema di flusso di una sonda protogenica per monitorare la produzione di ROS mitocondriale in fusto ematopoietico vivo sano e maligno e sottopopolazione progenitrice. Questo protocollo è semplice e può essere completato in poche ore. Inoltre, è adatto per l'analisi delle cellule vive e consente di distinguere e analizzare il ROS mitocondriale nella popolazione di cellule staminali nel midollo osseo, utilizzando il segno superficiale di colorazione.Dopo aver raccolto cellule di midollo osseo mononucleare da topi stretti selvatici e topi leucemici MLL-AF9, secondo il manoscritto, aliquota 200 microlitri della sospensione cellulare in ciascuno dei nove singoli tubi di controllo del colore. Aliquote le celle rimanenti in altri tubi sperimentali, 200 microlitri ciascuno. Quindi mettere in una centrifuga due tubi sperimentali contenenti rispettivamente cellule di midollo osseo e cellule leucemiche e un tubo di controllo.Centrifuga a 300 volte G per cinque minuti. Successivamente, decantare il supernatante e sospendere di nuovo le cellule in F-PBS a temperatura ambiente con una macchia di cellule vive / morte, secondo le istruzioni del produttore. Incubare sul ghiaccio per 30 minuti.Successivamente, aggiungere 1 millilitro di F-PBS a temperatura ambiente ai tre tubi macchiati vivi / morti e un singolo tubo di controllo del colore per la colorazione del colorante ROS mitocondriale. Posizionare i tubi nella centrifuga a 300 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi, ottenere una soluzione di colorante ROS mitocondriale da 5 millimolare sospendendo 50 microgrammi di colorante ROS mitocondriale in 13 microlitri di DMSO.Quindi aggiungere 13 millilitri di F-PBS a temperatura ambiente al colorante ROS mitocondriale da 13 microlitri per diluire a una concentrazione finale di cinque micromolari. Se necessario, aggiungere 13 microlitri di Verapamil da 50 millimolari alla soluzione per inibire le pompe efflux mitocondriali. Ottenere i tubi dalla centrifuga e aspirare dal lavaggio della macchia di cellule vive / morte.Aggiungere 200 microlitri di F-PBS nel controllo della colorazione vivo/morto e tenerlo nel ghiaccio fino a quando non è pronto per iniziare l'analisi. Aggiungere 200 microlitri della macchia colorante ROS mitocondriale contenente Verapamil, ad ogni tubo sperimentale, così come il tubo di controllo della colorazione ROS mitocondriale. Vortice da mescolare e incubare per 10 minuti a 37 gradi Celsius al buio.Quindi aggiungere 1 millilitro di F-PBS a temperatura ambiente ai tubi di controllo e sperimentali. Centrifugare cinque minuti a 300 volte G a temperatura ambiente. Aspirare il supernato e lavare le cellule con un millilitro aggiuntivo di F-PBS a temperatura ambiente.Centrifugare di nuovo per cinque minuti a 300 volte G, a temperatura ambiente. In primo luogo, preparare due cocktail anticorpali per cellule del midollo osseo sane e leucemie. Aspirare il supernatante dal tubo sperimentale contenente cellule sane del midollo osseo e aggiungere al tubo 200 microlitri del cocktail anticorpale numero uno.Vortice da mescolare. Preparare anche i singoli tubi di controllo del colore aggiungendo 200 microlitri di F-PBS e un microlitro dell'anticorpo corrispondente. Incubare per 60 minuti sul ghiaccio al buio.Aspirare il supernatante dal tubo sperimentale contenente midollo osseo di leucemia e aggiungere 200 microlitri del cocktail anticorpale numero due, al tubo. Vortice da mescolare. Incubare per 60 minuti sul ghiaccio al buio.Successivamente, lavare tutti i tubi con 1 millilitro di F-PBS freddo e centrifugare per cinque minuti a 300 volte G a temperatura ambiente. Sospendere di nuovo le celle in 500 microlitri di F-PBS freddo. Trasferire la sospensione cellulare in ogni tubo citometrico di flusso con un filtro da 40 micrometri per escludere gli aggregati.In primo luogo, inserire un tubo di controllo senza macchie nella macchina citometrica di flusso e avviare l'acquisizione per compensare la macchina citometrica a flusso. Ripetere per altri tubi di controllo. Successivamente, leggi i tubi sperimentali per allevare i cancelli.Per analizzare le dimensioni e la complessità della popolazione cellulare, prima per hspc sano, impostare l'area di dispersione in avanti e l'area di dispersione laterale traccia le popolazioni. Premere il pulsante Porta quadrata, per rimuovere i detriti estranei dal grafico a dispersione anteriore e laterale. Quindi, su un'area di dispersione in avanti e un grafico di altezza, usa un doppio discriminatore per cancello i farsetto.Selezionare le celle vive, le cellule basse di lignaggio e i vari HSPC integri. Per ogni popolazione di interesse, analizzare l'intensità di fluorescenza mediana del canale TRPE in un grafico istagramma, per valutare le differenze nel segnale ROS mitocondriale. Ripetere la stessa procedura di analisi delle dimensioni, gating e tracciazione dell'istogramma per le popolazioni di leucemia.Le cellule del midollo osseo isolate da topi sani sono state macchiate con un colorante vivo /morto e un colorante ROS mitocondriale, e successivamente macchiate di anticorpi che riconoscono marcatori di lignaggio:più CD48, C-kit, Sca-1, CD34 e CD150. Inoltre, anche le cellule del midollo osseo dei topi leucemia sono state macchiate con CD45.2 per discriminare tra le cellule di leucemia MLL-AF9 da cellule sane del midollo osseo ricevente macchiate con CD45.1. Un confronto della colorazione ROS mitocondriale, tra LSK negativo CD48 sano e progenitori mieloidi, mostra che i progenitori mieloidi mostrano livelli significativamente più alti di colorazione ROS mitocondriale.Inoltre, i progenitori ad alta leucemia c-Kit mostrano livelli significativamente più elevati di colorazione ROS mitocondriale, rispetto alle cellule intermedie a bassa leucemia c-Kit, all'LSK negativo CD48 sano e ai progenitori mieloidi. Le cellule intermedie a bassa leucemia del C-Kit, mostrava anche un valore significativamente più alto rispetto alle cellule LSK negative CD48, ma non ai progenitori mieloidi. I coloranti ROS mitocondriali sono altamente reattivi e sono necessarie misure di lavaggio appropriate per garantire che qualsiasi eccesso di colorante sia stato rimosso prima di iniziare i seguenti passaggi.Ci sono diversi coloranti fluorogenici ROS chimicamente distinti che possono essere utilizzati in questo protocollo, per ottenere un po 'di conoscenza dello stato redux nelle cellule ematopoietiche vive. Questa tecnica è stata ampiamente utilizzata in letteratura, e può fornire utili intuizioni sulle vie metaboliche e di segnalazione che sono regolate in modo differenziato nelle cellule di leucemia, se confrontate con le loro controparti normali.

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Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

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Analisi citometrica a flusso di biomarcatori apoptotici in cellule di cancro cervicale SiHa trattate con attinomicina D

Apoptosis biomarkers were investigated in actinomycin D-treated SiHa cervical cancer cells using a benchtop flow cytometer. Early biomarkers (Annexin V ...