Name: flow cytometric analysis of mitochondrial reactive oxygen species in murine hematopoietic stem and progenitor cells and mll-af9 driven leukemia
Uploaded: 2019-09-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia at JoVE.com

この研究は、フォックスチェイス癌センター理事会(DDM)、米国血液学会学術賞(SMS)、米国癌学会RSG(SMS)および国防総省(賞#:W81XWH-18-1-0472)によって支援されました。

このプロトコルに記載されているすべての動物の手順は、フォックスチェイス癌センターの機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されています。
注:プロトコルワークフローは図1に示すように4つの部分に分かれており、必要な試薬は材料の表に記載されています。
1. 骨髄(BM)分離
<p class="jo...

<ol>
	<li>Dr&#246;se, S., Brandt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+superoxide+production+by+the+mitochondrial+respiratory+chain.">Molecular mechanisms of superoxide production by the mitochondrial respiratory chain.</a> Advances in experimental medicine and biology. 748, 145-169 (2012).</li><li>Gerber, P. A., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Oxidative+Stress+and+Hypoxia+in+Pancreatic+Beta-Cell+Dysfunction+in+Diabetes+Mellitus.">The Role of Oxidative Stress and Hypoxia in Pancreatic Beta-Cell Dysfunction in Diabetes Mellitus.</a> Antioxidant &amp; Redox Signaling. 26 (10), 501-518 (2017).</li><li>H&#246;hn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Happily+(n)ever+after:+Aging+in+the+context+of+oxidative+stress,+proteostasis+loss+and+cellular+senescence.">Happily (n)ever after: Aging in the context of oxidative stress, proteostasis loss and cellular senescence.</a> Redox Biology. 11, 482-501 (2017).</li><li>Reuter, S., Gupta, S. C., Chaturvedi, M. M., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress,+inflammation,+and+cancer:+how+are+they+linked.">Oxidative stress, inflammation, and cancer: how are they linked.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 49 (11), 1603-1616 (2010).</li><li>Lee, B. W. L., Ghode, P., Ong, D. S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+regulation+of+cell+state+and+fate.">Redox regulation of cell state and fate.</a> Redox Biology. 2213-2317 (18), 30899 (2018).</li><li>Harris, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+metabolism+impacts+the+spatiotemporal+onset+and+magnitude+of+HSC+induction+in+vivo.">Glucose metabolism impacts the spatiotemporal onset and magnitude of HSC induction in vivo.</a> Blood. 121, 2483-2493 (2013).</li><li>Hole, P. S., Darley, R. L., Tonks, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+reactive+oxygen+species+play+a+role+in+myeloid+leukemias.">Do reactive oxygen species play a role in myeloid leukemias.</a> Blood. 117, 5816-5826 (2011).</li><li>Lagadinou, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BCL-2+inhibition+targets+oxidative+phosphorylation+and+selectively+eradicates+quiescent+human+leukemia+stem+cells.">BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (3), 329-341 (2013).</li><li>Di Marcantonio, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Kinase+C+Epsilon+Is+a+Key+Regulator+of+Mitochondrial+Redox+Homeostasis+in+Acute+Myeloid+Leukemia.">Protein Kinase C Epsilon Is a Key Regulator of Mitochondrial Redox Homeostasis in Acute Myeloid Leukemia.</a> Clinical Cancer Research. 24 (3), 608-618 (2018).</li><li>Glasauer, A., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+antioxidants+for+cancer+therapy.">Targeting antioxidants for cancer therapy.</a> Biochemical Pharmacology. 92 (1), 90-101 (2014).</li><li>Krivtsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+from+committed+progenitor+to+leukaemia+stem+cell+initiated+by+MLL-AF9.">Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9.</a> Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).</li><li>Frascoli, M., Proietti, M., Grassi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+and+isolation+of+murine+hematopoietic+stem+cells+and+lineage-committed+progenitors.">Phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li><li>Lo Celso, C., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transplantation+of+hematopoietic+stem+cells+(HSCs).">Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs).</a> Journal of Visualized Experiments. (157), (2007).</li><li>Kalaitzidis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+complex+1+plays+critical+roles+in+hematopoiesis+and+Pten-loss-evoked+leukemogenesis.">mTOR complex 1 plays critical roles in hematopoiesis and Pten-loss-evoked leukemogenesis.</a> Cell Stem Cell. 11 (3), 429-439 (2012).</li><li>Sykes, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AKT/FOXO+signaling+enforces+reversible+differentiation+blockade+in+myeloid+leukemias.">AKT/FOXO signaling enforces reversible differentiation blockade in myeloid leukemias.</a> Cell. 146 (5), 697-708 (2011).</li><li>Kalaitzidis, D., Neel, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-cytometric+phosphoprotein+analysis+reveals+agonist+and+temporal+differences+in+responses+of+murine+hematopoietic+stem/progenitor+cells.">Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells.</a> PLoS One. 3 (11), 3776 (2008).</li><li>Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Yilmaz, O. H., Terhorst, C., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells.">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).</li><li>Mooney, C. J., Cunningham, A., Tsapogas, P., Toellner, K. M., Brown, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+expression+of+flt3+within+the+mouse+hematopoietic+stem+cell+compartment.">Selective expression of flt3 within the mouse hematopoietic stem cell compartment.</a> International Journal Molecular Sciences. 18 (5), (2017).</li><li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+markers+resolve+functional+distinct+sub-populations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors.">SLAM family markers resolve functional distinct sub-populations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li><li>Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+lymphohematopoietic+reconstitution+by+a+single+CD34-low/negative+hematopoietic+stem+cell.">Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.</a> Science. 273 (5272), 242-245 (1996).</li><li>Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+and+hierarchy+within+the+most+primitive+hematopoietic+stem+cell+compartment.">Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1178 (2010).</li><li>Mukhopadhyay, P., Rajesh, M., Hask&#243;, G., Hawkins, B. J., Madesh, M., Pacher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+apoptosis+and+mitochondrial+superoxide+production+in+live+cells+by+flow+cytometry+and+confocal+microscopy.">Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy.</a> Nature Protocols. 2 (9), 2295-2301 (2007).</li><li>Camargo, F. D., Chambers, S. M., Drew, E., McNagny, K. M., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+do+not+engraft+with+absolute+efficiencies.">Hematopoietic stem cells do not engraft with absolute efficiencies.</a> Blood. 107 (2), 501-507 (2006).</li><li>Morita, Y., Ema, H., Yamazaki, S., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-side-population+hematopoietic+stem+cells+in+mouse+bone+marrow.">Non-side-population hematopoietic stem cells in mouse bone marrow.</a> Blood. 108 (8), 2850-2856 (2006).</li><li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye-Independent+Methods+Reveal+Elevated+Mitochondrial+Mass+in+Hematopoietic+Stem+Cells.">Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li><li>Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-potential+compensation+reveals+mitochondrial+volume+expansion+during+HSC+commitment.">Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment.</a> Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).</li><li>Somervaille, T. C., Cleary, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+leukemia+stem+cells+in+murine+MLL-AF9+acute+myeloid+leukemia.">Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).</li><li>Hao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Imaging+Reveals+a+Unique+Preference+of+Symmetric+Cell+Division+and+Homing+of+Leukemia-Initiating+Cells+in+an+Endosteal+Niche.">Metabolic Imaging Reveals a Unique Preference of Symmetric Cell Division and Homing of Leukemia-Initiating Cells in an Endosteal Niche.</a> Cell Metabolism. 29 (4), 950-965 (2019).</li></ol>

ROSの検出のために開発されたフルオロゲン染料は、フローサイトメトリー22により顕微鏡検査または生細胞中の固定細胞において頻繁に評価される。ミトコンドリアROSフルオロゲン染料を用いてBM細胞内のミトコンドリアROSのフローサイトメトリック評価には2つの大きな利点があります:1)生細胞分析に適した高速かつ簡単な技術であり、2)希少な区別と分析を可能にします。...

活性酸素種(ROS)は、分子酸素由来の反応性の高い分子です。ROS産生の最も明確に定義された細胞位置はミトコンドリアであり、酸化リン酸化(OXPHOS)中に電子輸送鎖(ETC)を通過する電子が特定の形成につながる分子酸素によって吸収されるスーパーオキシド1と呼ばれるROSの種類。スーパーオキシドジスムターゼまたはSODと呼ばれる一連の酵素の作用を通じて、スーパーオキシドは過酸化水素に変換され、その後、カタレーゼやグルタチオンペルオキシダーゼ(GPX)などの酵素によって水に中和されます。ROS調節機構の摂動は、多くの場合、高分子損傷(すなわち、DNA、タンパク質、脂質)などの有害で潜在的に致命的な細胞の結果を有する酸化ストレスと呼ばれるROSの過剰産生につながる可能性があります。さらに、酸化ストレスは、糖尿病、炎症性疾患、老化および腫瘍2、3、4などのいくつかの病理に関連している。酸化ホオスタシスを維持し、酸化ストレスを防ぐために、細胞は様々なROS調節機構を有する5.
特定のROSの生理学的レベルは、適切な胚および成人のヘマトポエシス6に必要である。しかし、過剰なROSは、造来茎および前駆体プールのDNA損傷、細胞分化および枯渇に関連している。また、レドックス生物学の変化は、白血病と健康な細胞の間で異なる可能性があるという証拠もあります。例えば、ROSレベルは、彼らの健康な相手に対して急性骨髄性白血病(AML)細胞で高くなる傾向があり、他の研究は、白血病幹細胞が生存7、8のためにROSの低定常状態レベルを維持することを示唆している。重要なことに、これらの酸化還元の違いを治療的に活用するための戦略は、いくつかのヒト癌の設定9、10で約束を示している。したがって、マウスモデルにおけるROSレベルの評価を可能にするアッセイは、これらの種が細胞生理学および疾患病因にどのように寄与するかについての理解を改善し、潜在的に有効性を評価するためのプラットフォームを提供する可能性がある。新しいレドックスターゲティング抗癌療法。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1109px;" width="1110">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Heat inactivated FBS</td>
			<td style="width:279px;">VWR Seradigm LIFE SCIENCE</td>
			<td style="width:393px;">97068-085</td>
			<td style="width:191px;">Media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-20</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">15 mL conical tube</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">50 mL conical tube</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">40 &#956;m cell strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RBC Lysis Buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-112-9751</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Menadione sodium Bisulfite</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>M5750</td>
			<td>Pro-oxidant</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NAC</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>A7250</td>
			<td>Anti-oxidant</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100310</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">CD4 PE-Cy5 clone RM4-5</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>15-0041-81</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>15-0081-81</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">CD19 PE-Cy5 clone 6D5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115510</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103210</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108410</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116210</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD48 PE-Cy5 clone HM48-1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103420</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD117&#160; APC-Cy7 clone 2B8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105825</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sca1 peacific Blue clone D7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108120</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD150 APC clone TC15-12F12.2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115909</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD34 FITC clone RAM34</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553733</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD45.2 APC clone 104</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>1098313</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MitoSOX Red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M36008</td>
			<td>Dye</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mitotracker Green</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M7514</td>
			<td>Dye</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Live/dead Yellow Dye</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L34967</td>
			<td>Dye</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of mitochondrial reactive oxygen species in murine hematopoietic stem and progenitor cells and mll-af9 driven leukemia

健康なマウスとMLL-AF9によって駆動されるAMLを有するマウスから、様々な生きた骨髄(BM)由来の幹および前駆細胞集団におけるミトコンドリアROSを分析するためのフローサイトメトリックアプローチを提示する。具体的には、健康または白血病BM細胞がミトコンドリアスーパーオキシドを検出するフルオロゲン性色素で最初に染色され、続いて使用されるフルオロクロム結合モノクローナル抗体による染色を行う2段階の細胞染色プロセスについて説明します。様々な健康で悪性の前駆体集団を区別する。また、フローサイトメトリーによるサンプルの取得と分析に関する戦略も提供しています。プロトコル全体は、3-4時間の短い時間枠で行うことができます。我々はまた、フローサイトメトリーによるフルオロゲン染料を用いた生造血および白血病の幹および前駆体のミトコンドリアコンパートメントにおけるROS産生のモニタリングの利点と限界を考慮すべき重要な変数を強調する。.さらに、ミトコンドリアROSの豊富さが、明確な健康なHSPCサブ集団と白血病前駆体の間で変化するデータを提示し、血液学的研究におけるこの技術の可能な応用について議論する。

提示されたのは、複数の健康およびMLL-AF9発現白血病前駆体のミトコンドリアにおけるROSを分析する方法である。図 1は、4 つの主要なステップで構成されるプロトコル ワークフローの概略図を示します: 1) マウスからの BM 分離;2)ミトコンドリアROS、特にスーパーオキシドを認識するフッ素色素でBM細胞を染色する。3)様々な健康および白血病血化集団を線引きする表面マ...

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Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

急性骨髄性白血病(AML)のマウスモデルから、マウスの健康な造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)におけるミトコンドリア活性酸素種(ROS)を検出するために多パラメータフローサイトメトリーを用いる方法について説明する。MLL-AF9.

マウス造血幹細胞および前駆細胞およびMLL-AF9駆動白血病におけるミトコンドリア活性酸素種のフローサイトメトリック解析

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

活性酸素種またはROSは、細胞によって産生される活性酸素種であり、その行動に影響を与える。過剰なROSはまた、広範囲にわたる細胞大混乱を引き起こす可能性がありますが、重症例では、細胞死。したがって、ROS恒常性の維持は、細胞機能および生存にとって基本的に重要である。ここで提示されるプロトコルは、ミトコンドリアによって生成される特定のタイプのROSの測定に焦点を当てています, 主に生きている、正常な、または健康な造血幹細胞および前駆細胞集団の代謝副産物として, ならびに血液癌のマウスモデルからの白血病細胞で, 急性骨髄性白血病またはAML.このプロトコルは、遺伝子欠失や過剰発現などの遺伝子操作が、いくつかの健康で悪性造血集団におけるミトコンドリアROSにどのような影響を与えるかを評価するためにも使用できます。その結果、リダックス状態と細胞の代謝に関する洞察に満ちた情報を提供する可能性があります。この技術は、原性プローブのフロー決済メトリック分析を承認し、生きている健康で悪性造血性茎および前駆体亜集団におけるミトコンドリアROS産生を監視する。このプロトコルは簡単で、数時間で完了できます。さらに、生細胞分析に適しており、染色の表面マークを使用して、骨髄中の幹細胞集団におけるミトコンドリアROSを区別し、分析することができます。原稿によると、野生のタイトマウスおよび白血病MLL-AF9マウスから単核骨髄細胞を採取した後、9つの単色制御チューブのそれぞれに細胞懸濁液の200マイクロリットルをアリコートした。残りの細胞を他の実験管にアリコートし、それぞれ200マイクロリットルを含む。次に、それぞれ骨髄細胞と白血病細胞を含む2つの実験チューブと1つのコントロールチューブを遠心分離機に入れる。5分間Gの300倍で遠心分離機。次に、上清をデカントし、メーカーの指示に従って、生きている/死んだ細胞染色で室温F-PBSの細胞を再中断します。氷の上で30分間インキュベートします。その後、3本の生きた染色チューブに室温F-PBSを1ミリリットル加え、ミトコンドリアROS染料染色用の単色制御チューブを1本加えます。チューブを室温で5分間Gの300倍の遠心分離機に入れます。次いで、50マイクログラムのミトコンドリアROS染料をDMSOの13マイクロリットルに再懸濁させることにより、5ミリモルミトコンドリアROS染料のストック溶液を得る。その後、13マイクロリットルミトコンドリアROS染料に室温F-PBSの13ミリリットルを加え、5マイクロモルの最終濃度に希釈します。必要に応じて、ミトコンドリア流出ポンプを阻害する溶液に50ミリモルベラパミルの13マイクロリットルを加えます。遠心分離機からチューブを入手し、生きた/死んだ細胞染色の洗浄を吸引します。ライブ/デッド染色制御に200マイクロリットルのF-PBSを加え、分析を開始する準備ができるまで氷の中に保管します。ベラパミルを含むミトコンドリアROS色素染色剤200マイクロリットルを各実験チューブ、ならびにミトコンドリアROS染色制御チューブに加える。渦は、暗闇の中で摂氏37度で10分間混合してインキュベートします。次に、1ミリリットルの室温F-PBSを制御チューブおよび実験管に加えます。遠心分離機は室温で300倍Gで5分間。スーパーナテントを吸引し、室温F-PBSの追加1ミリリットルで細胞を洗います。室温で300倍Gで5分間再び遠心分離機。まず、健康な骨髄細胞と白血病の骨髄細胞に対して2つの抗体カクテルを調製する。健康な骨髄細胞を含む実験管から上澄み物を吸引し、200マイクロリットルの抗体カクテル1をチューブに加えた。混ぜる渦。また、F-PBSの200マイクロリットルと対応する抗体の1マイクロリットルを加えることによって単色制御チューブを調製する。暗闇の中で氷の上で60分間インキュベートします。白血病骨髄を含む実験管から上澄を吸引し、抗体カクテル2の200マイクロリットルを加え、チューブに加える。混ぜる渦。暗闇の中で氷の上で60分間インキュベートします。その後、冷たいF-PBSと遠心分離機を1ミリリットルで全管を室温で300倍Gで5分間洗浄します。500マイクロリットルの冷たいF-PBSで細胞を再懸濁する。細胞懸濁液を、凝集体を除外するための40マイクロメートルフィルターを用いて、各フローサイトメーターチューブに移します。まず、フローサイトメトリーマシンに染色制御チューブを挿入し、取得を開始してフローサイトメトリーマシンを補償します。他のコントロールチューブについても繰り返します。その後、ゲートを設定するために実験管を読みます。細胞集団のサイズと複雑さを分析するには、まず健康な HSPC の場合、前方散乱領域と側面散乱領域をプロットする母集団を設定します。正方形のゲートボタンを押して、前方および側面の散布図から余分な破片をゲートアウトします。次に、前方散乱領域と高さプロットで、二重識別子を使用してダブレットをゲートアウトします。生細胞、系統低細胞、および様々な健康なHSPCを選択します。対象の各集団について、ヒスタグラムプロットにおけるTRPEチャネルの蛍光強度の中央値を分析し、ミトコンドリアROSシグナルの差を評価する。白血病集団のサイズ分析、格子、ヒストグラムプロットの同じ手順を繰り返します。健康なマウスから分離された骨髄細胞は、生きた/死んだ色素とミトコンドリアROS色素で染色され、その後、CD48、C-kit、Sca-1、CD34およびCD150を認識する抗体で染色された。また、白血病マウス由来の骨髄細胞もCD45.2で染色し、CD45.1で染色された健常レシピ骨髄細胞からMLL-AF9白血病細胞を判別した。健康なCD48陰性LSKと骨髄性前駆腫との間のミトコンドリアROS染色の比較は、骨髄性前駆腫がミトコンドリアROS染色の有意に高いレベルを示すことを示している。さらに、c-Kit高白血病前駆物質は、c-Kit中間低白血病細胞、健康CD48陰性LSKおよび骨髄性前駆細胞と比較して、ミトコンドリアROS染色の有意に高いレベルを表示する。Cキット中間低白血病細胞は、また、CD48陰性LSK細胞と比較して有意に高い値を示したが、骨髄性前駆細胞には表示されなかった。ミトコンドリアROS染料は反応性が高く、次の手順を開始する前に色素の過剰を除去するために適切な洗浄工程が必要です。このプロトコルで使用できる化学的に異なるROS蛍光色素染料がいくつかあり、生造血細胞におけるredux状態の知識を少し得る。この技術は、文献で広く使用されており、正常な対応と比較した場合、白血病細胞で差有分調節される代謝およびシグナル伝達経路に関する有用な洞察を提供する可能性がある。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

マウスC1498細胞株およびその関連白血病マウスモデルを特徴付けるための詳細なプロトコル

The intravenous injection of C1498 cells into syngeneic or congenic mice has been performed since 1941. These injections result in the development of ...

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

サンプルおよび測定可能な残存病変と急性骨髄性白血病の白血病幹細胞を測定するプロセス骨髄に対する包括的なプロトコル

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

フローサイトメトリーを診断とフォローで主に急性骨髄性白血病、白血病幹細胞患者由来異種での見積もりに

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation

慢性リンパ性白血病の免疫グロブリン遺伝子のシーケンス解析: シーケンスの解釈に患者材料から

During B cell maturation, the complex process of immunoglobulin (IG) gene V(D)J recombination coupled with somatic hypermutation (SHM) gives rise to a ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

主な白血病細胞の代謝プロファイルの評価

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

アポトーシス反転後新しく形成された乳癌幹細胞様細胞の流れフローサイトメトリー法による検出

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

変異体メラノサイト幹細胞からのマウス黒色腫開始の空間的および時間的制御

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

大腸癌細胞の3次元スフェロイド培養におけるプロバイオティクスの細胞遊離上清を用いた細胞死の評価

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

急性骨髄性白血病におけるバルク亜集団と幹細胞を区別するNKG2Dリガンド表面検出の2つのフローサイトメトリックアプローチ

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Flow Cytometric Analysis of Apoptotic Biomarkers in Actinomycin D-Treated SiHa Cervical Cancer Cells

アクチノマイシンD処理SiHa子宮頸癌細胞におけるアポトーシスバイオマーカーのフローサイトメトリー解析

Apoptosis biomarkers were investigated in actinomycin D-treated SiHa cervical cancer cells using a benchtop flow cytometer. Early biomarkers (Annexin V ...