Name: flow cytometric analysis of mitochondrial reactive oxygen species in murine hematopoietic stem and progenitor cells and mll-af9 driven leukemia
Uploaded: 2019-09-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia at JoVE.com

이 작품은 폭스 체이스 암 센터 이사회 (DDM), 혈액학 학자 상 (SMS), 미국 암 학회 RSG (SMS) 및 국방부 (수상 번호: W81XWH-18-1-0472)에 의해 지원되었다.

이 프로토콜에 설명된 모든 동물 절차는 폭스 체이스 암 센터의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
참고: 프로토콜 워크플로는 그림 1에 나와 있는 대로 4부분으로 나뉘며 필요한 시약은 재료 표에나열되어 있습니다.
1. 골수 (BM) 격리
참고: MLL-AF9 백...

<ol>
	<li>Dr&#246;se, S., Brandt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+superoxide+production+by+the+mitochondrial+respiratory+chain.">Molecular mechanisms of superoxide production by the mitochondrial respiratory chain.</a> Advances in experimental medicine and biology. 748, 145-169 (2012).</li><li>Gerber, P. A., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Oxidative+Stress+and+Hypoxia+in+Pancreatic+Beta-Cell+Dysfunction+in+Diabetes+Mellitus.">The Role of Oxidative Stress and Hypoxia in Pancreatic Beta-Cell Dysfunction in Diabetes Mellitus.</a> Antioxidant &amp; Redox Signaling. 26 (10), 501-518 (2017).</li><li>H&#246;hn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Happily+(n)ever+after:+Aging+in+the+context+of+oxidative+stress,+proteostasis+loss+and+cellular+senescence.">Happily (n)ever after: Aging in the context of oxidative stress, proteostasis loss and cellular senescence.</a> Redox Biology. 11, 482-501 (2017).</li><li>Reuter, S., Gupta, S. C., Chaturvedi, M. M., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress,+inflammation,+and+cancer:+how+are+they+linked.">Oxidative stress, inflammation, and cancer: how are they linked.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 49 (11), 1603-1616 (2010).</li><li>Lee, B. W. L., Ghode, P., Ong, D. S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+regulation+of+cell+state+and+fate.">Redox regulation of cell state and fate.</a> Redox Biology. 2213-2317 (18), 30899 (2018).</li><li>Harris, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+metabolism+impacts+the+spatiotemporal+onset+and+magnitude+of+HSC+induction+in+vivo.">Glucose metabolism impacts the spatiotemporal onset and magnitude of HSC induction in vivo.</a> Blood. 121, 2483-2493 (2013).</li><li>Hole, P. S., Darley, R. L., Tonks, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+reactive+oxygen+species+play+a+role+in+myeloid+leukemias.">Do reactive oxygen species play a role in myeloid leukemias.</a> Blood. 117, 5816-5826 (2011).</li><li>Lagadinou, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BCL-2+inhibition+targets+oxidative+phosphorylation+and+selectively+eradicates+quiescent+human+leukemia+stem+cells.">BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (3), 329-341 (2013).</li><li>Di Marcantonio, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Kinase+C+Epsilon+Is+a+Key+Regulator+of+Mitochondrial+Redox+Homeostasis+in+Acute+Myeloid+Leukemia.">Protein Kinase C Epsilon Is a Key Regulator of Mitochondrial Redox Homeostasis in Acute Myeloid Leukemia.</a> Clinical Cancer Research. 24 (3), 608-618 (2018).</li><li>Glasauer, A., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+antioxidants+for+cancer+therapy.">Targeting antioxidants for cancer therapy.</a> Biochemical Pharmacology. 92 (1), 90-101 (2014).</li><li>Krivtsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+from+committed+progenitor+to+leukaemia+stem+cell+initiated+by+MLL-AF9.">Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9.</a> Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).</li><li>Frascoli, M., Proietti, M., Grassi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+and+isolation+of+murine+hematopoietic+stem+cells+and+lineage-committed+progenitors.">Phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li><li>Lo Celso, C., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transplantation+of+hematopoietic+stem+cells+(HSCs).">Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs).</a> Journal of Visualized Experiments. (157), (2007).</li><li>Kalaitzidis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+complex+1+plays+critical+roles+in+hematopoiesis+and+Pten-loss-evoked+leukemogenesis.">mTOR complex 1 plays critical roles in hematopoiesis and Pten-loss-evoked leukemogenesis.</a> Cell Stem Cell. 11 (3), 429-439 (2012).</li><li>Sykes, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AKT/FOXO+signaling+enforces+reversible+differentiation+blockade+in+myeloid+leukemias.">AKT/FOXO signaling enforces reversible differentiation blockade in myeloid leukemias.</a> Cell. 146 (5), 697-708 (2011).</li><li>Kalaitzidis, D., Neel, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-cytometric+phosphoprotein+analysis+reveals+agonist+and+temporal+differences+in+responses+of+murine+hematopoietic+stem/progenitor+cells.">Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells.</a> PLoS One. 3 (11), 3776 (2008).</li><li>Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Yilmaz, O. H., Terhorst, C., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells.">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).</li><li>Mooney, C. J., Cunningham, A., Tsapogas, P., Toellner, K. M., Brown, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+expression+of+flt3+within+the+mouse+hematopoietic+stem+cell+compartment.">Selective expression of flt3 within the mouse hematopoietic stem cell compartment.</a> International Journal Molecular Sciences. 18 (5), (2017).</li><li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+markers+resolve+functional+distinct+sub-populations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors.">SLAM family markers resolve functional distinct sub-populations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li><li>Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+lymphohematopoietic+reconstitution+by+a+single+CD34-low/negative+hematopoietic+stem+cell.">Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.</a> Science. 273 (5272), 242-245 (1996).</li><li>Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+and+hierarchy+within+the+most+primitive+hematopoietic+stem+cell+compartment.">Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1178 (2010).</li><li>Mukhopadhyay, P., Rajesh, M., Hask&#243;, G., Hawkins, B. J., Madesh, M., Pacher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+apoptosis+and+mitochondrial+superoxide+production+in+live+cells+by+flow+cytometry+and+confocal+microscopy.">Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy.</a> Nature Protocols. 2 (9), 2295-2301 (2007).</li><li>Camargo, F. D., Chambers, S. M., Drew, E., McNagny, K. M., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+do+not+engraft+with+absolute+efficiencies.">Hematopoietic stem cells do not engraft with absolute efficiencies.</a> Blood. 107 (2), 501-507 (2006).</li><li>Morita, Y., Ema, H., Yamazaki, S., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-side-population+hematopoietic+stem+cells+in+mouse+bone+marrow.">Non-side-population hematopoietic stem cells in mouse bone marrow.</a> Blood. 108 (8), 2850-2856 (2006).</li><li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye-Independent+Methods+Reveal+Elevated+Mitochondrial+Mass+in+Hematopoietic+Stem+Cells.">Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li><li>Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-potential+compensation+reveals+mitochondrial+volume+expansion+during+HSC+commitment.">Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment.</a> Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).</li><li>Somervaille, T. C., Cleary, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+leukemia+stem+cells+in+murine+MLL-AF9+acute+myeloid+leukemia.">Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).</li><li>Hao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Imaging+Reveals+a+Unique+Preference+of+Symmetric+Cell+Division+and+Homing+of+Leukemia-Initiating+Cells+in+an+Endosteal+Niche.">Metabolic Imaging Reveals a Unique Preference of Symmetric Cell Division and Homing of Leukemia-Initiating Cells in an Endosteal Niche.</a> Cell Metabolism. 29 (4), 950-965 (2019).</li></ol>

ROS의 검출을 위해 개발된 형광 염료는 현미경 검사법또는 살아있는 세포에서 유세포분석법22에의해 고정된 세포에서 자주 평가된다. 미토콘드리아 ROS 형광 염료를 사용하여 BM 세포에서 미토콘드리아 ROS의 유세포측정 평가는 두 가지 주요 장점을 가지고 있습니다: 1) 살아있는 세포 분석에 적합한 빠르고 간단한 기술이며 2) 희귀를 구별하고 분석할 수 있습니다. 표면 마커 염색?...

반응성 산소 종 (ROS)은 분자 산소에서 파생 된 반응성이 높은 분자입니다. ROS 생산의 가장 잘 정의 된 세포 위치는 미토 콘 드리 아, 어디 전자 수송 사슬을 통해 통과 하는 전자 (ETC) 산화 인 산화 동안 (OXPHOS) 특정의 형성으로 이어지는 분자 산소에 의해 흡수 수퍼 옥사이드1이라고불리는 ROS의 유형 . 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 또는 SOD라고 하는 일련의 효소의 활동을 통해, 수퍼옥사이드는 과산화수소로 변환되며, 이 수소는 카탈라제 또는 글루타티온 과산화효소(GPX)와 같은 효소에 의해 물로 중화됩니다. ROS 조절 메커니즘의 교란은 종종 산화 스트레스라고도 하는 ROS의 과잉 생산으로 이어질 수 있으며, 이는 거대 분자 손상 (즉, DNA, 단백질, 지질)과 같은 유해하고 잠재적으로 치명적인 세포 결과를 가지고 있습니다. 더욱이, 산화 스트레스는 당뇨병, 염증성 질환, 노화 및 종양2,3,4와같은 여러 병리와 관련이 있다. 항상성을 유지하고 산화 스트레스를 방지하기 위해 세포는 다양한 ROS 조절 메커니즘을 가지고5.
특정 ROS의 생리수준은 적절한 배아 및 성인 조혈에 필요하다6. 그러나, 과잉 ROS는 조혈 줄기 및 전구 풀의 DNA 손상, 세포 분화 및 고갈과 관련이 있다. 또한 레독스 생물학에 있는 변경백혈병과 건강한 세포 사이에서 다를 수 있다는 기록이 있습니다. 예를 들어, ROS 수준은 그들의 건강한 대조물의 대조와 다른 연구에 비해 급성 골수성 백혈병 (AML) 세포에서 더 높은 경향이 백혈병 줄기 세포생존을 위한 ROS의 낮은 정상 상태 수준을 유지한다는 것을건의했습니다 7,8. 중요한 것은, 이러한 산화물의 차이를 치료적으로 활용하기 위한 전략은 몇몇 인간적인 암 조정9,10에서약속을 보여주었습니다. 그러므로, 마우스 모형에 있는 ROS 수준의 평가를 허용하는 분석제는 이 종이 세포 생리학 및 질병 병인에 어떻게 기여하는지의 우리의 이해를 향상할 수 있을 뿐만 아니라 잠재적으로 의 효과를 평가하기 위한 발판을 제공할 수 있습니다 새로운 레독스 표적 항암 치료.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1109px;" width="1110">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Heat inactivated FBS</td>
			<td style="width:279px;">VWR Seradigm LIFE SCIENCE</td>
			<td style="width:393px;">97068-085</td>
			<td style="width:191px;">Media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-20</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">15 mL conical tube</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">50 mL conical tube</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">40 &#956;m cell strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RBC Lysis Buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-112-9751</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Menadione sodium Bisulfite</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>M5750</td>
			<td>Pro-oxidant</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NAC</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>A7250</td>
			<td>Anti-oxidant</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100310</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">CD4 PE-Cy5 clone RM4-5</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>15-0041-81</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>15-0081-81</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">CD19 PE-Cy5 clone 6D5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115510</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103210</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108410</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116210</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD48 PE-Cy5 clone HM48-1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103420</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD117&#160; APC-Cy7 clone 2B8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105825</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sca1 peacific Blue clone D7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108120</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD150 APC clone TC15-12F12.2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115909</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD34 FITC clone RAM34</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553733</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD45.2 APC clone 104</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>1098313</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MitoSOX Red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M36008</td>
			<td>Dye</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mitotracker Green</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M7514</td>
			<td>Dye</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Live/dead Yellow Dye</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L34967</td>
			<td>Dye</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of mitochondrial reactive oxygen species in murine hematopoietic stem and progenitor cells and mll-af9 driven leukemia

우리는 MLL-AF9에 의해 구동되는 AML을 가진 마우스뿐만 아니라 건강한 마우스에서 다양한 살아있는 골수 (BM) 파생된 줄기 및 전구 세포 인구에 있는 미토콘드리아 ROS를 분석하기 위한 교류 세포 측정 접근을 제시합니다. 구체적으로, 우리는 건강한 또는 백혈병 BM 세포가 미토콘드리아 과산화물을 검출하는 형광성 염료로 먼저 염색되고, 그 다음에 사용되는 불소크롬 연결된 단클론 항체로 염색하는 2 단계 세포 염색 과정을 기술합니다. 다양한 건강하고 악성 조혈 선조 집단을 구별합니다. 우리는 또한 유세포분석에 의한 시료를 획득하고 분석하기 위한 전략을 제공합니다. 전체 프로토콜은 3-4 시간만큼 짧은 시간 내에 수행 될 수있다. 우리는 또한 살아있는 조혈 및 백혈병 줄기 및 전구 소집단의 미토콘드리아 구획에서 ROS 생산을 모니터링하는 장점과 한계뿐만 아니라 유세포 측정에 의한 형광 염료를 사용하여 고려해야 할 주요 변수를 강조합니다. . 게다가, 우리는 미토콘드리아 ROS 풍부가 명백한 건강한 HSPC 하위 인구 및 백혈병 전구체 사이에서 변화한다는 것을 데이터를 제출하고 혈액학 연구에서 이 기술의 가능한 응용을 토론합니다.

제시된 것은 다중 건강 및 MLL-AF9 발현 백혈병 전구 집단의 미토콘드리아에서 ROS를 분석하는 방법이다. 그림 1은 4개의 주요 단계로 구성된 프로토콜 워크플로우의 개략적 보기를 표시합니다: 1) 마우스로부터의 BM 격리; 2) 미토콘드리아 ROS, 특히 과산화물을 인식하는 형광성 염료로 BM 세포를 염색하는 단계; 3) 다양한 건강 및 백혈병 조혈 인구를 묘사하기 위해 표면 마커 항체...

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Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

우리는 급성 골수성 백혈병 (AML)의 마우스 모델에서 뮤린 건강한 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC) 및 백혈병 세포에서 미토콘드리아 반응성 산소 종 (ROS)을 검출하기 위해 다매개 변수 흐름 세포측정법을 사용하는 방법을 설명합니다. MLL-AF9.

뮤린 조혈 줄기 및 선조 세포 및 MLL-AF9 구동 백혈병에서 미토콘드리아 반응성 산소 종의 유동 세포 분석

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

반응성 산소 종 또는 ROS는 세포에 의해 생성되는 매우 반응성 산소 종이며, 그들의 행동에 영향을 미칩니다. 과잉 ROS는 또한 광범위 한 세포 혼란을 일으킬 수 있습니다 하지만, 그리고 심한 경우에, 세포 죽음. 따라서, ROS 항상성의 유지는 세포 기능 및 생존에 근본적으로 중요합니다.여기에 제시된 프로토콜은, 미토콘드리아에 의해 생성되는 특정 유형의 ROS를 측정하는 데 초점을 맞추고 있으며, 주로 살아있는, 정상 또는 건강한 조혈 줄기 및 전구 세포 집단뿐만 아니라 혈액암, 급성 골수성 백혈병 또는 AML의 마우스 모델에서 백혈병 세포에서 대사 부산물로 서 발생합니다. 이 프로토콜은 또한 유전자 삭제 또는 과발현과 같은 유전 조작이 몇몇 건강하고 악성 조혈 인구에 있는 미토콘드리아 ROS에 어떻게 영향을 미치는지 평가하기 위하여 이용될 수 있습니다. 그리고 결과적으로, 잠재적으로 레두 상태 와 아마도 세포의 물질 대사에 대 한 통찰력 있는 정보를 제공.이 기술은 살아있는 건강하고 악성 조혈 줄기 및 선조 하위 인구에서 미토콘드리아 ROS 생산을 모니터링하기 위해 프로토겐 프로브의 흐름 정착 메트릭 분석을 승인합니다. 이 프로토콜은 간단하며 몇 시간 안에 완료할 수 있습니다. 더욱이, 살아있는 세포 분석에 적합하며, 골수의 줄기 세포 집단에서 미토콘드리아 로스를 구별하고 분석할 수 있으며, 얼룩의 표면 마크를 이용하여.원고에 따르면 야생 단단한 마우스및 백혈병 MLL-AF9 마우스로부터 단핵 골수 세포를 수집한 후, 9개의 단일 색 대조구 각각에 세포 현탁액의 200 마이크로리터를 알리쿼트. 다른 실험 관에 나머지 세포를 알리쿼트, 각각 200 마이크로 리터. 그런 다음 골수 세포와 백혈구를 각각 포함하는 원심분리기 2개의 실험관및 1개의 대조군 관으로 놓습니다.원심분리기는 5분간 300배 G로 합니다. 다음으로, 제조 자의 지시에 따라, 상체를 데칭하고, 라이브 / 죽은 세포 얼룩으로 실온 F-PBS에서 세포를 다시 중단합니다. 얼음에 30분 간 배양하세요.그 후, 3개의 라이브/데드 스테인드 튜브에 실온 F-PBS 1밀리리터를 추가하고, 미토콘드리아 ROS 염색을 위한 단일 컬러 제어 튜브를 추가합니다. 튜브를 원심분리기에 300배 G로 넣고 실온에서 5분간 넣습니다. 그런 다음, DMSO의 13 마이크로리터에서 미토콘드리아 ROS 염료 50 마이크로그램을 다시 일시 중단하여 5 밀리미터 미토콘드리아 ROS 염료 스톡 용액을 획득한다.그런 다음 13 마이크로 리터 미토콘드리아 ROS 염료에 실온 F-PBS 13 밀리리터를 추가하여 5 마이크로 몰러의 최종 농도로 희석합니다. 필요한 경우 미토콘드리아 efflux 펌프를 억제하기 위해 50 밀리머 베라파밀13마이크로리터를 솔루션에 추가합니다. 원심분리기에서 튜브를 얻고 살아있는 / 죽은 세포 얼룩의 세척을 흡인.라이브/데드 스테닝 컨트롤에 F-PBS 200 마이크로리터를 추가하고 분석을 시작할 준비가 될 때까지 얼음에 보관하십시오. 베라파밀을 함유한 미토콘드리아 ROS 염료 얼룩 200개, 각 실험 튜브, 미토콘드리아 ROS 염색 제어 튜브에 첨가한다. 소용돌이는 어둠 속에서 섭씨 37도에서 10 분 동안 혼합하고 배양합니다.그런 다음 제어 및 실험 튜브에 실온 F-PBS 1 밀리리터를 추가합니다. 원심 분리기는 실온에서 300배 G로 5분 거리에 있습니다. 슈퍼나텐트를 흡습하고 실온 F-PBS1밀리리터로 셀을 세척합니다.원심분리기는 실온에서 300배 G에서 5분간 다시 원심분리기를 사용할 수 있습니다. 첫째, 건강하고 백혈병 골수 세포를 위한 2개의 항체 칵테일을 준비합니다. 건강한 골수 세포를 포함하는 실험 관으로부터 상체를 흡인하고, 항체 칵테일 번호 1의 마이크로리터 를 튜브에 첨가한다.혼합 소용돌이. 또한 F-PBS의 200 마이크로리터와 해당 항체의 1개의 마이크로리터를 추가하여 단일 색 제어 관을 준비한다. 어둠 속에서 얼음에 60 분 동안 배양.백혈병 골수를 포함하는 실험관에서 초신자를 흡인시키고, 항체 칵테일 번호 2의 마이크로리터 200을 튜브에 추가합니다. 혼합 소용돌이. 어둠 속에서 얼음에 60 분 동안 배양.그 후, 모든 튜브를 차가운 F-PBS와 원심분리기 1밀리리터로 실온에서 300배 G로 5분간 세척합니다. 감기 F-PBS의 500 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단합니다. 체온을 제외하기 위한 40 마이크로미터 필터로 각 유량 사이토미터 튜브로 세포 현탁액을 전달합니다.먼저, 유동 세포측정기에 얼룩 제어 튜브를 하나 도 삽입하고 유동 세포측정기의 보정을 위해 인수를 시작한다. 다른 제어 튜브에 대해 반복합니다. 그 후, 게이트를 설정하는 실험 튜브를 읽어보십시오.세포 집단의 크기와 복잡성을 분석하기 위해 먼저 건강한 HSPC를 위해 전방 분산 영역과 측면 분산 영역 플롯 인구를 설정합니다. 스퀘어 게이트 버튼을 눌러 전방 및 측면 흩어진 플롯에서 불필요한 잔해를 문밖으로 내보세요. 그런 다음 전방 분산 영역과 높이 플롯에서 이중 차별을 사용하여 더블 을 게이트합니다.라이브 셀, 계보 낮은 세포 및 다양한 건강한 HSPC를 선택합니다. 관심의 각 인구에 대해, 히스타그램 플롯에서 TRPE 채널의 중간 형광 강도를 분석하여 미토콘드리아 ROS 신호의 차이를 평가한다. 백혈병 인구를 위한 크기 분석, 게이팅 및 히스토그램 플롯의 동일한 절차를 반복합니다.건강한 마우스로부터 분리된 골수 세포는 살아있는/죽은 염료및 미토콘드리아 ROS 염료로 염색되었고, 이어서 계보 마커를 인식하는 항체로 염색하였다: 플러스 CD48, C 키트, Sca-1, CD34 및 CD150. 또한, 백혈병 마우스로부터의 골수 세포는 또한 CD45.1로 염색된 건강한 수령인 골수 세포로부터 MLL-AF9 백혈병 세포를 구별하기 위해 CD45.2로 염색되었다. 건강한 CD48 네거티브 LSK와 골로이드 전구사이의 미토콘드리아 ROS 염색을 비교하면 골수성 전구가 미토콘드리아 ROS 염색 수준이 상당히 높은 것으로 나타났습니다.더욱이, c-Kit 높은 백혈병 전구는 c-Kit 중간 낮은 백혈병 세포, 건강한 CD48 음성 LSK 및 골로이드 전조제에 비해 미토콘드리아 ROS 염색의 상당히 높은 수준을 표시합니다. C-Kit 중간 낮은 백혈병 세포, 또한 CD48 음성 LSK 세포에 비해 상당히 높은 값을 표시, 하지만 골수성 전조에. 미토콘드리아 ROS 염료는 반응성이 매우 높으며 다음 단계를 시작하기 전에 염료의 과잉이 제거되었는지 확인하기 위해 적절한 세척 단계가 필요합니다.살아있는 조혈 세포에서 redux 상태의 지식의 비트를 달성하기 위해,이 프로토콜에 사용할 수있는 몇 가지 화학적으로 뚜렷한 ROS 불소 염료가 있습니다. 이 기술은 문학에서 광범위하게 사용되었으며, 정상 대응과 비교하면 백혈병 세포에서 분화되는 대사 및 신호 경로에 대한 유용한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

쥐 C1498 세포주와 관련 백혈병 마우스 모델을 특성화에 대한 자세한 프로토콜

The intravenous injection of C1498 cells into syngeneic or congenic mice has been performed since 1941. These injections result in the development of ...

연구

암 연구학

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

샘플을 측정 하는 측정 가능한 잔여 질환과 급성 골수성 백혈병에 Leukemic 줄기 세포에 대 한 프로세스 골 포괄적인 프로토콜

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Flow Cytometry 최대 백혈병 줄기 세포 주 급성 골수성 백혈병 및 환자-파생-xenografts, 진단에 따라 추정 하

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation

만성 림프모구 백혈병에서 면역 글로불린 유전자 순서 분석: 시퀀스 해석 환자 자료에서

During B cell maturation, the complex process of immunoglobulin (IG) gene V(D)J recombination coupled with somatic hypermutation (SHM) gives rise to a ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

기본 백혈병 세포의 신진 대사 프로필의 평가

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

새로 형성 된 유방암 줄기 세포와 같은 세포 Apoptosis 반전 후 흐름 Cytometric 감지

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

돌연변이 멜 뮤 린 줄기 세포에서 시작 하는의 공간적 및 시간적 제어

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

대장암세포의 3차원 스페로이드 배양에서 프로바이오틱스의 세포없는 슈퍼네탄을 사용하여 세포 사멸 평가

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

급성 골수성 백혈병의 대량 하위 집단으로부터 줄기 세포를 구별하기 위해 NKG2D 리간드 표면 검출의 두 개의 흐름 세포 측정 접근법

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Flow Cytometric Analysis of Apoptotic Biomarkers in Actinomycin D-Treated SiHa Cervical Cancer Cells

Actinomycin D-Treated SiHa 자궁경부암 세포에서 세포사멸 바이오마커의 유세포 분석

Apoptosis biomarkers were investigated in actinomycin D-treated SiHa cervical cancer cells using a benchtop flow cytometer. Early biomarkers (Annexin V ...