Name: flow cytometric analysis of mitochondrial reactive oxygen species in murine hematopoietic stem and progenitor cells and mll-af9 driven leukemia
Uploaded: 2019-09-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av The Fox Chase Cancer Center styret (DDM), American Society of hematologi Scholar Award (SMS), American Cancer Society RSG (SMS) og Department of Defense (Award #: W81XWH-18-1-0472).

Alle dyr prosedyrene beskrevet i denne protokollen har blitt godkjent av institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) ved Fox Chase Cancer Center.
Merk: Protokollen arbeidsflyten er delt inn i 4 deler som presenteres i figur 1 og de nødvendige reagensene er oppført i tabellen av materialer.
1. benmarg (BM) isolasjon
Merk: MLL-AF9 leukemi mus ble gener...

<ol>
	<li>Dr&#246;se, S., Brandt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+superoxide+production+by+the+mitochondrial+respiratory+chain.">Molecular mechanisms of superoxide production by the mitochondrial respiratory chain.</a> Advances in experimental medicine and biology. 748, 145-169 (2012).</li><li>Gerber, P. A., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Oxidative+Stress+and+Hypoxia+in+Pancreatic+Beta-Cell+Dysfunction+in+Diabetes+Mellitus.">The Role of Oxidative Stress and Hypoxia in Pancreatic Beta-Cell Dysfunction in Diabetes Mellitus.</a> Antioxidant &amp; Redox Signaling. 26 (10), 501-518 (2017).</li><li>H&#246;hn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Happily+(n)ever+after:+Aging+in+the+context+of+oxidative+stress,+proteostasis+loss+and+cellular+senescence.">Happily (n)ever after: Aging in the context of oxidative stress, proteostasis loss and cellular senescence.</a> Redox Biology. 11, 482-501 (2017).</li><li>Reuter, S., Gupta, S. C., Chaturvedi, M. M., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress,+inflammation,+and+cancer:+how+are+they+linked.">Oxidative stress, inflammation, and cancer: how are they linked.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 49 (11), 1603-1616 (2010).</li><li>Lee, B. W. L., Ghode, P., Ong, D. S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+regulation+of+cell+state+and+fate.">Redox regulation of cell state and fate.</a> Redox Biology. 2213-2317 (18), 30899 (2018).</li><li>Harris, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+metabolism+impacts+the+spatiotemporal+onset+and+magnitude+of+HSC+induction+in+vivo.">Glucose metabolism impacts the spatiotemporal onset and magnitude of HSC induction in vivo.</a> Blood. 121, 2483-2493 (2013).</li><li>Hole, P. S., Darley, R. L., Tonks, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+reactive+oxygen+species+play+a+role+in+myeloid+leukemias.">Do reactive oxygen species play a role in myeloid leukemias.</a> Blood. 117, 5816-5826 (2011).</li><li>Lagadinou, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BCL-2+inhibition+targets+oxidative+phosphorylation+and+selectively+eradicates+quiescent+human+leukemia+stem+cells.">BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (3), 329-341 (2013).</li><li>Di Marcantonio, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Kinase+C+Epsilon+Is+a+Key+Regulator+of+Mitochondrial+Redox+Homeostasis+in+Acute+Myeloid+Leukemia.">Protein Kinase C Epsilon Is a Key Regulator of Mitochondrial Redox Homeostasis in Acute Myeloid Leukemia.</a> Clinical Cancer Research. 24 (3), 608-618 (2018).</li><li>Glasauer, A., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+antioxidants+for+cancer+therapy.">Targeting antioxidants for cancer therapy.</a> Biochemical Pharmacology. 92 (1), 90-101 (2014).</li><li>Krivtsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+from+committed+progenitor+to+leukaemia+stem+cell+initiated+by+MLL-AF9.">Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9.</a> Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).</li><li>Frascoli, M., Proietti, M., Grassi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+and+isolation+of+murine+hematopoietic+stem+cells+and+lineage-committed+progenitors.">Phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li><li>Lo Celso, C., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transplantation+of+hematopoietic+stem+cells+(HSCs).">Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs).</a> Journal of Visualized Experiments. (157), (2007).</li><li>Kalaitzidis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+complex+1+plays+critical+roles+in+hematopoiesis+and+Pten-loss-evoked+leukemogenesis.">mTOR complex 1 plays critical roles in hematopoiesis and Pten-loss-evoked leukemogenesis.</a> Cell Stem Cell. 11 (3), 429-439 (2012).</li><li>Sykes, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AKT/FOXO+signaling+enforces+reversible+differentiation+blockade+in+myeloid+leukemias.">AKT/FOXO signaling enforces reversible differentiation blockade in myeloid leukemias.</a> Cell. 146 (5), 697-708 (2011).</li><li>Kalaitzidis, D., Neel, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-cytometric+phosphoprotein+analysis+reveals+agonist+and+temporal+differences+in+responses+of+murine+hematopoietic+stem/progenitor+cells.">Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells.</a> PLoS One. 3 (11), 3776 (2008).</li><li>Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Yilmaz, O. H., Terhorst, C., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells.">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).</li><li>Mooney, C. J., Cunningham, A., Tsapogas, P., Toellner, K. M., Brown, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+expression+of+flt3+within+the+mouse+hematopoietic+stem+cell+compartment.">Selective expression of flt3 within the mouse hematopoietic stem cell compartment.</a> International Journal Molecular Sciences. 18 (5), (2017).</li><li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+markers+resolve+functional+distinct+sub-populations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors.">SLAM family markers resolve functional distinct sub-populations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li><li>Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+lymphohematopoietic+reconstitution+by+a+single+CD34-low/negative+hematopoietic+stem+cell.">Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.</a> Science. 273 (5272), 242-245 (1996).</li><li>Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+and+hierarchy+within+the+most+primitive+hematopoietic+stem+cell+compartment.">Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1178 (2010).</li><li>Mukhopadhyay, P., Rajesh, M., Hask&#243;, G., Hawkins, B. J., Madesh, M., Pacher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+apoptosis+and+mitochondrial+superoxide+production+in+live+cells+by+flow+cytometry+and+confocal+microscopy.">Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy.</a> Nature Protocols. 2 (9), 2295-2301 (2007).</li><li>Camargo, F. D., Chambers, S. M., Drew, E., McNagny, K. M., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+do+not+engraft+with+absolute+efficiencies.">Hematopoietic stem cells do not engraft with absolute efficiencies.</a> Blood. 107 (2), 501-507 (2006).</li><li>Morita, Y., Ema, H., Yamazaki, S., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-side-population+hematopoietic+stem+cells+in+mouse+bone+marrow.">Non-side-population hematopoietic stem cells in mouse bone marrow.</a> Blood. 108 (8), 2850-2856 (2006).</li><li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye-Independent+Methods+Reveal+Elevated+Mitochondrial+Mass+in+Hematopoietic+Stem+Cells.">Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li><li>Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-potential+compensation+reveals+mitochondrial+volume+expansion+during+HSC+commitment.">Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment.</a> Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).</li><li>Somervaille, T. C., Cleary, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+leukemia+stem+cells+in+murine+MLL-AF9+acute+myeloid+leukemia.">Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).</li><li>Hao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Imaging+Reveals+a+Unique+Preference+of+Symmetric+Cell+Division+and+Homing+of+Leukemia-Initiating+Cells+in+an+Endosteal+Niche.">Metabolic Imaging Reveals a Unique Preference of Symmetric Cell Division and Homing of Leukemia-Initiating Cells in an Endosteal Niche.</a> Cell Metabolism. 29 (4), 950-965 (2019).</li></ol>

Fluorogenic fargestoffer som er utviklet for påvisning av ROS er ofte evaluert i faste celler ved mikroskopi eller i levende celler ved flyt flowcytometri22. Flow analytiske evaluering av mitokondrie ROS i BM celler ved hjelp mitokondrie ROS fluorogenic fargestoffer har to store fordeler: 1) det er en rask og enkel teknikk som er egnet for levende celle analyse og 2) det gir mulighet for å skille og analysere sjeldne populasjoner på ett cellenivå i BM ved hjelp av overflate markør farging. De...

Reaktive oksygen arter (ROS) er svært reaktive molekyler avledet fra molekylær oksygen. Den mest veldefinerte cellulære plasseringen av ROS produksjon er mitokondrier, der elektroner som passerer gjennom elektron transport kjeden (ETF) i løpet av oksidativt fosforylering (OXPHOS) absorberes av molekylær oksygen som fører til dannelsen av en bestemt type ROS kalt superoxides1. Gjennom handlingene til en serie av enzymer, kalt superoxide dismutases eller SODs, superoxides omdannes til hydrogen peroksider, som senere nøytralisert i vann av enzymer som catalase eller glutation peroxidases (GPX). Forstyrrelser i ROS-regulatoriske mekanismer kan føre til overflødig produksjon av ROS, ofte referert til som oksidativt stress, som har skadelige og potensielt dødelige cellulære konsekvenser som Makromolekyl Kader (dvs. DNA, protein, lipider). Videre er oksidativt stress knyttet til flere patologi, slik som diabetes, inflammatoriske sykdommer, aldring og svulster2,3,4. For å opprettholde Redox homeostase og forebygge oksidativt stress, celler har en rekke ROS-regulere mekanismer5.
Fysiologiske nivåer av visse ROS er nødvendig for riktig embryonale og voksne hematopoiesen6. Men, overflødig ROS er forbundet med DNA skade, differensiering og utmattelse av blodkreft stammen og stamfar bassenget. Det er også bevis for at endringer i Redox biologi kan variere mellom leukemi og sunne celler. For eksempel, ros nivåer tendens til å være høyere i akutt myelogen leukemi (AML) celler i forhold til deres sunne kolleger og andre studier har antydet at leukemi stamceller opprettholde en lav steady-state nivå av ros for overlevelse7,8. Viktigere, strategier for terapeutisk utnytte disse Redox forskjellene har vist løftet i flere menneskelige kreft innstillinger9,10. Derfor analyser som gjør det mulig for vurdering av ROS nivåer i musemodeller kan forbedre vår forståelse av hvordan disse artene bidra til cellulær fysiologi og sykdom patogenesen samt potensielt gi en plattform for å vurdere effektiviteten av romanen Redox-målretting anti-kreft terapi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1109px;" width="1110">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Heat inactivated FBS</td>
			<td style="width:279px;">VWR Seradigm LIFE SCIENCE</td>
			<td style="width:393px;">97068-085</td>
			<td style="width:191px;">Media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-20</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">15 mL conical tube</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">50 mL conical tube</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">40 &#956;m cell strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RBC Lysis Buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-112-9751</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Menadione sodium Bisulfite</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>M5750</td>
			<td>Pro-oxidant</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NAC</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>A7250</td>
			<td>Anti-oxidant</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100310</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">CD4 PE-Cy5 clone RM4-5</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>15-0041-81</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>15-0081-81</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">CD19 PE-Cy5 clone 6D5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115510</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103210</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108410</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116210</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD48 PE-Cy5 clone HM48-1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103420</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD117&#160; APC-Cy7 clone 2B8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105825</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sca1 peacific Blue clone D7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108120</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD150 APC clone TC15-12F12.2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115909</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD34 FITC clone RAM34</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553733</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD45.2 APC clone 104</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>1098313</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MitoSOX Red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M36008</td>
			<td>Dye</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mitotracker Green</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M7514</td>
			<td>Dye</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Live/dead Yellow Dye</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L34967</td>
			<td>Dye</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of mitochondrial reactive oxygen species in murine hematopoietic stem and progenitor cells and mll-af9 driven leukemia

Vi presenterer en flyt analytiske tilnærming for å analysere mitokondrie ROS i ulike Live benmarg (BM)-avledet stilk og Stamcelle populasjoner fra friske mus, samt mus med AML drevet av MLL-AF9. Nærmere bestemt beskriver vi en to-trinns cellefarge prosess, hvorved sunne eller leukemi BM celler er først farget med en fluorogenic fargestoff som oppdager mitokondrie superoxides, etterfulgt av farging med fluorokromkonjugert-koblede monoklonale antistoffer som brukes å skille ulike sunn og ondartet blodkreft stamfar populasjoner. Vi tilbyr også en strategi for å anskaffe og analysere prøvene ved å strømme flowcytometri. Hele protokollen kan utføres i en tidsramme så kort som 3-4 h. Vi kan også markere nøkkelen variabler å vurdere samt fordeler og begrensninger av overvåking ROS produksjon i mitokondrie kupé av levende blodkreft og leukemi stilk og stamfar subpopulasjoner bruker fluorogenic fargestoffer ved flyt flowcytometri . Videre presenterer vi data som mitokondrie ROS overflod varierer blant distinkte sunne HSPC Sub-populasjoner og leukemi forfedre og diskutere mulige anvendelser av denne teknikken i Hematologic forskning.

Presentert er en metode for å analysere ROS i mitokondrier av flere sunne og MLL-AF9-uttrykker leukemi stamfar populasjoner. Figur 1 viser en skjematisk visning av protokoll arbeidsflyten, som består av 4 viktige trinn: 1) BM isolering fra mus; 2) farging BM celler med en fluorogenic fargestoff som gjenkjenner mitokondrie ROS, spesielt superoxides; 3) overflate markør antistoff flekker å avgrense ulike sunne og leukemi blodkreft populasjoner; og 4) Flow flowcytometri oppkjøp og analyse....

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia at JoVE.com

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Vi beskriver en metode for bruk multiparameter Flow flowcytometri å oppdage mitokondrie reaktive oksygen arter (ROS) i murine sunn blodkreft stammen og stamceller (HSPCs) og leukemi celler fra en mus modell av akutt myelogen leukemi (AML) drevet av MLL-AF9.

Flow analytiske analyse av mitokondrie reaktive oksygen arter i murine blodkreft stem og stamceller og MLL-AF9 drevet leukemi

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Reaktive oksygenarter eller ROS, er svært reaktive oksygenarter som produseres av celler, og påvirker deres oppførsel. Selv om overflødig ROS kan også forårsake utbredt cellulær kaos, og i alvorlige tilfeller, celledød. Dermed er vedlikehold av ROS homeostase av grunnleggende betydning for cellulær funksjon og overlevelse.Protokollen presenteres her, fokuserer på å måle en bestemt type ROS, som genereres av mitokondrier, hovedsakelig som et metabolsk byprodukt i levende, normal eller sunn hematopoetisk stamme og stamcellepopulasjoner, samt i leukemiceller fra musemodellen av blodkreft, akutt myelogen leukemi eller AML. Denne protokollen kan også brukes til å evaluere hvordan genetisk manipulasjon, som gensletting eller overuttrykk, påvirker mitokondrieROS i flere sunne og ondartede hematopoetiske populasjoner. Og som et resultat, potensielt gi innsiktsfull informasjon om redux tilstand og muligens metabolismen av cellene.Denne teknikken autoriserer flow settle metrisk analyse av en protogenic sonde for å overvåke mitokondrie ROS produksjon i levende sunn og ondartet hematopoetisk stamme og stamfar underpopulasjoner. Denne protokollen er enkel og kan fullføres om noen timer. Videre er det egnet for levende celleanalyse og gjør det mulig å skille og analysere mitokondrieROS i stamcellepopulasjonen i benmargen, ved hjelp av overflatemerke for farging.Etter å ha samlet mononukleære benmargsceller fra ville trange mus og leukemiske MLL-AF9-mus, ifølge manuskriptet, aliquot 200 mikroliter av cellesuspensjonen i hver av ni enkeltfargekontrollrør. Aliquot de resterende cellene i andre eksperimentelle rør, 200 mikroliter hver. Deretter plasseres i en sentrifuge to eksperimentelle rør som inneholder benmargsceller og leukemiceller henholdsvis, og ett kontrollrør.Sentrifuge ved 300 ganger G i fem minutter. Deretter dekanterer du overnatanten, og re-suspenderer cellene i romtemperatur F-PBS med en levende / død celleflekk, i henhold til produsentens instruksjoner. Inkuber på is i 30 minutter.Etterpå legger du til 1 milliliter romtemperatur F-PBS til de tre levende / døde beisede rørene, og ett enkelt fargekontrollrør for mitokondrie ROS fargestofffarging. Plasser rørene i sentrifugen ved 300 ganger G i fem minutter ved romtemperatur. Deretter får du en 5 millimolar mitokondrie ROS fargestoff lager løsning ved å re-suspendere 50 mikrogram mitokondrie ROS fargestoff i 13 mikroliter dmso.Tilsett deretter 13 milliliter romtemperatur F-PBS til 13 mikroliter mitokondrie ROS fargestoff for å fortynne til en endelig konsentrasjon på fem mikromos. Tilsett om nødvendig 13 mikroliter med 50 millimolar Verapamil til løsningen for å hemme mitokondriefflukspumper. Få rørene fra sentrifugen og aspirer av vasken av den levende / døde celleflekken.Tilsett 200 mikroliter F-PBS i den levende / døde fargekontrollen og hold den i is til du er klar til å starte analysen. Tilsett 200 mikroliter av mitokondrie-ROS-fargestoffflekken som inneholder Verapamil, til hvert eksperimentelle rør, samt mitokondrie-ROS-fargekontrollrøret. Vortex å blande og inkubere i 10 minutter ved 37 grader Celsius i mørket.Tilsett deretter 1 milliliter romtemperatur F-PBS til kontroll- og eksperimentelle rør. Sentrifuge fem minutter ved 300 ganger G ved romtemperatur. Aspirer av supernatent og vask cellene med en ekstra en milliliter romtemperatur F-PBS.Sentrifuge igjen i fem minutter ved 300 ganger G, ved romtemperatur. Først forberede to antistoff cocktailer for sunne og leukemi benmargceller. Aspirer det overnaturante fra det eksperimentelle røret som inneholder sunne benmargsceller, og tilsett 200 mikroliter av antistoffcocktailen nummer én til røret.Vortex å blande. Klargjør også enkeltfargekontrollrørene ved å legge til 200 mikroliter F-PBS og en mikroliter av det tilsvarende antistoffet. Inkuber i 60 minutter på is i mørket.Aspirer det overnaturante fra det eksperimentelle røret som inneholder leukemibenmarg, og legg til 200 mikroliter av antistoffcocktail nummer to, til røret. Vortex å blande. Inkuber i 60 minutter på is i mørket.Deretter vasker du alle rørene med 1 milliliter kald F-PBS og sentrifuge i fem minutter ved 300 ganger G ved romtemperatur. Re-suspendere cellene i 500 mikroliter av kalde F-PBS. Overfør cellefjæringen til hvert strømningscytometerrør med et 40 mikrometerfilter for å ekskludere aggregater.Først setter du inn et ingen flekkkontrollrør inn i strømningscytometrimaskinen og starter oppkjøpet for å kompensere strømningscytometrimaskinen. Gjenta for andre kontrollrør. Etterpå kan du lese de eksperimentelle rørene for å sette opp portene.For å analysere størrelsen og kompleksiteten til cellepopulasjonen, først for sunn HSPC, sett fremover scatter-området og side scatter området tomter populasjoner. Trykk på Square Gate-knappen, for å gate ut overflødig rusk fra forover og side scatter plot. Deretter, på en fremover scatter område og høyde tomten, bruke en dobbel diskriminerende å gate ut dobler.Velg levende celler, avstamning lave celler, og de ulike sunne HSPC. For hver populasjon av interesse, analyser median fluorescensintensiteten til TRPE-kanalen i et histagramplott, for å evaluere forskjeller i mitokondrie-ROS-signalet. Gjenta samme prosedyre for størrelsesanalyse, gating og histogrammet plotting for leukemi populasjoner.Benmargsceller isolert fra friske mus ble farget med et levende / dødt fargestoff og et mitokondrie ROS-fargestoff, og deretter farget med antistoffer som gjenkjenner avstamning markører:pluss CD48, C-kit, Sca-1, CD34 og CD150. I tillegg ble benmargsceller fra leukemimus også farget med CD45.2 for å diskriminere mellom MLL-AF9 leukemiceller fra friske mottakerbenmargsceller farget med CD45.1. En sammenligning av mitokondrie ROS farging, mellom sunn CD48 negativ LSK, og myeloid stamfar, viser at myeloid stamfar viser betydelig høyere nivåer av mitokondrie ROS farging.Videre, c-Kit høy leukemi stamfar viser betydelig høyere nivåer av mitokondrie ROS farging, sammenlignet med c-Kit middels lav leukemi celler, sunn CD48 negative LSK og myeloid stamfar. C-Kit middels lav leukemi celler, viste også en betydelig høyere verdi sammenlignet med CD48 negative LSK celler, men ikke til myelogiske forfedre. Mitokondrie ROS fargestoffer er svært reaktive og passende vasketrinn er nødvendig for å sikre at eventuelle overskudd av fargestoffet er fjernet før du starter følgende trinn.Det finnes flere kjemisk distinkte ROS fluorogene fargestoffer som kan brukes i denne protokollen, for å oppnå litt kunnskap om redux-statusen i levende hematopoetiske celler. Denne teknikken har blitt mye brukt i litteraturen, og kan gi nyttig innsikt om metabolske og signalveier som er differensialregulert i leukemiceller, sammenlignet med sine normale kolleger.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

En detaljert protokoll for å karakterisere Murine C1498 Cell Line og dens Associated leukemi Mouse Model

The intravenous injection of C1498 cells into syngeneic or congenic mice has been performed since 1941. These injections result in the development of ...

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Omfattende protokoll for å prøve og prosessen benmarg for å måle målbare gjenværende sykdom og Leukemic stamceller i akutt myelogen leukemi

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Flow cytometri å anslå leukemi stamceller i primære akutt myelogen leukemi og pasient-avledet-xenografts, diagnose og følge opp

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation

Immunglobulin Gene Sequence Analysis i kronisk lymfatisk leukemi: Fra pasienten materiale til sekvens tolkning

During B cell maturation, the complex process of immunoglobulin (IG) gene V(D)J recombination coupled with somatic hypermutation (SHM) gives rise to a ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Vurdering av metabolske profilen til primære leukemi celler

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

Flow Cytometric påvisning av nydannede brystkreft stilk cellen som celler etter apoptose reversering

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

Romlig og Temporal kontroll av murine melanom innvielse fra mutant melanocyte stamceller

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Evaluering av celledød ved hjelp av cellefri supernatant av probiotika i tredimensjonale sfæroidkulturer av kolorektale kreftceller

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

To flowcytometriske tilnærminger til NKG2D Ligand overflatedeteksjon for å skille stamceller fra bulk subpopulations i akutt myeloid leukemi

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Flow Cytometric Analysis of Apoptotic Biomarkers in Actinomycin D-Treated SiHa Cervical Cancer Cells

Flowcytometrisk analyse av apoptotiske biomarkører i Actinomycin D-behandlede SiHa livmorhalskreftceller

Apoptosis biomarkers were investigated in actinomycin D-treated SiHa cervical cancer cells using a benchtop flow cytometer. Early biomarkers (Annexin V ...