Name: flow cytometric analysis of mitochondrial reactive oxygen species in murine hematopoietic stem and progenitor cells and mll-af9 driven leukemia
Uploaded: 2019-09-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia at JoVE.com

Эта работа была поддержана Фокс Чейз онкологический центр совета директоров (DDM), Американское общество гематологии Стипендиат премии (SMS), Американское онкологическое общество RSG (SMS) и Министерство обороны (Награда: W81XWH-18-1-0472).

Все процедуры для животных, описанные в этом протоколе, были одобрены институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) в онкологическом центре Фокс Чейз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочий процесс протокола делится на 4 части, представленные на <strong class="xfi...

<ol>
	<li>Dr&#246;se, S., Brandt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+superoxide+production+by+the+mitochondrial+respiratory+chain.">Molecular mechanisms of superoxide production by the mitochondrial respiratory chain.</a> Advances in experimental medicine and biology. 748, 145-169 (2012).</li><li>Gerber, P. A., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Oxidative+Stress+and+Hypoxia+in+Pancreatic+Beta-Cell+Dysfunction+in+Diabetes+Mellitus.">The Role of Oxidative Stress and Hypoxia in Pancreatic Beta-Cell Dysfunction in Diabetes Mellitus.</a> Antioxidant &amp; Redox Signaling. 26 (10), 501-518 (2017).</li><li>H&#246;hn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Happily+(n)ever+after:+Aging+in+the+context+of+oxidative+stress,+proteostasis+loss+and+cellular+senescence.">Happily (n)ever after: Aging in the context of oxidative stress, proteostasis loss and cellular senescence.</a> Redox Biology. 11, 482-501 (2017).</li><li>Reuter, S., Gupta, S. C., Chaturvedi, M. M., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress,+inflammation,+and+cancer:+how+are+they+linked.">Oxidative stress, inflammation, and cancer: how are they linked.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 49 (11), 1603-1616 (2010).</li><li>Lee, B. W. L., Ghode, P., Ong, D. S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+regulation+of+cell+state+and+fate.">Redox regulation of cell state and fate.</a> Redox Biology. 2213-2317 (18), 30899 (2018).</li><li>Harris, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+metabolism+impacts+the+spatiotemporal+onset+and+magnitude+of+HSC+induction+in+vivo.">Glucose metabolism impacts the spatiotemporal onset and magnitude of HSC induction in vivo.</a> Blood. 121, 2483-2493 (2013).</li><li>Hole, P. S., Darley, R. L., Tonks, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+reactive+oxygen+species+play+a+role+in+myeloid+leukemias.">Do reactive oxygen species play a role in myeloid leukemias.</a> Blood. 117, 5816-5826 (2011).</li><li>Lagadinou, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BCL-2+inhibition+targets+oxidative+phosphorylation+and+selectively+eradicates+quiescent+human+leukemia+stem+cells.">BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (3), 329-341 (2013).</li><li>Di Marcantonio, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Kinase+C+Epsilon+Is+a+Key+Regulator+of+Mitochondrial+Redox+Homeostasis+in+Acute+Myeloid+Leukemia.">Protein Kinase C Epsilon Is a Key Regulator of Mitochondrial Redox Homeostasis in Acute Myeloid Leukemia.</a> Clinical Cancer Research. 24 (3), 608-618 (2018).</li><li>Glasauer, A., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+antioxidants+for+cancer+therapy.">Targeting antioxidants for cancer therapy.</a> Biochemical Pharmacology. 92 (1), 90-101 (2014).</li><li>Krivtsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+from+committed+progenitor+to+leukaemia+stem+cell+initiated+by+MLL-AF9.">Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9.</a> Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).</li><li>Frascoli, M., Proietti, M., Grassi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+and+isolation+of+murine+hematopoietic+stem+cells+and+lineage-committed+progenitors.">Phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li><li>Lo Celso, C., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transplantation+of+hematopoietic+stem+cells+(HSCs).">Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs).</a> Journal of Visualized Experiments. (157), (2007).</li><li>Kalaitzidis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+complex+1+plays+critical+roles+in+hematopoiesis+and+Pten-loss-evoked+leukemogenesis.">mTOR complex 1 plays critical roles in hematopoiesis and Pten-loss-evoked leukemogenesis.</a> Cell Stem Cell. 11 (3), 429-439 (2012).</li><li>Sykes, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AKT/FOXO+signaling+enforces+reversible+differentiation+blockade+in+myeloid+leukemias.">AKT/FOXO signaling enforces reversible differentiation blockade in myeloid leukemias.</a> Cell. 146 (5), 697-708 (2011).</li><li>Kalaitzidis, D., Neel, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-cytometric+phosphoprotein+analysis+reveals+agonist+and+temporal+differences+in+responses+of+murine+hematopoietic+stem/progenitor+cells.">Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells.</a> PLoS One. 3 (11), 3776 (2008).</li><li>Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Yilmaz, O. H., Terhorst, C., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells.">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).</li><li>Mooney, C. J., Cunningham, A., Tsapogas, P., Toellner, K. M., Brown, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+expression+of+flt3+within+the+mouse+hematopoietic+stem+cell+compartment.">Selective expression of flt3 within the mouse hematopoietic stem cell compartment.</a> International Journal Molecular Sciences. 18 (5), (2017).</li><li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+markers+resolve+functional+distinct+sub-populations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors.">SLAM family markers resolve functional distinct sub-populations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li><li>Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+lymphohematopoietic+reconstitution+by+a+single+CD34-low/negative+hematopoietic+stem+cell.">Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.</a> Science. 273 (5272), 242-245 (1996).</li><li>Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+and+hierarchy+within+the+most+primitive+hematopoietic+stem+cell+compartment.">Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1178 (2010).</li><li>Mukhopadhyay, P., Rajesh, M., Hask&#243;, G., Hawkins, B. J., Madesh, M., Pacher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+apoptosis+and+mitochondrial+superoxide+production+in+live+cells+by+flow+cytometry+and+confocal+microscopy.">Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy.</a> Nature Protocols. 2 (9), 2295-2301 (2007).</li><li>Camargo, F. D., Chambers, S. M., Drew, E., McNagny, K. M., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+do+not+engraft+with+absolute+efficiencies.">Hematopoietic stem cells do not engraft with absolute efficiencies.</a> Blood. 107 (2), 501-507 (2006).</li><li>Morita, Y., Ema, H., Yamazaki, S., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-side-population+hematopoietic+stem+cells+in+mouse+bone+marrow.">Non-side-population hematopoietic stem cells in mouse bone marrow.</a> Blood. 108 (8), 2850-2856 (2006).</li><li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye-Independent+Methods+Reveal+Elevated+Mitochondrial+Mass+in+Hematopoietic+Stem+Cells.">Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li><li>Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-potential+compensation+reveals+mitochondrial+volume+expansion+during+HSC+commitment.">Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment.</a> Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).</li><li>Somervaille, T. C., Cleary, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+leukemia+stem+cells+in+murine+MLL-AF9+acute+myeloid+leukemia.">Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).</li><li>Hao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Imaging+Reveals+a+Unique+Preference+of+Symmetric+Cell+Division+and+Homing+of+Leukemia-Initiating+Cells+in+an+Endosteal+Niche.">Metabolic Imaging Reveals a Unique Preference of Symmetric Cell Division and Homing of Leukemia-Initiating Cells in an Endosteal Niche.</a> Cell Metabolism. 29 (4), 950-965 (2019).</li></ol>

Флюорогенные красители, которые были разработаны для обнаружения ROS часто оцениваются в фиксированных клетках с помощью микроскопии или в живых клетках цитометрии потока22. Поток цитометрической оценки митохондриального ROS в клетках БМ с использованием митохондриальных ?...

Реактивные виды кислорода (ROS) являются высокореактивными молекулами, полученными из молекулярного кислорода. Наиболее четко определенным клеточным расположением производства ROS являются митохондрии, где электроны, проходящие через цепочку транспортировки электронов (ETC) во время окислительного фосфорилирования (OXPHOS), поглощаются молекулярным кислородом, ведущим к образованию специфического тип ROS называетсясупероксиды 1. Благодаря действиям ряда ферментов, называемых супероксидными дисмутазами или СОД, супероксиды преобразуются в перекиси водорода, которые впоследствии нейтрализуются в воду такими ферментами, как каталаза или глутатион пероксидаза (GPX). Возмущения в механизмах РОСрегулирования могут привести к избыточному производству ROS, часто называемого окислительным стрессом, которые имеют вредные и потенциально смертельные клеточные последствия, такие как повреждение макромолекулы (т.е. ДНК, белок, липиды). Кроме того, окислительный стресс связан с несколькими патологиями, такими как диабет, воспалительные заболевания, старение и опухоли2,3,4. Для поддержания редокс гомеостаза и предотвращения окислительного стресса, клетки обладают различными механизмами, регулирующими СЕБЯ5.
Физиологические уровни некоторых ROS необходимы для правильного эмбрионального и взрослого гематопоезии6. Однако избыток ROS связан с повреждением ДНК, клеточной дифференциацией и истощением гематопоиетического стебля и бассейна-прародителя. Существует также доказательство того, что изменения в биологии Redox могут отличаться между лейкемией и здоровыми клетками. Например, уровни ROS, как правило, выше в острой миелоидной лейкемии (AML) клетки по сравнению с их здоровыми коллегами и другие исследования показали, что лейкемия стволовые клетки поддерживать низкий устойчивый уровень ROS для выживания7,8. Важно отметить, что стратегии терапевтической капитализации на этих различиях Redox показали обещание в нескольких условиях рака человека9,10. Таким образом, анализы, которые позволяют оценить уровни ROS в моделях мышей, могут улучшить наше понимание того, как эти виды способствуют клеточной физиологии и патогенеза заболеваний, а также потенциально обеспечивают платформу для оценки эффективности новые редокс-таргетинга противораковой терапии.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1109px;" width="1110">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Heat inactivated FBS</td>
			<td style="width:279px;">VWR Seradigm LIFE SCIENCE</td>
			<td style="width:393px;">97068-085</td>
			<td style="width:191px;">Media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-20</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">15 mL conical tube</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">50 mL conical tube</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">40 &#956;m cell strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RBC Lysis Buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-112-9751</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Menadione sodium Bisulfite</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>M5750</td>
			<td>Pro-oxidant</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NAC</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>A7250</td>
			<td>Anti-oxidant</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100310</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">CD4 PE-Cy5 clone RM4-5</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>15-0041-81</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>15-0081-81</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">CD19 PE-Cy5 clone 6D5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115510</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103210</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108410</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116210</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD48 PE-Cy5 clone HM48-1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103420</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD117&#160; APC-Cy7 clone 2B8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105825</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sca1 peacific Blue clone D7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108120</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD150 APC clone TC15-12F12.2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115909</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD34 FITC clone RAM34</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553733</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD45.2 APC clone 104</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>1098313</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MitoSOX Red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M36008</td>
			<td>Dye</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mitotracker Green</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M7514</td>
			<td>Dye</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Live/dead Yellow Dye</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L34967</td>
			<td>Dye</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of mitochondrial reactive oxygen species in murine hematopoietic stem and progenitor cells and mll-af9 driven leukemia

Мы представляем циклометрический подход потока для анализа митохондриального ROS в различных живых костных мозгах (БМ) полученных стволовых и прародителей клеток населения от здоровых мышей, а также мышей с AML обусловлен MLL-AF9. В частности, мы описываем двухступенчатый процесс окрашивания клеток, в котором здоровые или лейкозные клетки БМ сначала окрашиваются флюорогенным красителем, который обнаруживает митохондриальные супероксиды, а затем окрашивает с флюрохром-связанных моноклональных антител, которые используются различать различные здоровые и злокачественные популяции гематопоиетических прародителей. Мы также предоставляем стратегию для приобретения и анализа образцов с помощью цитометрии потока. Весь протокол может быть выполнен в срок, как короткие, как 3-4 ч. Мы также подчеркиваем ключевые переменные, которые следует учитывать, а также преимущества и ограничения мониторинга производства ROS в митохондриальном отсеке живой гематопоитической и лейкозной стеблей и субпопуляций гененора с использованием флюорогенных красителей при цитометрии потока . Кроме того, мы представляем данные о том, что митохондриальные ROS изобилие варьируется между различными здоровыми HSPC субпопуляций и лейкемии прародителей и обсудить возможные применения этой техники в гематологических исследований.

Представлен метод анализа ROS в митохондриях нескольких здоровых и MLL-AF9-выражения популяций декариата. Рисунок 1 отображает схематическое представление рабочего процесса протокола, которое состоит из 4 основных шагов: 1) изоляция БМ от мышей; 2) Окрашивание бМ клеток с флу?...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia at JoVE.com

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Мы описываем метод использования многопараметрического потока цитометрии для обнаружения митохондриальных реактивных видов кислорода (ROS) в мурин здоровых гематопоиетических стволовых и прародителей клеток (HSPCs) и лейкозных клеток из мышиной модели острого миелоидного лейкоза (AML) обусловлен MLL-AF9.

Поток Цитометрический анализ митохондриальных реактивных видов кислорода в Мурин гематопоитических стволовых и прародителей клеток и MLL-AF9 Driven лейкемии

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Реактивные виды кислорода или ROS, являются высокореактивными видами кислорода, которые производятся клетками, и влияет на их поведение. Хотя избыток ROS также может вызвать широко распространенный клеточный хаос, а в тяжелых случаях, гибель клеток. Таким образом, поддержание РОС гомеостаза имеет основополагающее значение для клеточной функции и выживания.Протокол, представленный здесь, фокусируется на измерении определенного типа ROS, который генерируется митохондриями, главным образом как метаболический побочный продукт в живых, нормальных или здоровых гематопоэтических стволовых и прародителя клеточных популяций, а также в клетках лейкемии из мышиной модели рака крови, острого миелоидного лейкоза или АМЛ. Этот протокол также может быть использован для оценки того, как генетические манипуляции, такие как удаление генов или переэкспрессия, влияют на митохондриальные ROS в нескольких здоровых и злокачественных гематопоэтических популяциях. И в результате, потенциально обеспечивают проницательную информацию о состоянии redux и, возможно, метаболизм клеток.Этот метод разрешает поток урегулировать метрический анализ протогенного зонда для мониторинга митохондриального производства ROS в живых здоровых и злокачественных гематопоэтических стволовых и прародителя субпопеи. Этот протокол прост и может быть завершен в течение нескольких часов. Кроме того, он подходит для анализа живых клеток и позволяет различать и анализировать митохондриальные ROS в популяции стволовых клеток в костном мозге, используя поверхностный знак окрашивания.После сбора моноядерных клеток костного мозга от диких туго мышей и лейкемии MLL-AF9 мышей, в соответствии с рукописью, aliquot 200 микролитров клеточной подвески в каждом из девяти одноцветных труб управления. Aliquot оставшихся клеток в другие экспериментальные трубки, 200 микролитров каждый. Затем поместите в центрифугу две экспериментальные трубки, содержащие клетки костного мозга и лейкемические клетки соответственно, и одну контрольную трубку.Центрифуга при 300 раз G в течение пяти минут. Далее, декант supernatant, и повторно приостановить клетки в комнатной температуре F-PBS с живой / мертвой ячейки пятна, в соответствии с инструкциями производителя. Инкубировать на льду в течение 30 минут.После этого добавьте 1 миллилитр комнатной температуры F-PBS к трем живым/мертвым окрашенным трубам и одну трубку управления цветом для окрашивания митохондриального красителя ROS. Поместите трубки в центрифугу при температуре 300 Г в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем получите 5 миллимолярный митохондриальный раствор красителя ROS, повторно приостановив 50 микрограмм митохондриального красителя ROS в 13 микролитров DMSO.Затем добавьте 13 миллилитров комнатной температуры F-PBS к 13 микролитровому митохондриальному красителю ROS, чтобы разбавить до конечной концентрации пять микромолеров. При необходимости добавьте 13 микролитров 50 миллимоляров Verapamil в раствор для ингибирования митохондриальных насосов эффлюкса. Получить трубки из центрифуги и аспирировать от мытья живых / мертвых клеток пятна.Добавить 200 микролитров F-PBS в живых / мертвых окрашивания контроля и держать его во льду, пока не готовы начать анализ. Добавьте 200 микролитров митохондриального пятна красителя ROS, содержащего Verapamil, в каждую экспериментальную трубку, а также митохондриальную трубку управления окрашивания ROS. Вихрь смешивать и инкубировать в течение 10 минут при 37 градусах по Цельсию в темноте.Затем добавьте 1 миллилитр комнатной температуры F-PBS в контрольные и экспериментальные трубки. Центрифуга пять минут при температуре в 300 Г при комнатной температуре. Аспирировать от супернатента и мыть клетки с дополнительным один миллилитр комнатной температуры F-PBS.Центрифуга снова в течение пяти минут при 300 раз G, при комнатной температуре. Во-первых, подготовить два антитела коктейли для здоровых и лейкозных клеток костного мозга. Аспирировать супернатант из экспериментальной трубки, содержащей здоровые клетки костного мозга, и добавить 200 микролитров антител коктейль номер один в трубку.Вихрь смешивать. Также подготовьте одиночные пробки управления цвета путем добавлять 200 микролитров F-PBS и одного microliter соединого антитела. Инкубировать в течение 60 минут на льду в темноте.Аспирировать супернатант из экспериментальной трубки, содержащей лейкемию костного мозга, и добавить 200 микролитров антител коктейль номер два, в трубку. Вихрь смешивать. Инкубировать в течение 60 минут на льду в темноте.После этого, мыть все трубки с 1 миллилитр холодной F-PBS и центрифуги в течение пяти минут при 300 раз G при комнатной температуре. Повторно приостанавливать клетки в 500 микролитров холодного F-PBS. Перенесите подвеску клетки в каждую цитометровую трубку потока с 40-метровым фильтром для исключения агрегатов.Во-первых, вставьте один не пятно управления трубкой в поток цитометрии машины и начать приобретение, чтобы компенсировать поток цитометрии машины. Повторите для других контрольных труб. После этого прочитайте экспериментальные трубки, чтобы установить ворота.Для анализа размера и сложности популяции клеток, в первую очередь для здорового HSPC, установите передовую площадь рассеяния и боковые участки рассеяния популяций. Нажмите кнопку Квадратные ворота, чтобы ворота из посторонних мусора с вперед и сбоку рассеяния участка. Затем, на вперед рассеяния области и высоты участка, использовать двойной дискриминатор ворот из дублетов.Выберите живые клетки, линии низких клеток, и различные здоровые HSPC. Для каждой группы интересов проанализируйте медианную интенсивность флуоресценции канала TRPE в сюжете гистаграммы, чтобы оценить различия в митохондриальном сигнале ROS. Повторите ту же процедуру анализа размера, gating и гистограммы заговора для популяций лейкемии.Клетки костного мозга, изолированные от здоровых мышей, были окрашены живым/мертвым красителем и митохондриальным красителем ROS, а затем окрашены антителами, распознавающих маркеры линии: плюс CD48, C-комплект, Sca-1, CD34 и CD150. Кроме того, клетки костного мозга у мышей лейкемии также были окрашены CD45.2 для различего клеток лейкемии MLL-AF9 от здоровых клеток костного мозга реципиента, окрашенных CD45.1. Сравнение митохондриального окрашивания ROS, между здоровым CD48 отрицательным LSK, и миелоидных прародителей, показывает, что миелоидные прародители отображают значительно более высокие уровни митохондриального окрашивания ROS.Кроме того, c-Kit высокой лейкемии прародителей дисплей значительно более высокие уровни митохондриального окрашивания ROS, по сравнению с c-Kit промежуточных низких клеток лейкемии, здоровый CD48 отрицательных LSK и миелоидных прародителей. C-Kit промежуточных низких клеток лейкемии, также отображается значительно более высокое значение по сравнению с CD48 отрицательных клеток LSK, но не миелоидных прародителей. Митохондриальные красители ROS являются высокореактивными и соответствующие шаги мытья необходимы для обеспечения того, чтобы любое избыток красителя был удален до начала следующих шагов.Есть несколько химически различных ROS фторгенных красителей, которые могут быть использованы в этом протоколе, для достижения немного знаний о статусе redux в живых гематопоэтических клеток. Этот метод широко используется в литературе, и может обеспечить полезную информацию о метаболических и сигнальных путей, которые дифференцированно регулируется в клетках лейкемии, по сравнению с их нормальными коллегами.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

Подробный протокол Характеризуя клеточной линии мышиной C1498 и его модель Associated Лейкоз Mouse

The intravenous injection of C1498 cells into syngeneic or congenic mice has been performed since 1941. These injections result in the development of ...

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Всеобъемлющий протокол выборки и процесс костного мозга для измерения поддающихся оценке остаточной болезни и лейкозных клеток острой миелоидной лейкемией

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Проточная цитометрия оценить стволовых клеток лейкемии в первичных острый миелолейкоз и пациент производные ксенотрасплантатов, диагностики и последующей вверх

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation

Анализ последовательности гена иммуноглобулинов в хронический лимфоцитарный лейкоз: От пациента материала для интерпретации последовательности

During B cell maturation, the complex process of immunoglobulin (IG) gene V(D)J recombination coupled with somatic hypermutation (SHM) gives rise to a ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Оценка метаболических профиля первичных лейкозных клеток

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

Обнаружение потока гранулярных новообразованной груди Рак стволовых клеток как клеток после разворота апоптоз

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

Пространственный и временный контроль Мурин Меланомы Инициация от мутантных меланоцитов стволовых клеток

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Оценка гибели клеток с использованием бесклеточного супернатанта пробиотиков в трехмерных сфероидных культурах колоректальных раковых клеток

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

Два проточных цитометрических подхода к обнаружению поверхности лигандов NKG2D для отличия стволовых клеток от объемных субпопуляций при остром миелоидном лейкозе

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Flow Cytometric Analysis of Apoptotic Biomarkers in Actinomycin D-Treated SiHa Cervical Cancer Cells

Проточный цитометрический анализ биомаркеров апоптоза в клетках рака шейки матки SiHa, обработанных актиномицином D

Apoptosis biomarkers were investigated in actinomycin D-treated SiHa cervical cancer cells using a benchtop flow cytometer. Early biomarkers (Annexin V ...