Name: flow cytometric analysis of mitochondrial reactive oxygen species in murine hematopoietic stem and progenitor cells and mll-af9 driven leukemia
Uploaded: 2019-09-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Fox Chase Cancer Center styrelse (DDM), American Society of hematologi Scholar Award (SMS), American Cancer Society RSG (SMS) och Department of Defense (Award #: W81XWH-18-1-0472).

Alla de djur förfaranden som beskrivs i detta protokoll har godkänts av den institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) på Fox Chase Cancer Center.
Anmärkning: Protokollet arbetsflöde är uppdelat i 4 delar som presenteras i figur 1 och de nödvändiga reagenser anges i tabellen av material.
1. isolering av benmärg (BM)
Anmärkning: MLL-...

<ol>
	<li>Dr&#246;se, S., Brandt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+superoxide+production+by+the+mitochondrial+respiratory+chain.">Molecular mechanisms of superoxide production by the mitochondrial respiratory chain.</a> Advances in experimental medicine and biology. 748, 145-169 (2012).</li><li>Gerber, P. A., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Oxidative+Stress+and+Hypoxia+in+Pancreatic+Beta-Cell+Dysfunction+in+Diabetes+Mellitus.">The Role of Oxidative Stress and Hypoxia in Pancreatic Beta-Cell Dysfunction in Diabetes Mellitus.</a> Antioxidant &amp; Redox Signaling. 26 (10), 501-518 (2017).</li><li>H&#246;hn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Happily+(n)ever+after:+Aging+in+the+context+of+oxidative+stress,+proteostasis+loss+and+cellular+senescence.">Happily (n)ever after: Aging in the context of oxidative stress, proteostasis loss and cellular senescence.</a> Redox Biology. 11, 482-501 (2017).</li><li>Reuter, S., Gupta, S. C., Chaturvedi, M. M., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress,+inflammation,+and+cancer:+how+are+they+linked.">Oxidative stress, inflammation, and cancer: how are they linked.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 49 (11), 1603-1616 (2010).</li><li>Lee, B. W. L., Ghode, P., Ong, D. S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+regulation+of+cell+state+and+fate.">Redox regulation of cell state and fate.</a> Redox Biology. 2213-2317 (18), 30899 (2018).</li><li>Harris, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+metabolism+impacts+the+spatiotemporal+onset+and+magnitude+of+HSC+induction+in+vivo.">Glucose metabolism impacts the spatiotemporal onset and magnitude of HSC induction in vivo.</a> Blood. 121, 2483-2493 (2013).</li><li>Hole, P. S., Darley, R. L., Tonks, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+reactive+oxygen+species+play+a+role+in+myeloid+leukemias.">Do reactive oxygen species play a role in myeloid leukemias.</a> Blood. 117, 5816-5826 (2011).</li><li>Lagadinou, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BCL-2+inhibition+targets+oxidative+phosphorylation+and+selectively+eradicates+quiescent+human+leukemia+stem+cells.">BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (3), 329-341 (2013).</li><li>Di Marcantonio, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Kinase+C+Epsilon+Is+a+Key+Regulator+of+Mitochondrial+Redox+Homeostasis+in+Acute+Myeloid+Leukemia.">Protein Kinase C Epsilon Is a Key Regulator of Mitochondrial Redox Homeostasis in Acute Myeloid Leukemia.</a> Clinical Cancer Research. 24 (3), 608-618 (2018).</li><li>Glasauer, A., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+antioxidants+for+cancer+therapy.">Targeting antioxidants for cancer therapy.</a> Biochemical Pharmacology. 92 (1), 90-101 (2014).</li><li>Krivtsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+from+committed+progenitor+to+leukaemia+stem+cell+initiated+by+MLL-AF9.">Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9.</a> Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).</li><li>Frascoli, M., Proietti, M., Grassi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+and+isolation+of+murine+hematopoietic+stem+cells+and+lineage-committed+progenitors.">Phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li><li>Lo Celso, C., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transplantation+of+hematopoietic+stem+cells+(HSCs).">Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs).</a> Journal of Visualized Experiments. (157), (2007).</li><li>Kalaitzidis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+complex+1+plays+critical+roles+in+hematopoiesis+and+Pten-loss-evoked+leukemogenesis.">mTOR complex 1 plays critical roles in hematopoiesis and Pten-loss-evoked leukemogenesis.</a> Cell Stem Cell. 11 (3), 429-439 (2012).</li><li>Sykes, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AKT/FOXO+signaling+enforces+reversible+differentiation+blockade+in+myeloid+leukemias.">AKT/FOXO signaling enforces reversible differentiation blockade in myeloid leukemias.</a> Cell. 146 (5), 697-708 (2011).</li><li>Kalaitzidis, D., Neel, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-cytometric+phosphoprotein+analysis+reveals+agonist+and+temporal+differences+in+responses+of+murine+hematopoietic+stem/progenitor+cells.">Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells.</a> PLoS One. 3 (11), 3776 (2008).</li><li>Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Yilmaz, O. H., Terhorst, C., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells.">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).</li><li>Mooney, C. J., Cunningham, A., Tsapogas, P., Toellner, K. M., Brown, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+expression+of+flt3+within+the+mouse+hematopoietic+stem+cell+compartment.">Selective expression of flt3 within the mouse hematopoietic stem cell compartment.</a> International Journal Molecular Sciences. 18 (5), (2017).</li><li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+markers+resolve+functional+distinct+sub-populations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors.">SLAM family markers resolve functional distinct sub-populations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li><li>Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+lymphohematopoietic+reconstitution+by+a+single+CD34-low/negative+hematopoietic+stem+cell.">Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.</a> Science. 273 (5272), 242-245 (1996).</li><li>Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+and+hierarchy+within+the+most+primitive+hematopoietic+stem+cell+compartment.">Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1178 (2010).</li><li>Mukhopadhyay, P., Rajesh, M., Hask&#243;, G., Hawkins, B. J., Madesh, M., Pacher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+apoptosis+and+mitochondrial+superoxide+production+in+live+cells+by+flow+cytometry+and+confocal+microscopy.">Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy.</a> Nature Protocols. 2 (9), 2295-2301 (2007).</li><li>Camargo, F. D., Chambers, S. M., Drew, E., McNagny, K. M., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+do+not+engraft+with+absolute+efficiencies.">Hematopoietic stem cells do not engraft with absolute efficiencies.</a> Blood. 107 (2), 501-507 (2006).</li><li>Morita, Y., Ema, H., Yamazaki, S., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-side-population+hematopoietic+stem+cells+in+mouse+bone+marrow.">Non-side-population hematopoietic stem cells in mouse bone marrow.</a> Blood. 108 (8), 2850-2856 (2006).</li><li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye-Independent+Methods+Reveal+Elevated+Mitochondrial+Mass+in+Hematopoietic+Stem+Cells.">Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li><li>Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-potential+compensation+reveals+mitochondrial+volume+expansion+during+HSC+commitment.">Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment.</a> Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).</li><li>Somervaille, T. C., Cleary, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+leukemia+stem+cells+in+murine+MLL-AF9+acute+myeloid+leukemia.">Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).</li><li>Hao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Imaging+Reveals+a+Unique+Preference+of+Symmetric+Cell+Division+and+Homing+of+Leukemia-Initiating+Cells+in+an+Endosteal+Niche.">Metabolic Imaging Reveals a Unique Preference of Symmetric Cell Division and Homing of Leukemia-Initiating Cells in an Endosteal Niche.</a> Cell Metabolism. 29 (4), 950-965 (2019).</li></ol>

Fluorogena färgämnen som har utvecklats för detektion av ROS är ofta utvärderas i fasta celler av mikroskopi eller i levande celler med flödescytometri22. Flödescytometrisk utvärdering av mitokondriella ROS i BM-celler med mitokondriella ROS-fluorogena färgämnen har två stora fördelar: 1) det är en snabb och enkel teknik som är lämplig för levande cell analys och 2) det gör det möjligt för att skilja och analysera sällsynta populationer på Single-cellnivå i BM med hjälp av y...

Reaktiva syreradikaler (ROS) är mycket reaktiva molekyler som härrör från molekyl syre. Den mest väldefinierade cellulära platsen för ROS produktion är mitokonmöen, där elektroner som passerar genom elektrontransportkedjan (ETC) under oxidativ fosforylering (OXFOS) absorberas av molekylärt syre som leder till bildandet av en specifik typ av ROS som kallas superoxider1. Genom åtgärder av en serie enzymer, kallade superoxiddismutaser eller SODs, omvandlas superoxider till väteperoxider, som därefter neutraliseras till vatten av enzymer som katalas eller glutationperoxiaser (GPX). Perturbations i ROS-reglerande mekanismer kan leda till överskottsproduktion av ROS, ofta kallad oxidativ stress, som har skadliga och potentiellt dödliga cellulära konsekvenser såsom makromolekyl skada (dvs., DNA, protein, lipider). Dessutom är oxidativ stress relaterad till flera patologier, såsom diabetes, inflammatoriska sjukdomar, åldrande och tumörer2,3,4. För att bibehålla redox homeostas och förhindra oxidativ stress, celler besitter en mängd olika ROS-reglerande mekanismer5.
Fysiologiska nivåer av vissa ROS är nödvändiga för korrekt embryonala och vuxna hematopoies6. Emellertid, överskott ROS är förknippad med DNA-skador, cellulära differentiering och utmattning av den hematopoietiska stammen och stamcells bassängen. Det finns också belägg för att förändringar i redox biologi kan skilja mellan leukemi och friska celler. Till exempel, ros nivåer tenderar att vara högre i akut myeloisk leukemi (AML) celler i förhållande till deras friska motsvarigheter och andra studier har föreslagit att leukemi stamceller upprätthålla en låg steady-state nivå av ros för överlevnad7,8. Viktigare, strategier för terapeutiskt kapitalisera på dessa redox skillnader har visat löfte i flera mänskliga cancer inställningar9,10. Därför, analyser som gör det möjligt att bedöma ROS nivåer i musmodeller kan förbättra vår förståelse för hur dessa arter bidrar till cellulär fysiologi och sjukdomens patogenes samt potentiellt tillhandahålla en plattform för att bedöma effektiviteten av Roman redox-inriktning mot cancerterapier.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1109px;" width="1110">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Heat inactivated FBS</td>
			<td style="width:279px;">VWR Seradigm LIFE SCIENCE</td>
			<td style="width:393px;">97068-085</td>
			<td style="width:191px;">Media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-20</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">15 mL conical tube</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">50 mL conical tube</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">40 &#956;m cell strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RBC Lysis Buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-112-9751</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Menadione sodium Bisulfite</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>M5750</td>
			<td>Pro-oxidant</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NAC</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>A7250</td>
			<td>Anti-oxidant</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100310</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">CD4 PE-Cy5 clone RM4-5</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>15-0041-81</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>15-0081-81</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">CD19 PE-Cy5 clone 6D5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115510</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103210</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108410</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116210</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD48 PE-Cy5 clone HM48-1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103420</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD117&#160; APC-Cy7 clone 2B8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105825</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sca1 peacific Blue clone D7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108120</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD150 APC clone TC15-12F12.2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115909</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD34 FITC clone RAM34</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553733</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD45.2 APC clone 104</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>1098313</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MitoSOX Red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M36008</td>
			<td>Dye</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mitotracker Green</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M7514</td>
			<td>Dye</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Live/dead Yellow Dye</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L34967</td>
			<td>Dye</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of mitochondrial reactive oxygen species in murine hematopoietic stem and progenitor cells and mll-af9 driven leukemia

Vi presenterar ett flöde kors metod för att analysera mitokondrie ros i olika levande benmärg (BM)-härledda stamceller och stamcells populationer från friska möss samt möss med AML drivs av MLL-AF9. Specifikt, vi beskriver en två-stegs cell färgning process, där friska eller leukemi BM celler först färgas med ett fluorogent färgämne som detekterar mitokondriella superoxider, följt av färgning med fluorkrom-länkade monoklonala antikroppar som används att särskilja olika friska och maligna hematopoietiska stamceller. Vi erbjuder också en strategi för att förvärva och analysera proverna med flödescytometri. Hela protokollet kan utföras i en tidsram så kort som 3-4 h. Vi belyser också de viktigaste variablerna att överväga samt fördelar och begränsningar av övervakning av ROS produktion i mitokondriella facket av levande hematopoetisk och leukemi stamceller och stamcells subpopulationer med hjälp av fluorogena färgämnen genom flödescytometri . Dessutom presenterar vi data som mitokondriell ROS överflöd varierar mellan olika friska HSPC sub-populationer och leukemi stamceller och diskutera de möjliga tillämpningarna av denna teknik i hematologisk forskning.

Presenteras är en metod för att analysera ROS i mitokonan av flera friska och MLL-AF9-uttrycker leukemi progenitorceller populationer. Bild 1 visar en schematisk vy över protokollets arbetsflöde, som består av 4 huvudsteg: 1) BM-isolering från möss. 2) färgning BM celler med ett fluorogent färgämne som erkänner mitokondriella ROS, särskilt superoxider; 3) ytmarkör antikropp färgning för att avgränsa olika friska och leukemi hematopoietiska populationer; och 4) flödescytometr...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia at JoVE.com

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Vi beskriver en metod för att använda multiparametrar flödescytometri för att detektera mitokondriella reaktiva syreradikaler (ros) i murina friska hematopoietiska stamceller och stamceller (hspcs) och leukemiceller från en musmodell av akut myeloisk leukemi (AML) driven av MLL-AF9.

Flödescytometrisk analys av mitokondriella reaktiva syreradikaler i murina hematopoietiska Stem och progenitorceller och MLL-AF9 driven leukemi

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Reaktiva syrearter eller ROS, är mycket reaktiva syrearter som produceras av celler, och påverkar deras beteende. Även överskott ROS kan också orsaka utbredd cellulär förödelse, och i svåra fall, celldöd. Således är upprätthållandet av ROS homeostas av grundläggande betydelse för cellulär funktion och överlevnad.Protokollet presenteras här, fokuserar på att mäta en specifik typ av ROS, som genereras av mitokondrier, främst som en metabolisk av produkten i levande, normal, eller friska hematopoietic stam och stamceller populationer, samt i leukemi celler från musmodell av blodcancer, Akut Myeloisk leukemi eller AML. Detta protokoll kan också användas för att utvärdera hur genetisk manipulation, såsom genrade deletion eller överuttryck, påverkar mitokondriellt ROS i flera friska och maligna hematopoetiska populationer. Och som ett resultat, potentiellt ge insiktsfull information om redux tillstånd och eventuellt metabolismen av cellerna.Denna teknik auktoriserar flöde settle metrisk analys av en protogenic sond för att övervaka mitokondriell ROS produktion i levande friska och maligna hematopoietic stam och progenitor sub-populationer. Detta protokoll är okomplicerat och kan slutföras på några timmar. Dessutom är det lämpligt för levande cellanalys och möjliggör för att skilja och analysera mitokondriellt ROS i stamceller befolkningen i benmärgen, med hjälp av ytmärke av färgning.Efter att ha samlat mononukleära benmärgsceller från vilda trånga möss och leukemic MLL-AF9 möss, enligt manuskriptet, aliquot 200 mikroliter av cellen suspension i var och en av nio enda färg kontrollrör. Aliquot de återstående cellerna i andra experimentella rör, 200 mikroliter vardera. Placera sedan i en centrifug två experimentella rör som innehåller benmärgsceller och leukemiceller respektive, och ett kontrollrör.Centrifugera vid 300 gånger G i fem minuter. Därefter dekantera supernatanten, och åter upphäva cellerna i rumstemperatur F-PBS med en levande / död cell fläck, enligt tillverkarens instruktioner. Inkubera på is i 30 minuter.Efteråt, tillsätt 1 milliliter av rumstemperatur F-PBS till de tre levande / döda färgade rör, och en enda färg kontrollrör för mitokondriellt ROS färgning färgning. Placera rören i centrifugen vid 300 gånger G i fem minuter i rumstemperatur. Därefter, få en 5 millimolar mitokondriellt ROS färgämne stamlösning genom att åter upphäva 50 mikrogram mitokondriellt ROS färgämne i 13 mikroliter av DMSO.Tillsätt sedan 13 milliliter rumstemperatur F-PBS till 13 mikroliter mitokondriellt ROS färgämne att späda ut till en slutlig koncentration av fem mikromolar. Tillsätt vid behov 13 mikroliter på 50 millimolar Verapamil till lösningen för att hämma mitokondriella effluxpumpar. Erhåll rören från centrifug och aspirera bort tvätten av den levande/ döda cellfläcken.Lägg till 200 mikroliter av F-PBS i live / dead färgning kontroll och hålla den i is tills redo att starta analysen. Tillsätt 200 mikroliter av mitokondriellt ROS färgämne fläcken som innehåller Verapamil, till varje experimentellt rör, liksom mitokondriellt ROS färgning kontrollröret. Vortex att blanda och inkubera i 10 minuter vid 37 grader Celsius i mörkret.Tillsätt sedan 1 milliliter rumstemperatur F-PBS till kontroll- och experimentrören. Centrifug fem minuter vid 300 gånger G vid rumstemperatur. Aspirera av supernatent och tvätta cellerna med ytterligare en milliliter rumstemperatur F-PBS.Centrifugera igen i fem minuter vid 300 gånger G, vid rumstemperatur. Först förbereda två antikropp cocktails för friska och leukemi benmärgsceller. Aspirera supernatanten från det experimentella röret som innehåller friska benmärgsceller, och tillsätt 200 mikroliter av antikroppscocktailen nummer ett till röret.Vortex att blanda. Förbered även de enda färgkontrollrören genom att tillsätta 200 mikroliter av F-PBS och en mikroliter av motsvarande antikropp. Inkubera i 60 minuter på is i mörkret.Aspirera supernatanten från det experimentella röret som innehåller leukemibenmärg, och tillsätt 200 mikroliter av antikroppscocktailen nummer två, till röret. Vortex att blanda. Inkubera i 60 minuter på is i mörkret.Därefter tvättar du alla rören med 1 milliliter kall F-PBS och centrifug i fem minuter vid 300 gånger G vid rumstemperatur. Åter avbryta cellerna i 500 mikroliter av kalla F-PBS. Överför cellupphängningen till varje flödescytmeterrör med ett 40-mikrometerfilter för exkluderande aggregat.Först, sätt in en ingen fläck kontrollröret i flödet cytometry maskinen och starta förvärvet för att kompensera flödet cytometri maskin. Upprepa för andra manöverrör. Efteråt, läs de experimentella rören för att ställa in grindarna.För att analysera storlek och komplexitet av cellpopulationen, först för friska HSPC, ställa in den framåt scatter område och sidan scatter område tomter populationer. Tryck på Square Gate-knappen, för att grind ut främmande skräp från framåt och sida scatter tomt. Sedan, på en framåt scatter område och höjd tomt, använd en dubbel discriminator att gate ut dubbletar.Markera levande celler, härstamning låga celler och de olika friska HSPC. För varje population av intresse, analysera medianen fluorescens intensiteten av TRPE-kanalen i en histagram plot, att utvärdera skillnader i mitokondriellt ROS signal. Upprepa samma förfarande av storleksanalys, gating och histogram plottning för leukemi populationer.Benmärgsceller isolerade från friska möss var färgas med en levande / döda färgämne och en mitokondriell ROS färgämne, och därefter färgas med antikroppar erkänner härstamning markörer:plus CD48, C-kit, Sca-1, CD34 och CD150. Dessutom var benmärgsceller från leukemi möss också färgas med CD45.2 att diskriminera mellan MLL-AF9 leukemi celler från friska mottagare benmärg celler färgas med CD45.1. En jämförelse av mitokondriellt ROS färgning, mellan friska CD48 negativa LSK, och myeloida progenitors, visar att myeloida progenitorer visa betydligt högre nivåer av mitokondriellt ROS färgning.Dessutom, c-Kit hög leukemi föregångare visa betydligt högre nivåer av mitokondriell ROS färgning, jämfört med c-Kit mellanliggande låg leukemi celler, friska CD48 negativa LSK och myeloida progenitors. C-Kit mellanliggande låg leukemiceller, visas också ett betydligt högre värde jämfört med CD48 negativa LSK celler, men inte till myeloida stamceller. Mitokondriella ROS-färgämnen är mycket reaktiva och lämpliga tvättsteg behövs för att säkerställa att eventuellt överskott av färgämnet har tagits bort innan följande steg påbörjas.Det finns flera kemiskt distinkta ROS fluorogena färgämnen som kan användas i detta protokoll, för att uppnå lite kunskap om redux status i levande hematopoetiska celler. Denna teknik har använts i stor utsträckning i litteraturen, och kan ge användbara insikter om metaboliska och signalering vägar som är differentiellt regleras i leukemiceller, om jämfört med deras normala motsvarigheter.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

Ett detaljerat protokoll för att karakterisera Murine C1498 cellinje och dess associerade leukemi musmodell

The intravenous injection of C1498 cells into syngeneic or congenic mice has been performed since 1941. These injections result in the development of ...

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Omfattande protokoll till prov och processen benmärg för att mäta mätbara kvarvarande sjukdom och leukemiska stamceller i akut myeloisk leukemi

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Flödescytometri för att uppskatta leukemi stamceller i primär akut myeloisk leukemi och i Patient-härrör-xenograft, vid diagnos och följa upp

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation

Immunglobulin Gene Sequence Analysis i kronisk lymfatisk leukemi: Från patientmaterial sekvens tolkning

During B cell maturation, the complex process of immunoglobulin (IG) gene V(D)J recombination coupled with somatic hypermutation (SHM) gives rise to a ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Bedömning av den metabola profilen av primära leukemiceller

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

Flöde flödescytometrisk påvisa nybildade Stem Cell-liknande bröstcancerceller efter apoptos återföring

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

Rumslig och temporal kontroll av murina melanom initiering från Mutant melanocyte stamceller

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Utvärdera celldöd med hjälp av cellfri supernatant av probiotika i tredimensionella sfäroidkulturer av kolorektalcancerceller

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

Två flödescytometriska metoder för NKG2D Ligand Ytdetektering för att skilja stamceller från bulkunderpopulationer i akut myeloisk leukemi

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Flow Cytometric Analysis of Apoptotic Biomarkers in Actinomycin D-Treated SiHa Cervical Cancer Cells

Flödescytometrisk analys av apoptotiska biomarkörer i aktinomycin D-behandlade SiHa livmoderhalscancerceller

Apoptosis biomarkers were investigated in actinomycin D-treated SiHa cervical cancer cells using a benchtop flow cytometer. Early biomarkers (Annexin V ...