Name: flow cytometric analysis of mitochondrial reactive oxygen species in murine hematopoietic stem and progenitor cells and mll-af9 driven leukemia
Uploaded: 2019-09-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia at JoVE.com

Bu çalışma Fox Chase Kanser Merkezi Yönetim Kurulu (DDM), Amerikan Hematoloji Bilginleri Derneği Ödülü (SMS), American Cancer Society RSG (SMS) ve Savunma Bakanlığı (Ödül#: W81XWH-18-1-0472) tarafından desteklenmiştir.

Bu protokolde açıklanan tüm hayvan prosedürleri Fox Chase Kanser Merkezi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
NOT: Protokol iş akışı Şekil 1'de sunulduğu gibi 4 bölüme ayrılmıştır ve gerekli reaktifler Malzeme Tablosu'ndalistelenmiştir.
1. Kemik İliği (BM) İzolasyon
NOT: MLL-AF9 lösemi far...

<ol>
	<li>Dr&#246;se, S., Brandt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+superoxide+production+by+the+mitochondrial+respiratory+chain.">Molecular mechanisms of superoxide production by the mitochondrial respiratory chain.</a> Advances in experimental medicine and biology. 748, 145-169 (2012).</li><li>Gerber, P. A., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Oxidative+Stress+and+Hypoxia+in+Pancreatic+Beta-Cell+Dysfunction+in+Diabetes+Mellitus.">The Role of Oxidative Stress and Hypoxia in Pancreatic Beta-Cell Dysfunction in Diabetes Mellitus.</a> Antioxidant &amp; Redox Signaling. 26 (10), 501-518 (2017).</li><li>H&#246;hn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Happily+(n)ever+after:+Aging+in+the+context+of+oxidative+stress,+proteostasis+loss+and+cellular+senescence.">Happily (n)ever after: Aging in the context of oxidative stress, proteostasis loss and cellular senescence.</a> Redox Biology. 11, 482-501 (2017).</li><li>Reuter, S., Gupta, S. C., Chaturvedi, M. M., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress,+inflammation,+and+cancer:+how+are+they+linked.">Oxidative stress, inflammation, and cancer: how are they linked.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 49 (11), 1603-1616 (2010).</li><li>Lee, B. W. L., Ghode, P., Ong, D. S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+regulation+of+cell+state+and+fate.">Redox regulation of cell state and fate.</a> Redox Biology. 2213-2317 (18), 30899 (2018).</li><li>Harris, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+metabolism+impacts+the+spatiotemporal+onset+and+magnitude+of+HSC+induction+in+vivo.">Glucose metabolism impacts the spatiotemporal onset and magnitude of HSC induction in vivo.</a> Blood. 121, 2483-2493 (2013).</li><li>Hole, P. S., Darley, R. L., Tonks, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+reactive+oxygen+species+play+a+role+in+myeloid+leukemias.">Do reactive oxygen species play a role in myeloid leukemias.</a> Blood. 117, 5816-5826 (2011).</li><li>Lagadinou, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BCL-2+inhibition+targets+oxidative+phosphorylation+and+selectively+eradicates+quiescent+human+leukemia+stem+cells.">BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (3), 329-341 (2013).</li><li>Di Marcantonio, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Kinase+C+Epsilon+Is+a+Key+Regulator+of+Mitochondrial+Redox+Homeostasis+in+Acute+Myeloid+Leukemia.">Protein Kinase C Epsilon Is a Key Regulator of Mitochondrial Redox Homeostasis in Acute Myeloid Leukemia.</a> Clinical Cancer Research. 24 (3), 608-618 (2018).</li><li>Glasauer, A., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+antioxidants+for+cancer+therapy.">Targeting antioxidants for cancer therapy.</a> Biochemical Pharmacology. 92 (1), 90-101 (2014).</li><li>Krivtsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+from+committed+progenitor+to+leukaemia+stem+cell+initiated+by+MLL-AF9.">Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9.</a> Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).</li><li>Frascoli, M., Proietti, M., Grassi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+and+isolation+of+murine+hematopoietic+stem+cells+and+lineage-committed+progenitors.">Phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li><li>Lo Celso, C., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transplantation+of+hematopoietic+stem+cells+(HSCs).">Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs).</a> Journal of Visualized Experiments. (157), (2007).</li><li>Kalaitzidis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+complex+1+plays+critical+roles+in+hematopoiesis+and+Pten-loss-evoked+leukemogenesis.">mTOR complex 1 plays critical roles in hematopoiesis and Pten-loss-evoked leukemogenesis.</a> Cell Stem Cell. 11 (3), 429-439 (2012).</li><li>Sykes, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AKT/FOXO+signaling+enforces+reversible+differentiation+blockade+in+myeloid+leukemias.">AKT/FOXO signaling enforces reversible differentiation blockade in myeloid leukemias.</a> Cell. 146 (5), 697-708 (2011).</li><li>Kalaitzidis, D., Neel, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-cytometric+phosphoprotein+analysis+reveals+agonist+and+temporal+differences+in+responses+of+murine+hematopoietic+stem/progenitor+cells.">Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells.</a> PLoS One. 3 (11), 3776 (2008).</li><li>Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Yilmaz, O. H., Terhorst, C., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells.">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).</li><li>Mooney, C. J., Cunningham, A., Tsapogas, P., Toellner, K. M., Brown, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+expression+of+flt3+within+the+mouse+hematopoietic+stem+cell+compartment.">Selective expression of flt3 within the mouse hematopoietic stem cell compartment.</a> International Journal Molecular Sciences. 18 (5), (2017).</li><li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+markers+resolve+functional+distinct+sub-populations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors.">SLAM family markers resolve functional distinct sub-populations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li><li>Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+lymphohematopoietic+reconstitution+by+a+single+CD34-low/negative+hematopoietic+stem+cell.">Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.</a> Science. 273 (5272), 242-245 (1996).</li><li>Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+and+hierarchy+within+the+most+primitive+hematopoietic+stem+cell+compartment.">Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1178 (2010).</li><li>Mukhopadhyay, P., Rajesh, M., Hask&#243;, G., Hawkins, B. J., Madesh, M., Pacher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+apoptosis+and+mitochondrial+superoxide+production+in+live+cells+by+flow+cytometry+and+confocal+microscopy.">Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy.</a> Nature Protocols. 2 (9), 2295-2301 (2007).</li><li>Camargo, F. D., Chambers, S. M., Drew, E., McNagny, K. M., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+do+not+engraft+with+absolute+efficiencies.">Hematopoietic stem cells do not engraft with absolute efficiencies.</a> Blood. 107 (2), 501-507 (2006).</li><li>Morita, Y., Ema, H., Yamazaki, S., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-side-population+hematopoietic+stem+cells+in+mouse+bone+marrow.">Non-side-population hematopoietic stem cells in mouse bone marrow.</a> Blood. 108 (8), 2850-2856 (2006).</li><li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye-Independent+Methods+Reveal+Elevated+Mitochondrial+Mass+in+Hematopoietic+Stem+Cells.">Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li><li>Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-potential+compensation+reveals+mitochondrial+volume+expansion+during+HSC+commitment.">Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment.</a> Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).</li><li>Somervaille, T. C., Cleary, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+leukemia+stem+cells+in+murine+MLL-AF9+acute+myeloid+leukemia.">Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).</li><li>Hao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Imaging+Reveals+a+Unique+Preference+of+Symmetric+Cell+Division+and+Homing+of+Leukemia-Initiating+Cells+in+an+Endosteal+Niche.">Metabolic Imaging Reveals a Unique Preference of Symmetric Cell Division and Homing of Leukemia-Initiating Cells in an Endosteal Niche.</a> Cell Metabolism. 29 (4), 950-965 (2019).</li></ol>

ROS tespiti için geliştirilen florojenik boyalar sabit hücrelerde sıklıkla mikroskopi veya canlı hücrelerde akış sitometrisi22ile değerlendirilir. Mitokondriyal ROS florojenik boyalar kullanılarak BM hücrelerinde mitokondriyal ROS akış sitometrik değerlendirilmesi iki önemli avantajı vardır: 1) Canlı hücre analizi için uygun hızlı ve basit bir tekniktir ve 2) nadir ayırt ve analiz sağlar yüzey marker boyama kullanarak BM'de tek hücredüzeyinde popülasyonlar. Burada sunu...

Reaktif Oksijen Türleri (ROS) moleküler oksijenden elde edilen yüksek reaktif moleküllerdir. ROS üretiminin en iyi tanımlanmış hücresel konumu, oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) sırasında elektron taşıma zincirinden (ETC) geçen elektronların belirli bir oluşumuna yol açan moleküler oksijen tarafından emildiği mitokondridir. süperoksit ler1olarak adlandırılan ROS türü. Süperoksit dismutazveya SOD siyonları olarak adlandırılan bir dizi enzimin eylemleri sayesinde, süperoksitler hidrojen peroksitlere dönüştürülür ve bunlar daha sonra katalaz veya glutatyon peroksidaz (GPX) gibi enzimler tarafından suya nötralize edilir. ROS düzenleyici mekanizmalardaki pertürbasyonlar, makromolekül hasarı (DNA, protein, lipidler) gibi zararlı ve potansiyel olarak ölümcül hücresel sonuçlara sahip oksidatif stres olarak adlandırılan ROS'un aşırı üretimine yol açabilir. Ayrıca, oksidatif stres diyabet, inflamatuar hastalıklar, yaşlanma ve tümörler2,3,4gibi çeşitli patolojiler ile ilgilidir. Redoks homeostazını korumak ve oksidatif stresi önlemek için, hücreler çeşitli ROS düzenleyici mekanizmalara sahip5.
Uygun embriyonik ve erişkin hematopoyon için bazı ROS fizyolojik düzeyleri gereklidir6. Ancak, aşırı ROS DNA hasarı ile ilişkilidir, hücresel farklılaşma ve hematopoetik kök ve ata havuzu yorgunluk. Redoks biyolojisindeki değişikliklerin lösemi ve sağlıklı hücreler arasında farklılık gösterdiğine dair kanıtlar da vardır. Örneğin, ROS düzeyleri akut miyeloid lösemi (AML) hücrelerinde sağlıklı muadillerine göre daha yüksek olma eğilimindedir ve diğer çalışmalar lösemi kök hücrelerinin hayatta kalmak için ROS düşük sabit devlet düzeyini korumak olduğunu ileri sürmüşlerdir7,8. Daha da önemlisi, terapötik bu redoks farklılıkları yararlanmak için stratejiler çeşitli insan kanseri ortamlarında umut göstermiştir9,10. Bu nedenle, fare modellerinde ROS düzeylerinin değerlendirilmesine olanak sağlayan tahliller, bu türlerin hücresel fizyoloji ve hastalık patogenene nasıl katkıda bulunduklarına dair anlayışımızı geliştirebilir ve potansiyel olarak yeni redoks hedefleyen anti-kanser tedavileri.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1109px;" width="1110">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Heat inactivated FBS</td>
			<td style="width:279px;">VWR Seradigm LIFE SCIENCE</td>
			<td style="width:393px;">97068-085</td>
			<td style="width:191px;">Media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-20</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">15 mL conical tube</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">50 mL conical tube</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">40 &#956;m cell strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RBC Lysis Buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-112-9751</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Menadione sodium Bisulfite</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>M5750</td>
			<td>Pro-oxidant</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NAC</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>A7250</td>
			<td>Anti-oxidant</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100310</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">CD4 PE-Cy5 clone RM4-5</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>15-0041-81</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>15-0081-81</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">CD19 PE-Cy5 clone 6D5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115510</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103210</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108410</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116210</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD48 PE-Cy5 clone HM48-1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103420</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD117&#160; APC-Cy7 clone 2B8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105825</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sca1 peacific Blue clone D7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108120</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD150 APC clone TC15-12F12.2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115909</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD34 FITC clone RAM34</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553733</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CD45.2 APC clone 104</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>1098313</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MitoSOX Red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M36008</td>
			<td>Dye</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mitotracker Green</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M7514</td>
			<td>Dye</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Live/dead Yellow Dye</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L34967</td>
			<td>Dye</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of mitochondrial reactive oxygen species in murine hematopoietic stem and progenitor cells and mll-af9 driven leukemia

Sağlıklı farelerin yanı sıra MLL-AF9 tarafından yönlendirilen AML'li farelerden elde edilen çeşitli canlı kemik iliği (BM) kaynaklı kök ve ata hücre popülasyonlarında mitokondriyal ROS'u analiz etmek için akış sitometrik bir yaklaşım sitometrik bir yaklaşım sintometrik olarak sintometrik olarak sifonal bir yaklaşım sintometrik olarak sifonal bir yaklaşım sinat ıyoruz. Özellikle, sağlıklı veya lösemi BM hücrelerinin ilk olarak mitokondriyal süperoksitleri tespit eden florojenik boya ile boyandığı ve ardından florokrom bağlantılı monoklonal antikorlarla boyandığı iki aşamalı bir hücre boyama işlemini tanımlıyoruz. çeşitli sağlıklı ve malign hematopoetik döl popülasyonlarını ayırt etmek. Ayrıca, akış sitometrisi ile numunelerin elde edilip analiz edilebisbir strateji sitometrisi sağlarız. Tüm protokol 3-4 saat gibi kısa bir zaman diliminde gerçekleştirilebilir. Ayrıca, akış sitometrisi ile florojenik boyalar kullanan canlı hematopoetik ve lösemi sapı ve progenitor alt popülasyonlarının mitokondriyal bölmesinde ROS üretiminin izlenmesinin avantajları ve sınırlamaları gibi önemli değişkenleri de vurguluyoruz. . Ayrıca, mitokondriyal ROS bolluğunun farklı sağlıklı HSPC alt popülasyonları ve lösemi ataları arasında değiştiğine dair veriler sunmakta ve hematolojik araştırmalarda bu tekniğin olası uygulamalarını tartışılmaktadır.

Sunulan birden fazla sağlıklı ve MLL-AF9 ifade eden lösemi atası popülasyonlarının mitokondrisinde ROS'u analiz etmek için kullanılan bir yöntemdir. Şekil 1, 4 ana adımdan oluşan protokol iş akışının şematik görünümünü görüntüler: 1) Farelerden BM yalıtımı; 2) Bm hücrelerinin mitokondriyal ROS'u, özellikle de süperoksitleri tanıyan florojenik boyaile boyanması; 3) Çeşitli sağlıklı ve lösemi hematopoetik popülasyonları belineatetmek için yüzey mar...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia at JoVE.com

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Biz murine sağlıklı hematopoetik kök ve döl hücreleri (HSPCs) ve akut miyeloid lösemi bir fare modeli lösemi hücreleri (ROS) tarafından tahrik mitokondriyal reaktif oksijen türlerini (ROS) tespit etmek için multiparametre akış sitometri sitometri kullanmak için bir yöntem tanımlamak MLL-AF9.

Murine Hematopoetik Kök ve Progenitor Hücrelerde Mitokondriyal Reaktif Oksijen Türlerinin Akış Sitometrik Analizi ve MLL-AF9 Tahrikli Lösemi

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Reaktif oksijen türleri veya ROS, hücreler tarafından üretilen son derece reaktif oksijen türleridir, ve davranışlarını etkiler. Aşırı ROS da yaygın hücresel hasara neden olabilir rağmen, ve ciddi durumlarda, hücre ölümü. Bu nedenle, ROS homeostaz Bakımı hücresel fonksiyon ve sağkalım için temel öneme sahiptir.Burada sunulan protokol, mitokondri tarafından üretilen belirli bir ROS türünü ölçmeye odaklanır, özellikle canlı, normal veya sağlıklı hematopoetik kök ve döl hücre popülasyonlarında metabolik yan ürün olarak, ayrıca kan kanseri, Akut Miyeloid Lösemi veya AML fare modelinden lösemi hücrelerinde. Bu protokol aynı zamanda gen delemesi veya aşırı ekspresyonu gibi genetik manipülasyonun çeşitli sağlıklı ve malign hematopoetik popülasyonlarda mitokondriyal ROS'u nasıl etkilediğini değerlendirmek için de kullanılabilir. Ve sonuç olarak, potansiyel redux devlet ve muhtemelen hücrelerin metabolizması hakkında anlayışlı bilgi sağlar.Bu teknik, canlı sağlıklı ve malign hematopoetik kök ve atayan alt popülasyonlarda mitokondriyal ROS üretimini izlemek için protojenik bir protojenik probun metrik analizini belirlemeyetkisine sahip. Bu protokol basittir ve birkaç saat içinde tamamlanabilir. Ayrıca, canlı hücre analizi için uygundur ve boyama yüzey işareti kullanarak, kemik iliğinde kök hücre popülasyonunda mitokondriyal ROS ayırt ve analiz sağlar.Vahşi sıkı fareler ve lösemik MLL-AF9 farelerden mononükleer kemik iliği hücreleri toplandıktan sonra, el yazmasına göre, aliquot 200 dokuz tek renk kontrol tüpleri her içine hücre süspansiyon mikrolitre. Aliquot diğer deneysel tüpler, 200 mikrolitre her içine kalan hücreleri. Daha sonra sırasıyla kemik iliği hücreleri ve lösemik hücreler içeren bir santrifüj içine yerleştirin, ve bir kontrol tüpü.5 dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj. Daha sonra, supernatant decant ve üreticinin talimatlarına göre, canlı / ölü hücre lekesi ile oda sıcaklığında F-PBS hücreleri yeniden askıya. 30 dakika boyunca buzda kuluçkaya yat.Daha sonra, üç canlı / ölü lekeli tüpler için oda sıcaklığında F-PBS 1 mililitre ekleyin ve mitokondriyal ROS boya boyama için tek bir renk kontrol tüpü. Tüpleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300 kez G'de santrifüje yerleştirin. Daha sonra, DMSO'nun 13 mikrolitresinde 50 mikrogram mitokondriyal ROS boyasını yeniden askıya alarak 5 milimolar mitokondriyal ROS boya sıyrık çözeltisi elde edin.Daha sonra 13 mikrolitre mitokondriyal ROS boyasına 13 mililitre oda sıcaklığında F-PBS ekleyin ve son konsantrasyonu beş mikromolar seyreltin. Gerekirse, mitokondriyal efflux pompaları inhibe etmek için çözeltiye 50 milimolar Verapamil 13 mikrolitre ekleyin. Tüpleri santrifüjden alın ve canlı/ölü hücre lekesinin yıkandığını aspire edin.Canlı/ölü boyama kontrolüne 200 mikrolitre F-PBS ekleyin ve analize hazır olana kadar buzda tutun. Her deney tüpüne ve mitokondriyal ROS boyama kontrol tüpüne Verapamil içeren mitokondriyal ROS boya lekesinin 200 mikrolitresini ekleyin. Girdap karanlıkta 37 santigrat derece 10 dakika karıştırmak ve kuluçka.Daha sonra kontrol ve deneysel tüpler e 1 mililitre oda sıcaklığında F-PBS ekleyin. Oda sıcaklığında 300 kez G'de beş dakika santrifüj. Supernatent kapalı Aspire ve oda sıcaklığında F-PBS ek bir mililitre ile hücreleri yıkayın.Oda sıcaklığında, 300 kez G beş dakika için tekrar santrifüj. İlk olarak, sağlıklı ve lösemi kemik iliği hücreleri için iki antikor kokteyller hazırlamak. Sağlıklı kemik iliği hücreleri içeren deneysel tüpten süpernatant aspire ve tüp e bir numaralı antikor kokteyl 200 mikrolitre ekleyin.Girdap karıştırmak için. Ayrıca f-PBS 200 mikrolitre ve ilgili antikor bir mikrolitre ekleyerek tek renk kontrol tüpleri hazırlamak. Karanlıkta buzda 60 dakika kuluçkaya yat.Lösemi kemik iliği içeren deneysel tüpten süpernatant aspire, ve antikor kokteyl sayısı iki 200 mikrolitre ekleyin, tüp. Girdap karıştırmak için. Karanlıkta buzda 60 dakika kuluçkaya yat.Bundan sonra, oda sıcaklığında 300 kez G beş dakika boyunca soğuk F-PBS ve santrifüj 1 mililitre ile tüm tüpleri yıkayın. 500 mikrolitre soğuk F-PBS'deki hücreleri yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonuna, agregaları hariç tetmek için 40 mikrometre filtreyle her akış sitometre tüpüne aktarın.İlk olarak, akış sitometri makinesiiçine bir leke kontrol tüpü yerleştirin ve akış sitometri makine telafi etmek için edinimi başlatmak. Diğer kontrol tüpleri için tekrarlayın. Daha sonra, kapıları kurmak için deneysel tüpleri okuyun.Hücre popülasyonunun boyutunu ve karmaşıklığını analiz etmek için, önce sağlıklı HSPC için, ileri dağılım alanını ve yan dağılım alanını popülasyonları çizin. Kare Kapı düğmesine basın, ileri ve yan dağılım arsa gelen gereksiz enkaz dışarı kapı. Daha sonra, bir ileri dağılım alanı ve yükseklik arsa, doublets dışarı kapı için bir çift ayırıcı kullanın.Canlı hücreleri, soyu düşük hücreleri ve çeşitli sağlıklı HSPC'yi seçin. Her ilgi çeken popülasyon için, mitokondriyal ROS sinyalindeki farklılıkları değerlendirmek için TRPE kanalının ortanca floresan yoğunluğunu bir historgram çiziminde analiz edin. Lösemi popülasyonları için boyut analizi, gating ve histogram çizimaynı prosedürü tekrarlayın.Sağlıklı farelerden izole edilen kemik iliği hücreleri canlı/ölü boya ve mitokondriyal ROS boyası ile boyandı ve daha sonra soy belirteçlerini tanıyan antikorlarla boyandı: artı CD48, C-kit, Sca-1, CD34 ve CD150. Buna ek olarak, lösemi farelerin kemik iliği hücreleri de CD45.1 ile boyanmış sağlıklı alıcı kemik iliği hücrelerinden MLL-AF9 lösemi hücreleri arasında ayrım yapmak için CD45.2 ile lekelendi. Mitokondriyal ROS boyama bir karşılaştırma, sağlıklı CD48 negatif LSK arasında, ve miyeloid atalar, miyeloid atalarının mitokondriyal ROS boyama önemli ölçüde daha yüksek düzeyde görüntülemek gösterir.Ayrıca, c-Kit yüksek lösemi ataları, c-Kit ara düşük lösemi hücreleri, sağlıklı CD48 negatif LSK ve miyeloid atalara göre önemli ölçüde daha yüksek düzeyde mitokondriyal ROS boyama gösterirler. C-Kit orta düşük lösemi hücreleri, ayrıca CD48 negatif LSK hücrelerine göre önemli ölçüde daha yüksek bir değer gösterdi, ama miyeloid atalara değil. Mitokondriyal ROS boyaları son derece reaktiftir ve aşağıdaki adımlara başlamadan önce boya fazlalığı giderildiğından emin olmak için uygun yıkama adımları gereklidir.Canlı hematopoetik hücrelerde redux durumu hakkında biraz bilgi elde etmek için, bu protokolde kullanılabilecek birkaç kimyasal farklı ROS florojenik boyalar vardır. Bu teknik literatürde yaygın olarak kullanılmıştır ve normal muadilleriyle karşılaştırıldığında lösemi hücrelerinde farklı olarak düzenlenmiş metabolik ve sinyal yolları hakkında yararlı bilgiler sağlayabilir.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

Fare C1498 Cep Hattı ve İlişkili Lösemi Fare Modeli Karakterizasyonu için Detaylı Protokolü

The intravenous injection of C1498 cells into syngeneic or congenic mice has been performed since 1941. These injections result in the development of ...

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Örnek ve işlem kemik iliği ölçülebilir artık hastalık ve akut Myeloid lösemi lösemik kök hücre ölçmek için kapsamlı iletişim kuralı

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Akış Sitometresi lösemi kök hücre birincil Akut Miyeloid Lösemi ve hasta-türetilen-xenografts, tanı ve takip yukarı tahmin etmek için

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation

Kronik Lenfositik Lösemi içinde immünglobulin Gene dizi analizi: Sıra yoruma hasta malzemeden

During B cell maturation, the complex process of immunoglobulin (IG) gene V(D)J recombination coupled with somatic hypermutation (SHM) gives rise to a ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Birincil lösemi hücrelerinin metabolik profili değerlendirilmesi

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

Apoptozis ters sonra yeni kurulan meme kanser kök hücre benzeri hücre akış sitometrik algılama

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

Mutant melanosit kök hücrelerinden Murine Melanoma başlangıcı uzamsal ve temporal kontrol

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Kolorektal Kanser Hücrelerinin Üç Boyutlu Küresel Kültürlerinde Probiyotiklerin Hücresiz Süpernatantı Kullanılarak Hücre Ölümünün Değerlendirilmesi

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

Akut Miyeloid Lösemide Kök Hücreleri Toplu AltÜlmelerden Ayırt Etmek İçin NKG2D Ligand Yüzey Tespitinin İki Akış Sitometrik Yaklaşımı

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Flow Cytometric Analysis of Apoptotic Biomarkers in Actinomycin D-Treated SiHa Cervical Cancer Cells

Aktinomisin D ile Tedavi Edilen SiHa Serviks Kanseri Hücrelerinde Apoptotik Biyobelirteçlerin Akış Sitometrik Analizi

Apoptosis biomarkers were investigated in actinomycin D-treated SiHa cervical cancer cells using a benchtop flow cytometer. Early biomarkers (Annexin V ...