Name: using microtiter dish radiolabeling for multiple in vivo measurements of escherichia coli (p)ppgpp followed by thin layer chromatography
Uploaded: 2019-06-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli pppGpp Followed by Thin Layer Chromatography at JoVE.com

وقد تم دعم هذا البحث في برنامج البحوث داخل الجدارية، معهد يونيس كينيدي شرايفر الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية، المعاهد القومية للصحة.

1. إعداد وسائل الإعلام
<ol><li>
لMOPS (3-(N-morpholino) حمض البروبانسولفونيك) وسائل الإعلام25، واستخدام حجم 1/10 من أملاح MOPS 10X ، 1/100 حجم من محلول المغذيات الدقيقة 100X ، 3 مليون متر فوسفات الصوديوم للثقافات بين عشية وضحاها أو 0.2 مليون متر فوسفات الصوديوم لوضع العلامات موحدة مع 32P ، 0.2٪ ا...

<ol>
	<li>Cashel, M., Gentry, D., Hernandez, V., Vinella, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stringent+Response.">The stringent Response.</a> Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology. , 1458-1489 (1996).</li><li>Magnusson, L. U., Farewell, A., Nystr&#246;m, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp:+a+global+regulator+in+Escherichia+coli.">ppGpp: a global regulator in Escherichia coli.</a> Trends in Microbiology. 13 (5), 236-242 (2005).</li><li>Cashel, M., Gallant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Compounds+implicated+in+the+Function+of+the+RC+Gene+of+Escherichia+coli.">Two Compounds implicated in the Function of the RC Gene of Escherichia coli.</a> Nature. 221 (5183), 838-841 (1969).</li><li>Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+horizons+for+(p)ppGpp+in+bacterial+and+plant+physiology.">New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology.</a> Trends in Microbiology. 14 (1), 45-54 (2006).</li><li>Atkinson, G. C., Tenson, T., Hauryliuk, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RelA/SpoT+homolog+(RSH)+superfamily:+distribution+and+functional+evolution+of+ppGpp+synthetases+and+hydrolases+across+the+tree+of+life.">The RelA/SpoT homolog (RSH) superfamily: distribution and functional evolution of ppGpp synthetases and hydrolases across the tree of life.</a> PloS One. 6 (8), e23479 (2011).</li><li>Mechold, U., Potrykus, K., Murphy, H., Murakami, K. S., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+by+ppGpp+versus+pppGpp+in+Escherichia+coli.">Differential regulation by ppGpp versus pppGpp in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 41 (12), 6175-6189 (2013).</li><li>Molodtsov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+Effector+ppGpp+Potentiates+the+Inhibition+of+Transcript+Initiation+by+DksA.">Allosteric Effector ppGpp Potentiates the Inhibition of Transcript Initiation by DksA.</a> Molecular Cell. 69 (5), 828-839 (2018).</li><li>Ross, W., Sanchez-Vazquez, P., Chen, A. Y. Y., Lee, J. -. H. H., Burgos, H. L. L., Gourse, R. L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp+Binding+to+a+Site+at+the+RNAP-DksA+Interface+Accounts+for+Its+Dramatic+Effects+on+Transcription+Initiation+during+the+Stringent+Response.">ppGpp Binding to a Site at the RNAP-DksA Interface Accounts for Its Dramatic Effects on Transcription Initiation during the Stringent Response.</a> Molecular Cell. 62 (6), 811-823 (2016).</li><li>Kriel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Regulation+of+GTP+Homeostasis+by+(p)ppGpp:+A+Critical+Component+of+Viability+and+Stress+Resistance.">Direct Regulation of GTP Homeostasis by (p)ppGpp: A Critical Component of Viability and Stress Resistance.</a> Molecular Cell. 48 (2), 231-241 (2012).</li><li>Kriel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTP+dysregulation+in+Bacillus+subtilis+cells+lacking+(p)ppGpp+results+in+phenotypic+amino+acid+auxotrophy+and+failure+to+adapt+to+nutrient+downshift+and+regulate+biosynthesis+genes.">GTP dysregulation in Bacillus subtilis cells lacking (p)ppGpp results in phenotypic amino acid auxotrophy and failure to adapt to nutrient downshift and regulate biosynthesis genes.</a> Journal of Bacteriology. 196 (1), 189-201 (2014).</li><li>Potrykus, K., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p)ppGpp:+still+magical.">p)ppGpp: still magical.</a> Annual Review of Microbiology. 62, 35-51 (2008).</li><li>Hauryliuk, V., Atkinson, G. C., Murakami, K. S., Tenson, T., Gerdes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+functional+insights+into+the+role+of+(p)ppGpp+in+bacterial+physiology.">Recent functional insights into the role of (p)ppGpp in bacterial physiology.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (5), 298-309 (2015).</li><li>Arenz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stringent+factor+RelA+adopts+an+open+conformation+on+the+ribosome+to+stimulate+ppGpp+synthesis.">The stringent factor RelA adopts an open conformation on the ribosome to stimulate ppGpp synthesis.</a> Nucleic Acids Research. 44 (13), 6471-6481 (2016).</li><li>Loveland, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome&#8226;RelA+structures+reveal+the+mechanism+of+stringent+response+activation.">Ribosome&#8226;RelA structures reveal the mechanism of stringent response activation.</a> eLife. 5, e17029 (2016).</li><li>Brown, A., Fern&#225;ndez, I. S., Gordiyenko, Y., Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome-dependent+activation+of+stringent+control.">Ribosome-dependent activation of stringent control.</a> Nature. 534 (7606), 277-280 (2016).</li><li>Battesti, A., Bouveret, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acyl+carrier+protein/SpoT+interaction,+the+switch+linking+SpoT-dependent+stress+response+to+fatty+acid+metabolism.">Acyl carrier protein/SpoT interaction, the switch linking SpoT-dependent stress response to fatty acid metabolism.</a> Molecular Microbiology. 62 (4), 1048-1063 (2006).</li><li>Lee, J. -. W., Park, Y. -. H., Seok, Y. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rsd+balances+(p)ppGpp+level+by+stimulating+the+hydrolase+activity+of+SpoT+during+carbon+source+downshift+in+Escherichia+coli.">Rsd balances (p)ppGpp level by stimulating the hydrolase activity of SpoT during carbon source downshift in Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (29), E6845-E6854 (2018).</li><li>Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+(p)ppGpp+Accumulation+Patterns+in+Escherichia+coli+mutants.">Detection of (p)ppGpp Accumulation Patterns in Escherichia coli mutants.</a> Molecular Microbiology Techniques. 3, 341-356 (1994).</li><li>Fern&#225;ndez-Coll, L., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+SpoT+Hydrolase,+SpoT+Synthetase,+and+RelA+Synthetase+to+Carbon+Source+Diauxic+Growth+Transitions+in+Escherichia+coli.">Contributions of SpoT Hydrolase, SpoT Synthetase, and RelA Synthetase to Carbon Source Diauxic Growth Transitions in Escherichia coli.</a> Frontiers in Microbiology. , (2018).</li><li>Varik, V., Oliveira, S. R. A., Hauryliuk, V., Tenson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPLC-based+quantification+of+bacterial+housekeeping+nucleotides+and+alarmone+messengers+ppGpp+and+pppGpp.">HPLC-based quantification of bacterial housekeeping nucleotides and alarmone messengers ppGpp and pppGpp.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11022 (2017).</li><li>Rhee, H. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Fluorescent+Chemosensor+for+the+Bacterial+Alarmone+(p)ppGpp.">Selective Fluorescent Chemosensor for the Bacterial Alarmone (p)ppGpp.</a> J. Am. Chem. Soc. 130 (3), 784-785 (2008).</li><li>Wang, J., Chen, W., Liu, X., Wesdemiotis, C., Pang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mononuclear+Zinc+Complex+for+Selective+Detection+of+Diphosphate+via+Fluorescence+ESIPT+Turn-On.">A Mononuclear Zinc Complex for Selective Detection of Diphosphate via Fluorescence ESIPT Turn-On.</a> Journal of Materials Chemistry B. 2 (21), 3349-3354 (2014).</li><li>Pokhilko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+nutrient+limitation+in+growing+E.+coli:+a+mathematical+model+of+a+ppGpp-based+biosensor.">Monitoring of nutrient limitation in growing E. coli: a mathematical model of a ppGpp-based biosensor.</a> BMC Systems Biology. 11 (1), 106 (2017).</li><li>Funabashi, H., Mie, M., Yanagida, Y., Kobatake, E., Aizawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+monitoring+of+cellular+physiological+status+depending+on+the+accumulation+of+ppGpp.">Fluorescent monitoring of cellular physiological status depending on the accumulation of ppGpp.</a> Biotechnology Letters. 24 (4), 269-273 (2002).</li><li>Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+medium+for+enterobacteria.">Culture medium for enterobacteria.</a> Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Peselis, A., Serganov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ykkC+riboswitches+employ+an+add-on+helix+to+adjust+specificity+for+polyanionic+ligands.">ykkC riboswitches employ an add-on helix to adjust specificity for polyanionic ligands.</a> Nature Chemical Biology. 14 (9), 887-894 (2018).</li><li>Oki, T., Yoshimoto, A., Sato, S., Takamatsu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purine+nucleotide+pyrophosphotransferase+from+Streptomyces+morookaensis,+capable+of+synthesizing+pppApp+and+pppGpp.">Purine nucleotide pyrophosphotransferase from Streptomyces morookaensis, capable of synthesizing pppApp and pppGpp.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology. 410 (2), 262-272 (1975).</li><li>Travers, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppApp+alters+transcriptional+selectivity+of+Escherichia+coli+RNA+polymerase.">ppApp alters transcriptional selectivity of Escherichia coli RNA polymerase.</a> FEBS Letters. 94 (2), 345-348 (1978).</li><li>Bruhn-Olszewska, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+comparisons+of+(p)ppApp+vs+(p)ppGpp+for+Escherichia+coli+RNA+polymerase+binding+sites+and+for+rrnB+P1+promoter+regulatory+responses+in+vitro.">Structure-function comparisons of (p)ppApp vs (p)ppGpp for Escherichia coli RNA polymerase binding sites and for rrnB P1 promoter regulatory responses in vitro.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms. 1861 (8), 731-742 (2018).</li></ol>

تحقيق وضع العلامات شبه موحدة من الخلايا هو خطوة حاسمة لهذا البروتوكول. ولذلك، فإن استخدام وسائط محددة، مثل وسائط الوسائط الخاصة بوزارة الأشغال العامة أو وسائط Tris، أمر بالغ الأهمية للسماح بتباين تركيزات الفوسفات الناقل ونشاط محدد. لا يمكن استخدام الوسائط المخزنة بالفوسفات، مثل M9 أو الوسا...

و (ع) ppGpp رسول الثاني هو منظم العالمية التي تعدل التعبير عن عدد كبير من الجينات، بما في ذلك الجينات لتوليف الريبوسوم والأحماض الأمينية1،2. على الرغم من اكتشافها في البداية في الإشريكيةالقولونية3، (ع) ppGpp يمكن العثور عليها في كل من البكتيريا إيجابية غرام وغرام السلبية وكذلك في الكلوروبلاست النبات4،5. بالنسبة للكولاي والبكتيريا السلبية الجرام الأخرى، (ع)ppGpp يتفاعل مباشرة مع بوليميراز RNA في موقعين مختلفين6و7و8. في إيجابيات غرام، (ع) ppGpp يمنع وفرة GTP، الذي يشعر به CodY، وهو بروتين GTP ملزمةمع زخارف التعرف الحمض النووي محددة الجينات التي تؤدي إلى اللائحة 9،10. (ع)ppGpp يتراكم استجابة لتجويع لمختلف المواد الغذائية وظروف الإجهاد، مما أدى إلى بطء النمو والتعديلات في التعبير الجيني للسماح التكيف مع الإجهاد11،12.
ويعكس المبلغ الصافي للجزء المتراكم من الـ ppgpp التوازن بين أنشطة السينثتاز والزراعة المائية. في E. القولونية RelA هو synthetase قوية وSpoT ثنائية الوظائف، مع هيدرولاز قوية وsynthetase ضعيفة، كل منها قد تنظم بشكل مختلف بطريقة تعتمد على الإجهاد. يتم تنشيط synthetase RelA قوية عندما توافر codon-specified اتهم tRNA ملزمة لموقع ريبوسومال A عندما يفشل في مواكبة متطلبات تخليق البروتين13,14,15. يتم تنشيط SpoT ضعيفة (ع) ppGpp synthetase في حين أن قوية (ع) ppPp hydrolase يتم تثبيط استجابة لظروف الإجهاد الأخرى ومن خلال آليات أخرى. في بعض الظروف، يمكن ربط البروتينات مثل ACP أو Rsd إلى SpoT، والتي تغير أيضا التوازن بين التحلل المائي والتوليف16،17. في إيجابيات غرام, التوليف والتحلل المائي تعكس توازنا أكثر تعقيدا بين واحد RelA SpoT التجانس (RSH) البروتين مع تخليق قوي وأنشطة التحلل المائي، فضلا عن الهيدرولاس أصغر و / أو synthetases12.
تم اكتشاف النيوكليوتيدات (ع) ppGpp لأول مرة على أنها غير عادية 32P وصفت البقع التي ظهرت على autoradiograms من طبقة رقيقة من الكروماtoغرام (TLC) خلال استجابة صارمة الناجمة عن تجويع الأحماض الأمينية3. تم استعراض بروتوكولات وضع العلامات الأكثر تفصيلاً 18. البروتوكول الموصوف هنا (الشكل 1) هو تعديل لهذه البروتوكولات التي تسمح برصد نمو عينات متعددة على لوحات ميكروتيدر. وهذا يسهل التقديرات البيولوجية والتقنية المتعددة للتغيرات وفرة ppGpp وقد وضعت في البداية لدراسات التحولات ثنائي ة19. كما يسمح وضع العلامات على (ع) ppGpp مع 32P والكشف عن طريق TLC قياسات (ع) معدلات التحلل ppGpp. وقد وضعت أساليب بديلة لتحديد (ع) مستويات ppGpp مثل قياس الطيف الكتلي، HPLC20،أجهزة الاستشعار الكيميائية الفلورسنت21،22،وGFP الانصهارات الجينية للمروّجين المتضررين من ppGpp23، 24.أجهزة الاستشعار الكيميائية الفلورسنت لديها حاليا استخدام محدود بسبب التحولات الطيفية الصغيرة بعد ربط ppGpp وكذلك المشاكل التي تميز بين ppGpp وpppGpp21. هذه الطريقة هي فعالة للكشف عن (ع) ppGpp في المختبر، ولكن ليس في مقتطفات الخلوية. وقد تم تحسين الأساليب التي تنطوي على HPLC20 ولكن تتطلب معدات باهظة الثمن وغير مكيفة بشكل جيد لعالية من خلال وضع. وأخيرا، يمكن أن تعطي الانصهارGFG تقديرا للتنشيط تعتمد ppGpp أو تثبيط، ولكن لا تقيس ppGpp نفسها. وفي حين أن كل طريقة من هذه الطرق البديلة قيمة، فإنها تتطلب معدات باهظة الثمن أو معدات عملية كبيرة في الوقت المحدد، أو أنها غير قابلة لأخذ العينات الحركية المتعددة والمعالجة اللاحقة. مع الطريقة الموضحة هنا، يمكن تطبيق 96 عينة على ست لوحات TLC في حوالي 20 دقيقة (18 عينة لكل لوحة)، حلها عن طريق تطوير TLC في أقل من بضع ساعات، مع البيانات الكمية التي تم الحصول عليها بعد عدة ساعات أو بين عشية وضحاها، اعتمادا على وضع العلامات كثافه.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(NH4)6(MO7)24</td>
			<td>Fisher Scientifics</td>
			<td>A-674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoradiography film</td>
			<td>Denville scientific inc.</td>
			<td>E3218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>1-1309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>RPI</td>
			<td>C61000-25.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2</td>
			<td>Fisher Scientifics</td>
			<td>C-371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>1843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4</td>
			<td>Fisher Scientifics</td>
			<td>I-146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Fisher Biotech</td>
			<td>BP1215-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Macron</td>
			<td>4912-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO4</td>
			<td>Macron</td>
			<td>2549-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3PO4</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>0260-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2SO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9458-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Biotech</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Valine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V-6504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher Scientifics</td>
			<td>FL-06-0303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader Synergy HT</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-9522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1254-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>7892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>3624-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>7917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0171-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-32 radionuclide, orthophosphoric acid in 1 mL water (5 mCi)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEX053005MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage phosphor screen</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>So230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-4625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC PEI Cellulose F</td>
			<td>Merk-Millipore</td>
			<td>1.05579.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine</td>
			<td>RPI</td>
			<td>T2400-500.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon 9400 imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4</td>
			<td>Fisher Scientifics</td>
			<td>Z-68</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using microtiter dish radiolabeling for multiple in vivo measurements of escherichia coli (p)ppgpp followed by thin layer chromatography

يعمل النيوكليوتيد (p)pppp كمنظم عالمي في البكتيريا استجابة لمجموعة متنوعة من الإجهاد البدني والتغذوي. فقد بداية سريعة، في ثوان، مما يؤدي إلى تراكم المستويات التي تقترب أو تتجاوز تلك برك GTP. عكس الإجهاد مناسبات اختفاء سريع من (ع) ppGpp، في كثير من الأحيان مع نصف عمر أقل من دقيقة. وجود (ع) ppGpp يؤدي إلى تغييرات في التعبير الجيني الخلوي والتمثيل الغذائي التي تتصدى للآثار الضارة للإجهاد. البكتيريا السالبة للجرام وإيجابية الجرام لها آليات استجابة مختلفة، ولكن كلاهما يعتمد على تركيز (p)ppGpp. وعلى أية حال، هناك حاجة إلى مراقبة العديد من الثقافات البكتيرية ذات العلامات الإشعاعية في وقت واحد على فترات زمنية قد تختلف من 10 ثوان إلى ساعات خلال فترات انتقال الإجهاد الحرجة. ويعالج هذا البروتوكول هذا التحدي التقني. وتستفيد هذه الطريقة من حاضنات الأطباق الميكروتيتر التي تسيطر عليها درجة الحرارة والهزاز التي تسمح بالرصد الموازي للنمو (الامتصاص) وأخذ العينات السريعة من الثقافات ذات العلامات الإشعاعية الموحدة للفوسفات لحل وكمية برك النيوكليوتيدات عن طريق طبقة رقيقة من اللوني على جزيرة الأمير إدوارد السليلوز. وهناك حاجة إلى كميات صغيرة من العينات لإجراء نسخ تقني وبيولوجي متعدد للتحليلات. ويمكن تقييم التحولات المعقدة في النمو، مثل النمو الديوليك ومعدلات دوران الـ ppG(pp) السريعة من الناحية الكمية بهذه الطريقة.

في سلالات E. القولونية K-12 ، فإن إضافة الفالين يثير تجويع ًا داخليًا للإيزوليوسين ، مما يؤدي إلى زيادة مستويات ppGpp بعد 5 دقائق3. تم تسمية الخلايا المزروعة في MOPS التي تحتوي على جميع الأحماض الأمينية باستثناء ILV مع 32P كما هو مبين في الشكل 1. وبمجرد وضع ا?...

Watch this Scientific Journal Video about Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli pppGpp Followed by Thin Layer Chromatography at JoVE.com

Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli pppGpp Followed by Thin Layer Chromatography

نمو الثقافات البكتيرية ذات العلامات الإشعاعية في أطباق ميكروتيدر يسهل أخذ العينات الإنتاجية العالية التي تسمح اختبارات تكرار متعددة التقنية والبيولوجية من وفرة تجمع النيوكليوتيد، بما في ذلك أن (ع) ppGpp. ويمكن رصد آثار تحولات النمو الناجمة عن مصادر الإجهاد الفسيولوجي وكذلك الانتعاش من الإجهاد.

استخدام الميكروتيدر طبق الوسم الإشعاعي لقياسات متعددة في الجسم من الإشريكية القولونية (ع) ppGpp تليها طبقة رقيقة اللوني

The (p)ppGpp nucleotide functions as a global regulator in bacteria in response to a variety of physical and nutritional stress. It has a rapid onset, in ...

هذه الطريقة تقيس مستويات منظم عالمي ppGpp في ظل ظروف النمو المختلفة وحالات الإجهاد. يمكن العثور على PpGpp في البكتيريا الإيجابية والسلبية غرام، وكذلك في chloroplast. PpGpp لديه بداية سريعة في ثوان، مما يؤدي إلى علاقة ثانية سريعة بمجرد إنتاج الإجهاد.في الوقت نفسه، لديها نصف عمر قصيرة، تصل إلى 30 ثانية. لذلك، هناك حاجة لمراقبة العديد من الثقافة في فترات زمنية قد تختلف من 10 ثانية إلى ساعات، بما في ذلك انتقالات التشديد. نحن أيضا الثقافات البكتيرية radiolabel في أطباق microtiter يسهل أخذ عينات عالية الإنتاجية التي تسمح تكرارات تقنية وبيولوجية متعددة.تأكد من اتباع تدابير السلامة المناسبة عند العمل مع المواد المشعة. لبدء هذا الإجراء، قم بإعداد كافة الوسائط كما هو موضح في بروتوكول النص. تنمو بين عشية وضحاها الثقافات في وسائل الإعلام MOPS مع ثلاثة ملليمولار فوسفات الصوديوم.إضافة 550 ميكرولترات من وسائل الإعلام MOPS، contining 0.2 ناقلة فوسفات الصوديوم ميكرومولار و 30 ميكرولترات من كل inoculum البكتيرية إلى آبار 24 لوحة بئر. وهذا سيؤدي إلى تلقيح أولي مع OD600 من 0.1. إضافة وسائط جديدة إلى واحد وكذلك التحكم في العقم.ضع الطبق في حاضنة اهتزاز عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، واهتز عند 900 لفة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة. يمكن رصد النمو باستخدام قارئ لوحة مع لوحة تكرار بالتوازي في وسائل الإعلام تفتقر P32 باستخدام قارئ لوحة في حين احتضان في ظل نفس الظروف. بعد ذلك، إضافة 100 microcuries من p32 أوفوسفات إلى كل بئر من لوحة.تنمو الثقافات في حاضنة تهتز لمدة 1-2 doublings للسماح للتسمية الخارجية لتكواز إلى حد كبير مع برك النيوكليوتيدات بين الخلايا. للتصور الصحيح، لم يتم استخدام أي من المواد النشطة في هذا الفيديو. في تجربة حقيقية، مطلوب التدريع السليم، فضلا عن الرصد المستمر للتلوث مع مقياس المسح.أولاً، الحث على الإجهاد باستخدام طريقة مناسبة لهذا النوع من الإجهاد المدروس. بعد ذلك، أضف 20 ميكرولترات من كل عينة خلية تحمل علامة إلى أنبوب PCR منفصل 0.2 ملليلتر، يحتوي على 20 ميكرولترات من حمض الجليد البارد ستة حمض الفضور. ضع العينات على الفور على الجليد الجاف.تعزيز كفاءة استخراج الخلوية من قبل ثلاث دورات من التجميد والذوبان. قبل اكتشاف PEI السليلوز رقيقة طبقة الكروماتوغراف، وأجهزة الطرد المركزي العينات لمدة دقيقة واحدة في السرعة القصوى ل بيليه خلية الحطام. أولا، المنصوص عليها 20 في 20 سم PEI السليلوز TLC لوحة.استخدام مقص لإزالة أعلى خمسة سنتيمترات. واستخدم قلم رصاص ناعم لوضع علامة على خط أصل سنتيمتر واحد من الحافة. تطبيق 5 ميكرولتر قطرات من كل عينة على سطح PEI.قبل أن يمكن أن يجف البقعة، نقل لوحة إلى خزان يحتوي على طبقة من 1.5 فوسفات أحادي بوتداسيوم المولر التي هي ضحلة بما يكفي لا للمس بقعة عينة الأصل. غطي الخزان بختم محكم، واتّسم بالصعود السائل إلى أعلى الورقة المشذبة التي يبلغ طولها 15 سنتيمترًا. بعد ذلك، قم بإزالة الكروماتوغرافية المطورة بالكامل وجففه الهواء في درجة حرارة الغرفة.قطع والتخلص من الجزء العلوي من الكروماتوغرام التي تحتوي على P32 الحرة إلى النفايات المشعة. استخدام شاشة الفوسفور لفضح الأفلام السمعية اديوغرافية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، قم بتطوير الفيلم واستخدم صورة فوسفورية لالتقاط وكميات الإشارة الخضراء للفوسفور.ثم، استخدم برنامج ImageJ لكميات البقع المشعة. بعد إثارة الإجهاد أو المجاعة لوقت كاف للسماح ppGpp تراكم، واستخدام طريقة مناسبة لعكس الإجهاد. أخذ العينات كل 20 إلى 30 ثانية لمدة تصل إلى دقيقتين ومعالجة العينات كما هو موضح سابقا.بمجرد تطوير TLC ، ويتم الحصول على مستويات ppGpp خلال الدورة الزمنية ، قم برسم محتوى ppGpp المتبقي على مؤامرة semilogarithmic مقابل الوقت. في هذه الدراسة، وتوصف الخلايا التي تزرع في MOPS تحتوي على جميع الأحماض الأمينية باستثناء ILV مع P32. مرة واحدة وصفت، L فالين يضاف لإنتاج تجويع isoleucine.بعد خمس دقائق، حدثت زيادة قديمة اثنين واثنين ونصف في مستويات رباعية وخمات فوسفات من جوانوسين. يتم استخدام التحكم السلبي في عينة خالية من الخلايا المسماة للكشف عن المركبات المحتملة التي لا تُستخدم في مصدر P32. يمكن أن يتحقق عكس تجويع الليسوليوسين من قبل الكلوراففينيكولول، وهو مثبط تخليق البروتين، مما يقلل من استهلاك الحمض النووي الريبي المشحون، وبدوره، يعيد نسب عالية من مشحونة إلى trna غير مشحونة.يتم إلغاء تنشيط ppGpp synthetase قوية بوساطة rela، مما يسمح بمقياس لتحلل ppGpp غير مُنَقَّط بالتوليف المتبقي. في هذه الحالة، ينحل ppGpp مع نصف عمر حوالي 64 ثانية. من المهم أن ندع الخلايا تنمو لبضعة أجيال لتحقيق وضع العلامات موحدة قبل الحث على أي الإجهاد أو المجاعة.لأن ppGpp ينتشر على نطاق واسع بين البكتيريا، يمكن تطبيق هذه الطريقة على الكائنات الحية الأخرى. ويمكن أن يسمح تعديل طريقة تطوير TLC بالفصل السليم بين جميع النيوكليوتيدات التنظيمية، مثل ppApp. P52 هو أفضل النظائر الباعثة، لذلك من المهم استخدام التدريع السليم والتخلص بشكل صحيح من أي بقايا.

Research

JoVE Journal

Biology

Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli (p)ppGpp Followed by Thin Layer Chromatography

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI تحضير العينة : الترا أسلوب طبقة رقيقة

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

على الفحص لقياس نشاط القولونية محرض يسين Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC)

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography TLC Coupled with Gas-Liquid Chromatography GLC

Arabidopsis thaliana التنميط Glycerolipid القطبية التي اللوني طبقة رقيقة (TLC) اقترن اللوني الغاز السائل (GLC)

Biological membranes separate cells from the environment. From a single cell to multicellular plants and animals, glycerolipids, such as ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

ارتفاع المناولة فحص النشاط Endoglucanase الفطرية في القولونية</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

في الإلتقام الكبد المجراة تلاه تنقية خلايا الكبد الكبد الإرواء

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood.  The basic architecture of the liver is illustrated in ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

رسم خرائط الشبكات الوظيفية البكتيرية والممرات في<em&gt; كولاي</em&gt; استخدام المصفوفات الوراثية الاصطناعية

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

بروتوكول السريع لإعداد Electrocompetent<em&gt; كولاي</em&gt; و<em&gt; ضمة الكوليرا</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

الكشف عن لايف<em&gt; كولاي</em&gt; O157: H7 من قبل خلايا PMA-QPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

في فيفو تتبع 4 الأبعاد للالجذعية المكونة للدم والسلف الكبار في خلايا الفأر قبي نخاع العظم

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

فوائد متعددة الأوجه من البروتين المشارك في التعبير<em&gt; الإشريكية القولونية</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...