Name: using microtiter dish radiolabeling for multiple in vivo measurements of escherichia coli (p)ppgpp followed by thin layer chromatography
Uploaded: 2019-06-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli pppGpp Followed by Thin Layer Chromatography at JoVE.com

Denne forskning blev støttet Intramural Research program, Eunice Kennedy Shriver National Institute for Child Health og Human Development, NIH.

1. forberedelse af medierne
<ol><li>
For MOPS (3-(N-morpholino) propansulfonsyre) Media25, brug 1/10 volumen af 10X Mops salte, 1/100 volumen af 100x mikronæringsstoffer opløsning, 3 mm natriumfosfat til overnight kulturer eller 0,2 mm natriumfosfat til ensartet mærkning med 32P, 0,2% glucose og 1 μg/mL thiamin (vitamin B1). Tilsæt aminosyrer ved 40 μg/mL, hvis det er nødvendigt.
	<ol>
<li>For MOPS salte, brug 400 mM MOPS, 40 mM Tricine, 0,1 mM FeSO4...

<ol>
	<li>Cashel, M., Gentry, D., Hernandez, V., Vinella, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stringent+Response.">The stringent Response.</a> Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology. , 1458-1489 (1996).</li><li>Magnusson, L. U., Farewell, A., Nystr&#246;m, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp:+a+global+regulator+in+Escherichia+coli.">ppGpp: a global regulator in Escherichia coli.</a> Trends in Microbiology. 13 (5), 236-242 (2005).</li><li>Cashel, M., Gallant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Compounds+implicated+in+the+Function+of+the+RC+Gene+of+Escherichia+coli.">Two Compounds implicated in the Function of the RC Gene of Escherichia coli.</a> Nature. 221 (5183), 838-841 (1969).</li><li>Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+horizons+for+(p)ppGpp+in+bacterial+and+plant+physiology.">New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology.</a> Trends in Microbiology. 14 (1), 45-54 (2006).</li><li>Atkinson, G. C., Tenson, T., Hauryliuk, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RelA/SpoT+homolog+(RSH)+superfamily:+distribution+and+functional+evolution+of+ppGpp+synthetases+and+hydrolases+across+the+tree+of+life.">The RelA/SpoT homolog (RSH) superfamily: distribution and functional evolution of ppGpp synthetases and hydrolases across the tree of life.</a> PloS One. 6 (8), e23479 (2011).</li><li>Mechold, U., Potrykus, K., Murphy, H., Murakami, K. S., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+by+ppGpp+versus+pppGpp+in+Escherichia+coli.">Differential regulation by ppGpp versus pppGpp in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 41 (12), 6175-6189 (2013).</li><li>Molodtsov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+Effector+ppGpp+Potentiates+the+Inhibition+of+Transcript+Initiation+by+DksA.">Allosteric Effector ppGpp Potentiates the Inhibition of Transcript Initiation by DksA.</a> Molecular Cell. 69 (5), 828-839 (2018).</li><li>Ross, W., Sanchez-Vazquez, P., Chen, A. Y. Y., Lee, J. -. H. H., Burgos, H. L. L., Gourse, R. L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp+Binding+to+a+Site+at+the+RNAP-DksA+Interface+Accounts+for+Its+Dramatic+Effects+on+Transcription+Initiation+during+the+Stringent+Response.">ppGpp Binding to a Site at the RNAP-DksA Interface Accounts for Its Dramatic Effects on Transcription Initiation during the Stringent Response.</a> Molecular Cell. 62 (6), 811-823 (2016).</li><li>Kriel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Regulation+of+GTP+Homeostasis+by+(p)ppGpp:+A+Critical+Component+of+Viability+and+Stress+Resistance.">Direct Regulation of GTP Homeostasis by (p)ppGpp: A Critical Component of Viability and Stress Resistance.</a> Molecular Cell. 48 (2), 231-241 (2012).</li><li>Kriel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTP+dysregulation+in+Bacillus+subtilis+cells+lacking+(p)ppGpp+results+in+phenotypic+amino+acid+auxotrophy+and+failure+to+adapt+to+nutrient+downshift+and+regulate+biosynthesis+genes.">GTP dysregulation in Bacillus subtilis cells lacking (p)ppGpp results in phenotypic amino acid auxotrophy and failure to adapt to nutrient downshift and regulate biosynthesis genes.</a> Journal of Bacteriology. 196 (1), 189-201 (2014).</li><li>Potrykus, K., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p)ppGpp:+still+magical.">p)ppGpp: still magical.</a> Annual Review of Microbiology. 62, 35-51 (2008).</li><li>Hauryliuk, V., Atkinson, G. C., Murakami, K. S., Tenson, T., Gerdes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+functional+insights+into+the+role+of+(p)ppGpp+in+bacterial+physiology.">Recent functional insights into the role of (p)ppGpp in bacterial physiology.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (5), 298-309 (2015).</li><li>Arenz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stringent+factor+RelA+adopts+an+open+conformation+on+the+ribosome+to+stimulate+ppGpp+synthesis.">The stringent factor RelA adopts an open conformation on the ribosome to stimulate ppGpp synthesis.</a> Nucleic Acids Research. 44 (13), 6471-6481 (2016).</li><li>Loveland, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome&#8226;RelA+structures+reveal+the+mechanism+of+stringent+response+activation.">Ribosome&#8226;RelA structures reveal the mechanism of stringent response activation.</a> eLife. 5, e17029 (2016).</li><li>Brown, A., Fern&#225;ndez, I. S., Gordiyenko, Y., Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome-dependent+activation+of+stringent+control.">Ribosome-dependent activation of stringent control.</a> Nature. 534 (7606), 277-280 (2016).</li><li>Battesti, A., Bouveret, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acyl+carrier+protein/SpoT+interaction,+the+switch+linking+SpoT-dependent+stress+response+to+fatty+acid+metabolism.">Acyl carrier protein/SpoT interaction, the switch linking SpoT-dependent stress response to fatty acid metabolism.</a> Molecular Microbiology. 62 (4), 1048-1063 (2006).</li><li>Lee, J. -. W., Park, Y. -. H., Seok, Y. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rsd+balances+(p)ppGpp+level+by+stimulating+the+hydrolase+activity+of+SpoT+during+carbon+source+downshift+in+Escherichia+coli.">Rsd balances (p)ppGpp level by stimulating the hydrolase activity of SpoT during carbon source downshift in Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (29), E6845-E6854 (2018).</li><li>Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+(p)ppGpp+Accumulation+Patterns+in+Escherichia+coli+mutants.">Detection of (p)ppGpp Accumulation Patterns in Escherichia coli mutants.</a> Molecular Microbiology Techniques. 3, 341-356 (1994).</li><li>Fern&#225;ndez-Coll, L., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+SpoT+Hydrolase,+SpoT+Synthetase,+and+RelA+Synthetase+to+Carbon+Source+Diauxic+Growth+Transitions+in+Escherichia+coli.">Contributions of SpoT Hydrolase, SpoT Synthetase, and RelA Synthetase to Carbon Source Diauxic Growth Transitions in Escherichia coli.</a> Frontiers in Microbiology. , (2018).</li><li>Varik, V., Oliveira, S. R. A., Hauryliuk, V., Tenson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPLC-based+quantification+of+bacterial+housekeeping+nucleotides+and+alarmone+messengers+ppGpp+and+pppGpp.">HPLC-based quantification of bacterial housekeeping nucleotides and alarmone messengers ppGpp and pppGpp.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11022 (2017).</li><li>Rhee, H. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Fluorescent+Chemosensor+for+the+Bacterial+Alarmone+(p)ppGpp.">Selective Fluorescent Chemosensor for the Bacterial Alarmone (p)ppGpp.</a> J. Am. Chem. Soc. 130 (3), 784-785 (2008).</li><li>Wang, J., Chen, W., Liu, X., Wesdemiotis, C., Pang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mononuclear+Zinc+Complex+for+Selective+Detection+of+Diphosphate+via+Fluorescence+ESIPT+Turn-On.">A Mononuclear Zinc Complex for Selective Detection of Diphosphate via Fluorescence ESIPT Turn-On.</a> Journal of Materials Chemistry B. 2 (21), 3349-3354 (2014).</li><li>Pokhilko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+nutrient+limitation+in+growing+E.+coli:+a+mathematical+model+of+a+ppGpp-based+biosensor.">Monitoring of nutrient limitation in growing E. coli: a mathematical model of a ppGpp-based biosensor.</a> BMC Systems Biology. 11 (1), 106 (2017).</li><li>Funabashi, H., Mie, M., Yanagida, Y., Kobatake, E., Aizawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+monitoring+of+cellular+physiological+status+depending+on+the+accumulation+of+ppGpp.">Fluorescent monitoring of cellular physiological status depending on the accumulation of ppGpp.</a> Biotechnology Letters. 24 (4), 269-273 (2002).</li><li>Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+medium+for+enterobacteria.">Culture medium for enterobacteria.</a> Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Peselis, A., Serganov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ykkC+riboswitches+employ+an+add-on+helix+to+adjust+specificity+for+polyanionic+ligands.">ykkC riboswitches employ an add-on helix to adjust specificity for polyanionic ligands.</a> Nature Chemical Biology. 14 (9), 887-894 (2018).</li><li>Oki, T., Yoshimoto, A., Sato, S., Takamatsu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purine+nucleotide+pyrophosphotransferase+from+Streptomyces+morookaensis,+capable+of+synthesizing+pppApp+and+pppGpp.">Purine nucleotide pyrophosphotransferase from Streptomyces morookaensis, capable of synthesizing pppApp and pppGpp.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology. 410 (2), 262-272 (1975).</li><li>Travers, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppApp+alters+transcriptional+selectivity+of+Escherichia+coli+RNA+polymerase.">ppApp alters transcriptional selectivity of Escherichia coli RNA polymerase.</a> FEBS Letters. 94 (2), 345-348 (1978).</li><li>Bruhn-Olszewska, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+comparisons+of+(p)ppApp+vs+(p)ppGpp+for+Escherichia+coli+RNA+polymerase+binding+sites+and+for+rrnB+P1+promoter+regulatory+responses+in+vitro.">Structure-function comparisons of (p)ppApp vs (p)ppGpp for Escherichia coli RNA polymerase binding sites and for rrnB P1 promoter regulatory responses in vitro.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms. 1861 (8), 731-742 (2018).</li></ol>

Opnåelse nær ensartet mærkning af cellerne er et afgørende skridt for denne protokol. Derfor er brugen af definerede medier, såsom MOPS eller Tris Media, afgørende for at muliggøre variation af bærers fosfat koncentrationer og specifik aktivitet. Fosfat bufferet medie, såsom M9 eller Media A, kan ikke bruges. De fleste udefineret medier indeholder variable mængder fosfat, såsom LB, trypton og casamino syrer. Fosfat isotop 33p er en svagere udleder, der kan erstattes af 32p. fordelene ved ...

Den (p) ppgpp anden Messenger er en global regulator, der modulerer ekspression af et stort antal gener, herunder gener for syntetisere ribosomer og aminosyrer1,2. Selv om det oprindeligt blev opdaget i Escherichia coli3, (p) ppgpp kan findes i både grampositive og gramnegative bakterier samt i plante chloroplaster4,5. For E. coli og andre gram-negative bakterier, (p) ppgpp interagerer direkte med RNA polymerase på to forskellige steder6,7,8. I gram positiver, (p) ppgpp hæmmer GTP overflod, som er fornemmede af CodY, en GTP-binding protein med gen-specifikke DNA-genkendelse motiver, der fører til regel9,10. p) ppgpp akkumuleres som reaktion på hungersnød for forskellige næringsstoffer og stressforhold, hvilket resulterer i langsom vækst og justeringer af genekspression for at muliggøre tilpasning til stress11,12.
Nettomængden af akkumuleret ppGpp afspejler en balance mellem syntetase-og hydrolase aktiviteter. I E. coli RelA er en stærk syntetase og SpoT er bifunktionel, med en stærk hydrolase og en svag syntetase, som hver især kan reguleres forskelligt på en stress afhængig måde. Den stærke RelA-syntetase aktiveres, når tilgængeligheden af codon-specificerede ladede tRNA bundet til ribosomale et sted, når det undlader at holde trit med kravene i proteinsyntese13,14,15. Den svage SpoT (p) ppgpp syntetase er aktiveret, mens den stærke (p) ppgpp hydrolase er hæmmet som reaktion på andre stress betingelser og gennem andre mekanismer. Under visse omstændigheder kan proteiner som ACP eller RSD binde sig til SpoT, hvilket også ændrer balancen mellem hydrolyse og syntese16,17. I gram positiver afspejler syntese og hydrolyse en mere kompleks balance mellem et enkelt RelA SpoT ligner (rsh) protein med stærke syntese-og hydrolyse aktiviteter samt mindre hydrolaser og/eller synthetaser12.
(P) ppgpp nukleotider blev først opdaget som usædvanlige 32p mærkede pletter, der dukkede op på autoradiogrammer af tyndtlagkromatogrammer (TLC) under en streng respons induceret af aminosyre sult3. Mere detaljerede mærknings protokoller er blevet anmeldt 18. Den protokol, der er beskrevet her (figur 1), er en ændring af disse protokoller, som gør det muligt at overvåge væksten af flere prøver på mikrotiterplader. Dette letter flere biologiske og tekniske skøn over (p) ppGpp overflod ændringer og blev oprindeligt udviklet til studier af diauxic Skift19. Mærkning af (p) ppGpp med 32p og påvisning af TLC muliggør også målinger af (p) ppgpp-nedbrydnings rater. Alternative metoder er blevet udviklet til at bestemme (p) ppGpp-niveauer såsom massespektrometri, HPLC20, fluorescerende kemo sensorer21,22og gfp-genfusioner til initiativtagere, som berøres af ppgpp23, 24. fluorescerende kemo sensorer har i øjeblikket begrænset brug på grund af små spektral forskydninger efter binding af ppgpp samt problemer med at skelne mellem ppgpp og pppgpp21. Denne metode er effektiv til at opdage (p) ppGpp in vitro, men ikke i cellulære ekstrakter. Metoder, der involverer HPLC er blevet forbedret20 men kræver dyrt udstyr og er ikke godt tilpasset til høj gennem-Put. Endelig kan GFP-fusioner give et estimat af ppGpp-afhængig aktivering eller hæmning, men måler ikke ppGpp selv. Mens hver af disse alternative metoder er værdifulde, de kræver dyrt udstyr eller betydelig hands-on tid, eller de er ellers ikke modtagelig for flere kinetiske prøvetagning og efterfølgende behandling. Med den metode, der er beskrevet her, kan 96 prøver anvendes på seks TLC-plader i ca. 20 minutter (18 prøver pr. plade), løst ved TLC-udvikling på mindre end et par timer, med kvantitative data opnået efter flere timer eller natten, afhængigt af mærkning Intensitet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(NH4)6(MO7)24</td>
			<td>Fisher Scientifics</td>
			<td>A-674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoradiography film</td>
			<td>Denville scientific inc.</td>
			<td>E3218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>1-1309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>RPI</td>
			<td>C61000-25.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2</td>
			<td>Fisher Scientifics</td>
			<td>C-371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>1843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4</td>
			<td>Fisher Scientifics</td>
			<td>I-146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Fisher Biotech</td>
			<td>BP1215-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Macron</td>
			<td>4912-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO4</td>
			<td>Macron</td>
			<td>2549-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3PO4</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>0260-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2SO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9458-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Biotech</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Valine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V-6504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher Scientifics</td>
			<td>FL-06-0303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader Synergy HT</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-9522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1254-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>7892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>3624-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>7917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0171-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-32 radionuclide, orthophosphoric acid in 1 mL water (5 mCi)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEX053005MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage phosphor screen</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>So230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-4625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC PEI Cellulose F</td>
			<td>Merk-Millipore</td>
			<td>1.05579.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine</td>
			<td>RPI</td>
			<td>T2400-500.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon 9400 imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4</td>
			<td>Fisher Scientifics</td>
			<td>Z-68</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using microtiter dish radiolabeling for multiple in vivo measurements of escherichia coli (p)ppgpp followed by thin layer chromatography

Den (p) ppGpp nucleotid fungerer som en global regulator i bakterier som reaktion på en række fysiske og ernæringsmæssige stress. Det har en hurtig debut, i sekunder, hvilket fører til ophobning af niveauer, der nærmer sig eller overstiger dem af GTP puljer. Stress vending lejligheder en hurtig forsvinden af (p) ppGpp, ofte med en halveringstid på mindre end et minut. Tilstedeværelsen af (p) ppGpp resulterer i ændringer af cellulære genekspression og metabolisme, der modvirker de skadelige virkninger af stress. Gram-negative og gram-positive bakterier har forskellige responsmekanismer, men begge afhænger af (p) ppGpp koncentration. Under alle omstændigheder er der et behov for samtidig at overvåge mange radioaktivt mærkede bakterielle kulturer med tidsintervaller, der kan variere fra 10 sekunder til timer i kritiske stress overgangsperioder. Denne protokol omhandler denne tekniske udfordring. Metoden udnytter temperatur-og shaker-kontrollerede mikrotiterparabol inkubatorer, der muliggør parallel overvågning af vækst (absorbans) og hurtig prøvetagning af ensartet fosfat-radioaktivt mærkede kulturer for at løse og kvantificere nukleotidpuljer ved tyndtlagskromatografi på PEI-cellulose. Der kræves små mængder prøve til flere tekniske og biologiske replikater af analyser. Komplekse vækst overgange, såsom diauxic Growth og Rapid (p) ppGpp omsætnings rater kan kvantitativt vurderes ved denne metode.

I E. coli K-12 stammer, tilsætning af valin provokerer en endogene sult af isoleucin, hvilket resulterer i en stigning i ppGpp niveauer efter 5 min3. Celler dyrket i MOPS indeholdende alle aminosyrer undtagen ILV blev mærket med 32P som angivet i figur 1. Efter mærkningen blev 6 μL af 10 mg/mL L-valin (100 μg/mL endelig koncentration) tilsat for at producere isoleucinsult. Prøverne blev taget 0 og 5 min efter tilsætning af valin. Efte...

Watch this Scientific Journal Video about Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli pppGpp Followed by Thin Layer Chromatography at JoVE.com

Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli pppGpp Followed by Thin Layer Chromatography

Væksten af radioaktivt mærkede bakterielle kulturer i mikrotiterretter letter høj gennemløb prøvetagning, der giver mulighed for flere tekniske og biologiske replikat analyser af nukleotid pool overflod, herunder af (p) ppGpp. Virkningerne af vækst overgange fremkaldt af kilder til fysiologisk stress samt genopretning efter stress kan overvåges.

Anvendelse af Mikrotiterparabol Radiolabeling til flere in vivo-målinger af Escherichia coli (p) ppGpp efterfulgt af Tyndtlagkromatografi

The (p)ppGpp nucleotide functions as a global regulator in bacteria in response to a variety of physical and nutritional stress. It has a rapid onset, in ...

Denne metode måler niveauet af den globale regulator ppGpp inden for forskellige vækstbetingelser og stress situationer. PpGpp kan findes i gram positive og negative bakterier, samt i kloroplast. PpGpp har en hurtig debut på få sekunder, hvilket fører til en hurtig anden relation, når stress er produceret.Samtidig har den en kort halveringstid på op til 30 sekunder. Derfor er der behov for at overvåge mange kultur med tidsintervaller, der kan variere fra 10 sekunder til timer, herunder stressede overgange. Vi har også radiolabel bakterielle kulturer i microtiter retter letter høj gennemløb prøver, der tillader flere tekniske og biologiske replikater.Sørg for at følge de korrekte sikkerhedsforanstaltninger, når du arbejder med radioaktive materialer. For at starte denne procedure skal du forberede alle medier som beskrevet i tekstprotokollen. Vokse natten kulturer i MOPS medier med tre millimolar natriumphosphat.Tilsæt 550 mikroliter af MOPS-medier, der fortsætter 0,2 mikromolarnatriumphosphatbærer og 30 mikroliter af hver bakteriel inokulum til brøndene på en 24 brøndplade. Dette vil resultere i en indledende inoculum med en OD600 på 0,1. Tilføj friske medier til en samt en sterilitet kontrol.Anbring pladen i en rystende inkubator ved 37 grader celsius og omryst ved 900 omdr./min. i 30 minutter. Vækst kan overvåges ved hjælp af en pladelæser med en replikeret plade parallelt i medier, der mangler p32 ved hjælp af en pladelæser, mens inkubering under de samme betingelser. Dernæst tilsættes 100 mikrocuries p32 orthphosphate til hver brønd af pladen.Dyrk kulturerne i en rystende inkubator for en til to fordoblinger for at tillade ekstern etiket til stort set ligevægt med intercellulære nukleotid puljer. For korrekt visualisering blev intet af det aktive materiale brugt i denne video. I et rigtigt eksperiment er korrekt afskærmning påkrævet samt konstant overvågning for forurening med en undersøgelsesmåler.Først fremkalde stress ved hjælp af en metode, der passer til den slags stress undersøgt. Dernæst tilsættes 20 mikroliter af hver mærket celleprøve til et separat 0,2 milliliter PCR-rør, der indeholder 20 mikroliter iskold seks molar myresyre. Prøverne sættes straks på tøris.Forbedre cellulære udvinding effektivitet med tre cyklusser af frysning og optøning. Lige før du spotter PEI cellulose tyndt lag kromatogrammer, centrifuge prøverne i et minut ved maksimal hastighed til pellet cellerester. Først, der er fastsat en 20 af 20 centimeter PEI cellulose TLC plade.Brug en saks til at fjerne de øverste fem centimeter. Og brug en blød blyant til at markere en oprindelse linje en centimeter fra kanten. Påfør en fem mikroliterdråber af hver prøve på PEI-overfladen.Før stedet kan tørre, overføres pladen til en tank, der indeholder et lag på 1,5 molar monopotassiumphosphat, der er lavvandet nok til ikke at røre oprindelsesprøven. Dæk tanken med en lufttæt forsegling, og lad væskeudsuge til toppen af den 15 centimeter trimmede plade. Derefter fjernes det fuldt udviklede kromatogram og lufttørres ved stuetemperatur.Den øverste del af kromatogrammet, der indeholder den frie P32, skæres i radioaktivt affald og kasseres. Brug en fosfor skærm til at eksponere audioradiographic film natten over. Den næste dag, udvikle filmen og bruge en fosformager til at fange og kvantificere fosfor grønne signal.Brug derefter ImageJ-software til at kvantere de radioaktive pletter. Efter at have fremprovokeret stress eller sult for tid nok til at tillade ppGpp akkumulering, bruge en passende metode til at vende stress. Der udtages prøver hvert 20.30.Når TLC er udviklet, og niveauet af ppGpp opnås i løbet af kurset, afbilde den resterende ppGpp indhold på en semilogaritmisk plot versus tid. I denne undersøgelse er celler, der dyrkes i MOPS, der indeholder alle aminosyrer med undtagelse af ILV, mærket med P32. Når mærket, L valin tilsættes til at producere isoleucin sult.Efter fem minutter, en to og to og en halv gammel stigning i niveauet af tetra og pentaphosphat af guanosin opstod. En negativ kontrol af en cellefri mærket prøve bruges til at opdage mulige forbindelser, der ikke orthophosphat i P32 kilde. Tilbageførsel af isoleucin sult kan opnås ved chloramphenicol, en hæmmer af proteinsyntese, som reducerer forbruget af opladet isoleucin tRNA, og igen, genskaber høje forhold af opladet til uncharged tRNA.Aktivering af den stærke rela-medieret ppGpp syntase afskaffes, hvilket giver mulighed for et mål for ppGpp nedbrydning uforstyrret af resterende syntese. I dette tilfælde henfalder ppGpp med en halveringstid på ca. 64 sekunder. Det er vigtigt at lade cellerne vokse i et par generationer for at opnå en ensartet mærkning, før inducere nogen stress eller sult.Fordi ppGpp er udbredt blandt bakterier, denne metode kan anvendes på andre organismer. Ændring af TLC udviklingsmetoden kunne tillade korrekt adskillelse af alle de lovgivningsmæssige nukleotider, såsom ppApp. P52 er en bedre emitter isotop, så det er vigtigt at bruge korrekt afskærmning og korrekt kassere eventuelle rester.

Research

JoVE Journal

Biology

Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli (p)ppGpp Followed by Thin Layer Chromatography

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC)

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography TLC Coupled with Gas-Liquid Chromatography GLC

Biological membranes separate cells from the environment. From a single cell to multicellular plants and animals, glycerolipids, such as ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

In vivo Lever Endocytose Efterfulgt af rensning af leverceller af lever perfusion

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood.  The basic architecture of the liver is illustrated in ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Kortlægning Bakterielle Funktionelle Networks og spredningsveje i<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Hjælp Syntetiske Genetiske Arrays

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Hurtig Protokol for Udarbejdelse af elektrokompetente<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Og<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection Live<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 celler ved PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional sporing af hæmatopoietisk stamcelletransplantation og stamcelle i Voksen Mouse calvarie knoglemarv

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Den mangesidede Fordele ved Protein Co-ekspression i<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...