Name: using microtiter dish radiolabeling for multiple in vivo measurements of escherichia coli (p)ppgpp followed by thin layer chromatography
Uploaded: 2019-06-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli pppGpp Followed by Thin Layer Chromatography at JoVE.com

Diese Forschung wurde vom Intramural Research Program, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, NIH, unterstützt.

1. Medienvorbereitung
<ol><li>
Für MOPS (3-(N-morpholino)propanesulfonsäure) media25, verwenden Sie 1/10 Volumen von 10x MOPS Salzen, 1/100 Volumen von 100x Mikronährstofflösung, 3 mM Natriumphosphat für Nachtkulturen oder 0,2 mM Natriumphosphat zur gleichmäßigen Kennzeichnung mit 32P, 0,2% Glukose und 1 g/ml Thiamin (Vitamin B1). Fügen Sie bei Bedarf Aminosäuren mit 40 g/ml hinzu.
	<ol>
<li>Für MOPS-Salze verwenden Sie 400 mM MOPS, 40 mM Tricine, 0,1 mM FeS...

<ol>
	<li>Cashel, M., Gentry, D., Hernandez, V., Vinella, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stringent+Response.">The stringent Response.</a> Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology. , 1458-1489 (1996).</li><li>Magnusson, L. U., Farewell, A., Nystr&#246;m, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp:+a+global+regulator+in+Escherichia+coli.">ppGpp: a global regulator in Escherichia coli.</a> Trends in Microbiology. 13 (5), 236-242 (2005).</li><li>Cashel, M., Gallant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Compounds+implicated+in+the+Function+of+the+RC+Gene+of+Escherichia+coli.">Two Compounds implicated in the Function of the RC Gene of Escherichia coli.</a> Nature. 221 (5183), 838-841 (1969).</li><li>Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+horizons+for+(p)ppGpp+in+bacterial+and+plant+physiology.">New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology.</a> Trends in Microbiology. 14 (1), 45-54 (2006).</li><li>Atkinson, G. C., Tenson, T., Hauryliuk, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RelA/SpoT+homolog+(RSH)+superfamily:+distribution+and+functional+evolution+of+ppGpp+synthetases+and+hydrolases+across+the+tree+of+life.">The RelA/SpoT homolog (RSH) superfamily: distribution and functional evolution of ppGpp synthetases and hydrolases across the tree of life.</a> PloS One. 6 (8), e23479 (2011).</li><li>Mechold, U., Potrykus, K., Murphy, H., Murakami, K. S., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+by+ppGpp+versus+pppGpp+in+Escherichia+coli.">Differential regulation by ppGpp versus pppGpp in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 41 (12), 6175-6189 (2013).</li><li>Molodtsov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+Effector+ppGpp+Potentiates+the+Inhibition+of+Transcript+Initiation+by+DksA.">Allosteric Effector ppGpp Potentiates the Inhibition of Transcript Initiation by DksA.</a> Molecular Cell. 69 (5), 828-839 (2018).</li><li>Ross, W., Sanchez-Vazquez, P., Chen, A. Y. Y., Lee, J. -. H. H., Burgos, H. L. L., Gourse, R. L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp+Binding+to+a+Site+at+the+RNAP-DksA+Interface+Accounts+for+Its+Dramatic+Effects+on+Transcription+Initiation+during+the+Stringent+Response.">ppGpp Binding to a Site at the RNAP-DksA Interface Accounts for Its Dramatic Effects on Transcription Initiation during the Stringent Response.</a> Molecular Cell. 62 (6), 811-823 (2016).</li><li>Kriel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Regulation+of+GTP+Homeostasis+by+(p)ppGpp:+A+Critical+Component+of+Viability+and+Stress+Resistance.">Direct Regulation of GTP Homeostasis by (p)ppGpp: A Critical Component of Viability and Stress Resistance.</a> Molecular Cell. 48 (2), 231-241 (2012).</li><li>Kriel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTP+dysregulation+in+Bacillus+subtilis+cells+lacking+(p)ppGpp+results+in+phenotypic+amino+acid+auxotrophy+and+failure+to+adapt+to+nutrient+downshift+and+regulate+biosynthesis+genes.">GTP dysregulation in Bacillus subtilis cells lacking (p)ppGpp results in phenotypic amino acid auxotrophy and failure to adapt to nutrient downshift and regulate biosynthesis genes.</a> Journal of Bacteriology. 196 (1), 189-201 (2014).</li><li>Potrykus, K., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p)ppGpp:+still+magical.">p)ppGpp: still magical.</a> Annual Review of Microbiology. 62, 35-51 (2008).</li><li>Hauryliuk, V., Atkinson, G. C., Murakami, K. S., Tenson, T., Gerdes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+functional+insights+into+the+role+of+(p)ppGpp+in+bacterial+physiology.">Recent functional insights into the role of (p)ppGpp in bacterial physiology.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (5), 298-309 (2015).</li><li>Arenz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stringent+factor+RelA+adopts+an+open+conformation+on+the+ribosome+to+stimulate+ppGpp+synthesis.">The stringent factor RelA adopts an open conformation on the ribosome to stimulate ppGpp synthesis.</a> Nucleic Acids Research. 44 (13), 6471-6481 (2016).</li><li>Loveland, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome&#8226;RelA+structures+reveal+the+mechanism+of+stringent+response+activation.">Ribosome&#8226;RelA structures reveal the mechanism of stringent response activation.</a> eLife. 5, e17029 (2016).</li><li>Brown, A., Fern&#225;ndez, I. S., Gordiyenko, Y., Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome-dependent+activation+of+stringent+control.">Ribosome-dependent activation of stringent control.</a> Nature. 534 (7606), 277-280 (2016).</li><li>Battesti, A., Bouveret, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acyl+carrier+protein/SpoT+interaction,+the+switch+linking+SpoT-dependent+stress+response+to+fatty+acid+metabolism.">Acyl carrier protein/SpoT interaction, the switch linking SpoT-dependent stress response to fatty acid metabolism.</a> Molecular Microbiology. 62 (4), 1048-1063 (2006).</li><li>Lee, J. -. W., Park, Y. -. H., Seok, Y. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rsd+balances+(p)ppGpp+level+by+stimulating+the+hydrolase+activity+of+SpoT+during+carbon+source+downshift+in+Escherichia+coli.">Rsd balances (p)ppGpp level by stimulating the hydrolase activity of SpoT during carbon source downshift in Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (29), E6845-E6854 (2018).</li><li>Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+(p)ppGpp+Accumulation+Patterns+in+Escherichia+coli+mutants.">Detection of (p)ppGpp Accumulation Patterns in Escherichia coli mutants.</a> Molecular Microbiology Techniques. 3, 341-356 (1994).</li><li>Fern&#225;ndez-Coll, L., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+SpoT+Hydrolase,+SpoT+Synthetase,+and+RelA+Synthetase+to+Carbon+Source+Diauxic+Growth+Transitions+in+Escherichia+coli.">Contributions of SpoT Hydrolase, SpoT Synthetase, and RelA Synthetase to Carbon Source Diauxic Growth Transitions in Escherichia coli.</a> Frontiers in Microbiology. , (2018).</li><li>Varik, V., Oliveira, S. R. A., Hauryliuk, V., Tenson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPLC-based+quantification+of+bacterial+housekeeping+nucleotides+and+alarmone+messengers+ppGpp+and+pppGpp.">HPLC-based quantification of bacterial housekeeping nucleotides and alarmone messengers ppGpp and pppGpp.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11022 (2017).</li><li>Rhee, H. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Fluorescent+Chemosensor+for+the+Bacterial+Alarmone+(p)ppGpp.">Selective Fluorescent Chemosensor for the Bacterial Alarmone (p)ppGpp.</a> J. Am. Chem. Soc. 130 (3), 784-785 (2008).</li><li>Wang, J., Chen, W., Liu, X., Wesdemiotis, C., Pang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mononuclear+Zinc+Complex+for+Selective+Detection+of+Diphosphate+via+Fluorescence+ESIPT+Turn-On.">A Mononuclear Zinc Complex for Selective Detection of Diphosphate via Fluorescence ESIPT Turn-On.</a> Journal of Materials Chemistry B. 2 (21), 3349-3354 (2014).</li><li>Pokhilko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+nutrient+limitation+in+growing+E.+coli:+a+mathematical+model+of+a+ppGpp-based+biosensor.">Monitoring of nutrient limitation in growing E. coli: a mathematical model of a ppGpp-based biosensor.</a> BMC Systems Biology. 11 (1), 106 (2017).</li><li>Funabashi, H., Mie, M., Yanagida, Y., Kobatake, E., Aizawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+monitoring+of+cellular+physiological+status+depending+on+the+accumulation+of+ppGpp.">Fluorescent monitoring of cellular physiological status depending on the accumulation of ppGpp.</a> Biotechnology Letters. 24 (4), 269-273 (2002).</li><li>Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+medium+for+enterobacteria.">Culture medium for enterobacteria.</a> Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Peselis, A., Serganov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ykkC+riboswitches+employ+an+add-on+helix+to+adjust+specificity+for+polyanionic+ligands.">ykkC riboswitches employ an add-on helix to adjust specificity for polyanionic ligands.</a> Nature Chemical Biology. 14 (9), 887-894 (2018).</li><li>Oki, T., Yoshimoto, A., Sato, S., Takamatsu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purine+nucleotide+pyrophosphotransferase+from+Streptomyces+morookaensis,+capable+of+synthesizing+pppApp+and+pppGpp.">Purine nucleotide pyrophosphotransferase from Streptomyces morookaensis, capable of synthesizing pppApp and pppGpp.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology. 410 (2), 262-272 (1975).</li><li>Travers, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppApp+alters+transcriptional+selectivity+of+Escherichia+coli+RNA+polymerase.">ppApp alters transcriptional selectivity of Escherichia coli RNA polymerase.</a> FEBS Letters. 94 (2), 345-348 (1978).</li><li>Bruhn-Olszewska, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+comparisons+of+(p)ppApp+vs+(p)ppGpp+for+Escherichia+coli+RNA+polymerase+binding+sites+and+for+rrnB+P1+promoter+regulatory+responses+in+vitro.">Structure-function comparisons of (p)ppApp vs (p)ppGpp for Escherichia coli RNA polymerase binding sites and for rrnB P1 promoter regulatory responses in vitro.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms. 1861 (8), 731-742 (2018).</li></ol>

Die Nahe eine einheitliche Kennzeichnung der Zellen ist ein entscheidender Schritt für dieses Protokoll. Daher ist die Verwendung definierter Medien wie MOPS- oder Tris-Medien von entscheidender Bedeutung, um eine Variation der Phosphatkonzentrationen des Trägers und spezifische Aktivitäten zu ermöglichen. Phosphatgepufferte Medien wie M9 oder Media A können nicht verwendet werden. Die meisten undefinierten Medien enthalten variable Mengen an Phosphat, wie LB, Trypton und Casaminosäuren. Das Phosphatisotop 33<...

Der (p)ppGpp zweite Bote ist ein globaler Regulator, der die Expression einer großen Anzahl von Genen moduliert, einschließlich Genen zur Synthese von Ribosomen und Aminosäuren1,2. Obwohl zunächst in Escherichia coli3entdeckt, (p)ppGpp kann sowohl in Gram-positiven und Gram-negativen Bakterien als auch in pflanzende Chloroplasten4,5gefunden werden. Bei E. coli und anderen Gram-negativen Bakterien interagiert (p)ppGpp direkt mit RNA-Polymerase an zwei verschiedenen Stellen6,7,8. In Gram-Positiven hemmt (p)ppGpp die GTP-Fülle, die von CodY wahrgenommen wird, einem GTP-bindenden Protein mit genspezifischen DNA-Erkennungsmotiven, die zur Regulation9,10führen. p)ppGpp sammelt sich als Reaktion auf den Hunger todbringend für verschiedene Nährstoffe und Stressbedingungen an, was zu langsamem Wachstum und Anpassungen der Genexpression führt, um eine Anpassung an Stress11,12zu ermöglichen.
Der netto angesammelte ppGpp spiegelt ein Gleichgewicht zwischen Synthetase- und Hydrolaseaktivitäten wider. In E. coli RelA ist eine starke Synthetase und SpoT ist bifunktional, mit einer starken Hydrolase und einer schwachen Synthetase, die jeweils unterschiedlich in einer stressabhängigen Weise reguliert werden könnten. Die starke RelA-Synthetase wird aktiviert, wenn die Verfügbarkeit von codon-spezifizierter geladener tRNA an die ribosomale A-Stelle gebunden ist, wenn sie nicht mit den Anforderungen der Proteinsynthese13,14,15Schritt hält. Die schwache SpoT (p)ppGpp-Synthetase wird aktiviert, während die starke (p)ppGpp-Hydrolase als Reaktion auf andere Stressbedingungen und durch andere Mechanismen gehemmt wird. Unter bestimmten Bedingungen können Proteine wie ACP oder Rsd an SpoT binden, was auch das Gleichgewicht zwischen Hydrolyse und Synthese16,17verändert. In Gram-Positiven spiegeln Synthese und Hydrolyse ein komplexeres Gleichgewicht zwischen einem einzelnen RelA SpoT-Homolog (RSH)-Protein mit starken Synthese- und Hydrolyseaktivitäten sowie kleineren Hydrolasen und/oder Synthetasen12wider.
Die (p)ppGpp-Nukleotide wurden zuerst als ungewöhnliche 32P-markierte Flecken entdeckt, die auf Autoradiogrammen von Dünnschichtchromatogrammen (TLC) während einer strengen Reaktion durch Aminosäurehunger3erschienen sind. Detailliertere Kennzeichnungsprotokolle wurden überprüft 18. Das hier beschriebene Protokoll (Abbildung 1) ist eine Änderung dieser Protokolle, die es ermöglicht, das Wachstum mehrerer Proben auf Mikrotiterplatten zu überwachen. Dies erleichtert mehrere biologische und technische Schätzungen von (p)ppGpp-Überflussänderungen und wurde ursprünglich für Studien von diauxischen Schichten19entwickelt. Die Kennzeichnung von (p)ppGpp mit 32P und die Detektion durch TLC ermöglicht auch Messungen von (p)ppGpp Abbauraten. Es wurden alternative Methoden entwickelt, um (p)ppGpp-Spiegel wie Massenspektrometrie, HPLC20, fluoreszierende Chemosensoren21,22und GFP-Genfusionen an Promotoren zu bestimmen, die von ppGpp23betroffen sind, 24. Fluoreszierende Chemosensoren haben derzeit aufgrund kleiner Spektralverschiebungen nach Bindung ppGpp sowie Problemen bei der Unterscheidung zwischen ppGpp und pppGpp21einen begrenzten Einsatz. Diese Methode ist effizient, um (p)ppGpp in vitro zu erkennen, aber nicht in zellulären Extrakten. Die Methoden mit HPLC wurdenum 20 verbessert, erfordern aber teure Geräte und sind nicht gut an hohe Durchsatz angepasst. Schließlich können GFP-Fusionen eine Schätzung der ppGpp-abhängigen Aktivierung oder Hemmung ergeben, messen jedoch ppGpp selbst nicht. Obwohl jede dieser alternativen Methoden wertvoll ist, erfordern sie teure Ausrüstung oder eine erhebliche Praktische Zeit, oder sie sind ansonsten nicht für mehrere kinetische Probenahmen und nachfolgende Verarbeitungen geeignet. Mit dem hier beschriebenen Verfahren können 96 Proben auf sechs TLC-Platten in etwa 20 min (18 Proben pro Platte) aufgebracht werden, die durch TLC-Entwicklung in weniger als ein paar Stunden gelöst werden, wobei quantitative Daten nach mehreren Stunden oder über Nacht, je nach Etikettierung, intensität.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(NH4)6(MO7)24</td>
			<td>Fisher Scientifics</td>
			<td>A-674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoradiography film</td>
			<td>Denville scientific inc.</td>
			<td>E3218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>1-1309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>RPI</td>
			<td>C61000-25.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2</td>
			<td>Fisher Scientifics</td>
			<td>C-371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>1843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4</td>
			<td>Fisher Scientifics</td>
			<td>I-146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Fisher Biotech</td>
			<td>BP1215-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Macron</td>
			<td>4912-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO4</td>
			<td>Macron</td>
			<td>2549-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3PO4</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>0260-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2SO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9458-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Biotech</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Valine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V-6504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher Scientifics</td>
			<td>FL-06-0303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader Synergy HT</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-9522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1254-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>7892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>3624-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>7917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0171-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-32 radionuclide, orthophosphoric acid in 1 mL water (5 mCi)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEX053005MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage phosphor screen</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>So230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-4625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC PEI Cellulose F</td>
			<td>Merk-Millipore</td>
			<td>1.05579.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine</td>
			<td>RPI</td>
			<td>T2400-500.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon 9400 imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4</td>
			<td>Fisher Scientifics</td>
			<td>Z-68</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using microtiter dish radiolabeling for multiple in vivo measurements of escherichia coli (p)ppgpp followed by thin layer chromatography

Das (p)ppGpp-Nukleotid fungiert als globaler Regulator bei Bakterien als Reaktion auf eine Vielzahl von körperlichen und ernährungsphysiologischen Belastungen. Es hat einen schnellen Beginn, in Sekunden, die zu einer Anhäufung von Ebenen führt, die sich denen von GTP-Pools nähern oder übertreffen. Stressumkehr gelegentlich ein schnelles Verschwinden von (p)ppGpp, oft mit einer Halbwertszeit von weniger als einer Minute. Das Vorhandensein von (p)ppGpp führt zu Veränderungen der zellulären Genexpression und des Stoffwechsels, die den schädlichen Auswirkungen von Stress entgegenwirken. Gram-negative und gram-positive Bakterien haben unterschiedliche Reaktionsmechanismen, aber beide hängen von (p)ppGpp-Konzentration ab. In jedem Fall ist es notwendig, gleichzeitig viele radioaktiv markierte Bakterienkulturen in Zeitintervallen zu überwachen, die während kritischer Stressübergangsperioden von 10 Sekunden bis Stunden variieren können. Dieses Protokoll behebt diese technische Herausforderung. Die Methode nutzt temperatur- und schüttergesteuerte Mikrotiter-Schalen-Inkubatoren, die eine parallele Überwachung des Wachstums (Absorption) und eine schnelle Probenahme von einheitlich phosphatradioaktiv markierten Kulturen ermöglichen, um Nukleotidbecken durch Dünnschichtchromatographie auf PEI-Zellulose. Für mehrere technische und biologische Wiederholungen von Analysen werden geringe Probenmengen benötigt. Komplexe Wachstumsübergänge wie diauxisches Wachstum und schnelle (p)ppGpp-Fluktuationsraten können mit dieser Methode quantitativ bewertet werden.

Bei E. coli K-12-Stämmen provoziert die Zugabe von Valin einen endogene Hunger von Isoleucin, was zu einer Erhöhung des ppGpp-Spiegels nach 5 min3führt. Zellen, die in MOPS angebaut wurden und alle Aminosäuren mit Ausnahme von ILV enthielten, wurden mit 32P gekennzeichnet, wie in Abbildung 1angegeben. Nach der Etikettierung wurden 6 l mit 10 mg/ml L-Valin (100 g/ml Endkonzentration) zugegeben, um Isoleucin-Hunger zu erzeugen. Die Proben ...

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Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli pppGpp Followed by Thin Layer Chromatography

Das Wachstum von radioaktiv markierten Bakterienkulturen in Mikrotiter-Gerichten ermöglicht eine Probenahme mit hohem Durchsatz, die mehrere technische und biologische Replizierungen von Nukleotid-Pool-Überfluss ermöglicht, einschließlich der von (p)ppGpp. Die Auswirkungen von Wachstumsübergängen, die durch Quellen physiologischen Stresses sowie Erholung von Stress hervorgerufen werden, können überwacht werden.

Verwenden von Microtiter Dish Radiolabeling für mehrere In-Vivo-Messungen von Escherichia coli (p)ppGpp gefolgt von dünnschichtiger Chromatographie

The (p)ppGpp nucleotide functions as a global regulator in bacteria in response to a variety of physical and nutritional stress. It has a rapid onset, in ...

Diese Methode misst das Niveau der globalen Regulierungsbehörde ppGpp unter verschiedenen Wachstumsbedingungen und Stresssituationen. PpGpp kann in gram positiven und negativen Bakterien gefunden werden, sowie in Chloroplasten. PpGpp hat einen schnellen Beginn in Sekunden, die zu einer schnellen zweiten Beziehung führen, sobald Spannung erzeugt wird.Gleichzeitig hat es eine kurze Halbwertszeit, bis zu 30 Sekunden. Daher ist es notwendig, viele Kultur in Zeitintervallen zu überwachen, die von 10 Sekunden bis Stunden variieren können, einschließlich betonter Übergänge. Wir radiolabel Bakterienkulturen in Mikrotiter-Gerichten ermöglicht probenmit hohem Durchsatz, die mehrere technische und biologische Replikationen ermöglichen.Achten Sie bei der Arbeit mit radioaktiven Stoffen darauf, die richtigen Sicherheitsmaßnahmen zu befolgen. Bereiten Sie alle Medien wie im Textprotokoll beschrieben vor, um mit diesem Verfahren zu beginnen. Wachsen Sie Übernachtkulturen in MOPS-Medien mit drei Millimolaren-Natriumphosphat.Fügen Sie 550 Mikroliter MOPS-Medien, die 0,2 mikromolaren Natriumphosphatträger und 30 Mikroliter jedes bakteriellen Inokulums zu den Brunnen einer 24-Well-Platte. Dies führt zu einem anfänglichen Inokulum mit einem OD600 von 0,1. Fügen Sie frische Medien zu einem sowie eine Sterilitätskontrolle hinzu.Legen Sie die Platte in einen Schüttelninkubator bei 37 Grad Celsius, schütteln Sie bei 900 Umdrehungen pro Minute für 30 Minuten. Das Wachstum kann mit einem Plattenleser mit einer Replizierungsplatte parallel in Medien ohne p32 überwacht werden, wobei ein Plattenleser während der Inkubation unter den gleichen Bedingungen inkubiert wird. Als nächstes fügen Sie 100 Mikrocuries p32-Orthphosphat zu jedem Brunnen der Platte hinzu.Wachsen Sie die Kulturen in einem schütteren Inkubator für ein bis zwei Verdoppelungen, damit externe Etiketten weitgehend mit interzellulären Nukleotidbecken gleichgesetzt werden können. Für die korrekte Visualisierung wurde in diesem Video kein aktives Material verwendet. In einem echten Experiment ist eine ordnungsgemäße Abschirmung sowie eine ständige Überwachung der Kontamination mit einem Vermessungsmesser erforderlich.Erstens, induzieren Stress mit einer Methode geeignet für die Art von Stress untersucht. Als nächstes fügen Sie 20 Mikroliter jeder beschrifteten Zellprobe in eine separate 0,2 Milliliter PCR-Röhre, die 20 Mikroliter eiskalte sechs Molar-Ameisensäure enthält. Die Proben sofort auf Trockeneis legen.Verbessern Sie die Effizienz der zellulären Extraktion um drei Zyklen des Einfrierens und Auftauens. Kurz vor der Erkennung pei Zellulose Dünnschicht Chromatogramme, Zentrifugieren Sie die Proben für eine Minute mit maximaler Geschwindigkeit, um Zellablagerungen zu pellet. Legen Sie zunächst eine 20 mal 20 Zentimeter große PEI-Zellulose-TLC-Platte fest.Verwenden Sie eine Schere, um die oberen fünf Zentimeter zu entfernen. Und verwenden Sie einen weichen Bleistift, um eine Ursprungslinie einen Zentimeter vom Rand zu markieren. Tragen Sie ein Fünf-Mikroliter-Tröpfchen jeder Probe auf die PEI-Oberfläche auf.Bevor der Fleck trocknen kann, übertragen Sie die Platte in einen Tank, der eine Schicht aus 1,5 molarem Monokaliumphosphat enthält, die flach genug ist, um den Ursprungsprobenfleck nicht zu berühren. Bedecken Sie den Tank mit einer luftdichten Dichtung und lassen Sie den flüssigen Aufstieg an die Spitze des 15 Zentimeter großen getrimmten Blechs zu. Danach das ausgereifte Chromatogramm entfernen und bei Raumtemperatur an die Luft trocknen.Schneiden und entsorgen Sie den oberen Teil des Chromatogramms, das den freien P32 enthält, in radioaktiveabfälle. Verwenden Sie einen Phosphorbildschirm, um die radioradiographischen Filme über Nacht auszusetzen. Entwickeln Sie am nächsten Tag den Film und verwenden Sie einen Phosphorimager, um das grüne Signal des Phosphors zu erfassen und zu quantitieren.Verwenden Sie dann die ImageJ-Software, um die radioaktiven Flecken zu quantifizieren. Nach der Provokation von Stress oder Hunger für die Zeit ausreichend, um ppGpp Akkumulation zu ermöglichen, verwenden Sie eine geeignete Methode, um die Spannung umzukehren. Nehmen Sie alle 20 bis 30 Sekunden proben und verarbeiten Sie die Proben wie zuvor beschrieben.Sobald der TLC entwickelt ist und die ppGpp-Ebenen während des Zeitverlaufs erhalten sind, zeichnen Sie den verbleibenden ppGpp-Gehalt auf einem semilogarithmischen Plot im Vergleich zur Zeit. In dieser Studie werden Zellen, die in MOPS angebaut werden und alle Aminosäuren mit Ausnahme von ILV enthalten, mit P32 gekennzeichnet. Nach der Beschriftung wird L-Valin zur Herstellung von Isoleucin-Hunger hinzugefügt.Nach fünf Minuten kam es zu einem zweieinhalbjährigen Anstieg der Tetra- und Pentaphosphatspiegel von Guanosin. Eine negative Kontrolle einer zellfreien beschrifteten Probe wird verwendet, um mögliche Verbindungen zu erkennen, die nicht orthophosphat in der P32-Quelle sind. Die Umkehrung des Isoleucin-Hungers kann durch Chloramphenicol erreicht werden, ein Inhibitor der Proteinsynthese, der den Verbrauch von geladenem Isoleucin tRNA reduziert und wiederum hohe Verhältnisse von geladener zu ungeladener tRNA wiederherstellt.Die Aktivierung der stark rela-vermittelten ppGpp-Synthetase wird abgeschafft, was ein Maß der ppGpp-Degradation ungestört durch Restsynthese ermöglicht. In diesem Fall zerfällt ppGpp mit einer Halbwertszeit von ca. 64 Sekunden. Es ist wichtig, die Zellen für ein paar Generationen wachsen zu lassen, um eine gleichmäßige Kennzeichnung zu erreichen, bevor Stress oder Hunger induzieren.Da ppGpp unter Bakterien weit verbreitet ist, kann diese Methode auf andere Organismen angewendet werden. Eine Änderung der TLC-Entwicklungsmethode könnte die ordnungsgemäße Trennung aller regulatorischen Nukleotide wie ppApp ermöglichen. P52 ist ein besseres Emitter-Isotop, daher ist es wichtig, die richtige Abschirmung zu verwenden und Rückstände ordnungsgemäß zu entsorgen.

Research

JoVE Journal

Biology

Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli (p)ppGpp Followed by Thin Layer Chromatography

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Forschung

Biologie

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