Name: using microtiter dish radiolabeling for multiple in vivo measurements of escherichia coli (p)ppgpp followed by thin layer chromatography
Uploaded: 2019-06-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli pppGpp Followed by Thin Layer Chromatography at JoVE.com

מחקר זה היה נתמך בתוכנית מחקר הפנים, יוניס קנדי Shriver המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם, NIH.

1. הכנת מדיה
<ol><li>
עבור מגבים (3-(N-שורגואולנו) החומצה propanesulfonic) מדיה25, השתמש 1/10 נפח של מלחי 10 x מלחים, 1/100 נפח של 100x מיקרורונקורט הפתרון, 3 mM נתרן פוספט עבור תרבויות לילה או 0.2 מילימטר נתרן פוספט לתיוג אחיד עם 32P, 0.2% גלוקוז ו-1 μg/mL תיאמין (ויטמין B1). הוסף חומצות אמינו ב-40 μg/mL במ?...

<ol>
	<li>Cashel, M., Gentry, D., Hernandez, V., Vinella, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stringent+Response.">The stringent Response.</a> Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology. , 1458-1489 (1996).</li><li>Magnusson, L. U., Farewell, A., Nystr&#246;m, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp:+a+global+regulator+in+Escherichia+coli.">ppGpp: a global regulator in Escherichia coli.</a> Trends in Microbiology. 13 (5), 236-242 (2005).</li><li>Cashel, M., Gallant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Compounds+implicated+in+the+Function+of+the+RC+Gene+of+Escherichia+coli.">Two Compounds implicated in the Function of the RC Gene of Escherichia coli.</a> Nature. 221 (5183), 838-841 (1969).</li><li>Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+horizons+for+(p)ppGpp+in+bacterial+and+plant+physiology.">New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology.</a> Trends in Microbiology. 14 (1), 45-54 (2006).</li><li>Atkinson, G. C., Tenson, T., Hauryliuk, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RelA/SpoT+homolog+(RSH)+superfamily:+distribution+and+functional+evolution+of+ppGpp+synthetases+and+hydrolases+across+the+tree+of+life.">The RelA/SpoT homolog (RSH) superfamily: distribution and functional evolution of ppGpp synthetases and hydrolases across the tree of life.</a> PloS One. 6 (8), e23479 (2011).</li><li>Mechold, U., Potrykus, K., Murphy, H., Murakami, K. S., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+by+ppGpp+versus+pppGpp+in+Escherichia+coli.">Differential regulation by ppGpp versus pppGpp in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 41 (12), 6175-6189 (2013).</li><li>Molodtsov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+Effector+ppGpp+Potentiates+the+Inhibition+of+Transcript+Initiation+by+DksA.">Allosteric Effector ppGpp Potentiates the Inhibition of Transcript Initiation by DksA.</a> Molecular Cell. 69 (5), 828-839 (2018).</li><li>Ross, W., Sanchez-Vazquez, P., Chen, A. Y. Y., Lee, J. -. H. H., Burgos, H. L. L., Gourse, R. L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp+Binding+to+a+Site+at+the+RNAP-DksA+Interface+Accounts+for+Its+Dramatic+Effects+on+Transcription+Initiation+during+the+Stringent+Response.">ppGpp Binding to a Site at the RNAP-DksA Interface Accounts for Its Dramatic Effects on Transcription Initiation during the Stringent Response.</a> Molecular Cell. 62 (6), 811-823 (2016).</li><li>Kriel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Regulation+of+GTP+Homeostasis+by+(p)ppGpp:+A+Critical+Component+of+Viability+and+Stress+Resistance.">Direct Regulation of GTP Homeostasis by (p)ppGpp: A Critical Component of Viability and Stress Resistance.</a> Molecular Cell. 48 (2), 231-241 (2012).</li><li>Kriel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTP+dysregulation+in+Bacillus+subtilis+cells+lacking+(p)ppGpp+results+in+phenotypic+amino+acid+auxotrophy+and+failure+to+adapt+to+nutrient+downshift+and+regulate+biosynthesis+genes.">GTP dysregulation in Bacillus subtilis cells lacking (p)ppGpp results in phenotypic amino acid auxotrophy and failure to adapt to nutrient downshift and regulate biosynthesis genes.</a> Journal of Bacteriology. 196 (1), 189-201 (2014).</li><li>Potrykus, K., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p)ppGpp:+still+magical.">p)ppGpp: still magical.</a> Annual Review of Microbiology. 62, 35-51 (2008).</li><li>Hauryliuk, V., Atkinson, G. C., Murakami, K. S., Tenson, T., Gerdes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+functional+insights+into+the+role+of+(p)ppGpp+in+bacterial+physiology.">Recent functional insights into the role of (p)ppGpp in bacterial physiology.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (5), 298-309 (2015).</li><li>Arenz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stringent+factor+RelA+adopts+an+open+conformation+on+the+ribosome+to+stimulate+ppGpp+synthesis.">The stringent factor RelA adopts an open conformation on the ribosome to stimulate ppGpp synthesis.</a> Nucleic Acids Research. 44 (13), 6471-6481 (2016).</li><li>Loveland, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome&#8226;RelA+structures+reveal+the+mechanism+of+stringent+response+activation.">Ribosome&#8226;RelA structures reveal the mechanism of stringent response activation.</a> eLife. 5, e17029 (2016).</li><li>Brown, A., Fern&#225;ndez, I. S., Gordiyenko, Y., Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome-dependent+activation+of+stringent+control.">Ribosome-dependent activation of stringent control.</a> Nature. 534 (7606), 277-280 (2016).</li><li>Battesti, A., Bouveret, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acyl+carrier+protein/SpoT+interaction,+the+switch+linking+SpoT-dependent+stress+response+to+fatty+acid+metabolism.">Acyl carrier protein/SpoT interaction, the switch linking SpoT-dependent stress response to fatty acid metabolism.</a> Molecular Microbiology. 62 (4), 1048-1063 (2006).</li><li>Lee, J. -. W., Park, Y. -. H., Seok, Y. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rsd+balances+(p)ppGpp+level+by+stimulating+the+hydrolase+activity+of+SpoT+during+carbon+source+downshift+in+Escherichia+coli.">Rsd balances (p)ppGpp level by stimulating the hydrolase activity of SpoT during carbon source downshift in Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (29), E6845-E6854 (2018).</li><li>Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+(p)ppGpp+Accumulation+Patterns+in+Escherichia+coli+mutants.">Detection of (p)ppGpp Accumulation Patterns in Escherichia coli mutants.</a> Molecular Microbiology Techniques. 3, 341-356 (1994).</li><li>Fern&#225;ndez-Coll, L., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+SpoT+Hydrolase,+SpoT+Synthetase,+and+RelA+Synthetase+to+Carbon+Source+Diauxic+Growth+Transitions+in+Escherichia+coli.">Contributions of SpoT Hydrolase, SpoT Synthetase, and RelA Synthetase to Carbon Source Diauxic Growth Transitions in Escherichia coli.</a> Frontiers in Microbiology. , (2018).</li><li>Varik, V., Oliveira, S. R. A., Hauryliuk, V., Tenson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPLC-based+quantification+of+bacterial+housekeeping+nucleotides+and+alarmone+messengers+ppGpp+and+pppGpp.">HPLC-based quantification of bacterial housekeeping nucleotides and alarmone messengers ppGpp and pppGpp.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11022 (2017).</li><li>Rhee, H. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Fluorescent+Chemosensor+for+the+Bacterial+Alarmone+(p)ppGpp.">Selective Fluorescent Chemosensor for the Bacterial Alarmone (p)ppGpp.</a> J. Am. Chem. Soc. 130 (3), 784-785 (2008).</li><li>Wang, J., Chen, W., Liu, X., Wesdemiotis, C., Pang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mononuclear+Zinc+Complex+for+Selective+Detection+of+Diphosphate+via+Fluorescence+ESIPT+Turn-On.">A Mononuclear Zinc Complex for Selective Detection of Diphosphate via Fluorescence ESIPT Turn-On.</a> Journal of Materials Chemistry B. 2 (21), 3349-3354 (2014).</li><li>Pokhilko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+nutrient+limitation+in+growing+E.+coli:+a+mathematical+model+of+a+ppGpp-based+biosensor.">Monitoring of nutrient limitation in growing E. coli: a mathematical model of a ppGpp-based biosensor.</a> BMC Systems Biology. 11 (1), 106 (2017).</li><li>Funabashi, H., Mie, M., Yanagida, Y., Kobatake, E., Aizawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+monitoring+of+cellular+physiological+status+depending+on+the+accumulation+of+ppGpp.">Fluorescent monitoring of cellular physiological status depending on the accumulation of ppGpp.</a> Biotechnology Letters. 24 (4), 269-273 (2002).</li><li>Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+medium+for+enterobacteria.">Culture medium for enterobacteria.</a> Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Peselis, A., Serganov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ykkC+riboswitches+employ+an+add-on+helix+to+adjust+specificity+for+polyanionic+ligands.">ykkC riboswitches employ an add-on helix to adjust specificity for polyanionic ligands.</a> Nature Chemical Biology. 14 (9), 887-894 (2018).</li><li>Oki, T., Yoshimoto, A., Sato, S., Takamatsu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purine+nucleotide+pyrophosphotransferase+from+Streptomyces+morookaensis,+capable+of+synthesizing+pppApp+and+pppGpp.">Purine nucleotide pyrophosphotransferase from Streptomyces morookaensis, capable of synthesizing pppApp and pppGpp.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology. 410 (2), 262-272 (1975).</li><li>Travers, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppApp+alters+transcriptional+selectivity+of+Escherichia+coli+RNA+polymerase.">ppApp alters transcriptional selectivity of Escherichia coli RNA polymerase.</a> FEBS Letters. 94 (2), 345-348 (1978).</li><li>Bruhn-Olszewska, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+comparisons+of+(p)ppApp+vs+(p)ppGpp+for+Escherichia+coli+RNA+polymerase+binding+sites+and+for+rrnB+P1+promoter+regulatory+responses+in+vitro.">Structure-function comparisons of (p)ppApp vs (p)ppGpp for Escherichia coli RNA polymerase binding sites and for rrnB P1 promoter regulatory responses in vitro.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms. 1861 (8), 731-742 (2018).</li></ol>

השגת התווית האחידה של התאים היא צעד קריטי עבור פרוטוקול זה. לפיכך, השימוש במדיה מוגדרת, כגון מדיה מסוג מגבים או טריס, הינו חיוני כדי לאפשר וריאציה של ריכוזי פוספט לנושא ופעילות מסוימת. אין אפשרות להשתמש באמצעי מדיה מואגור פוספט, כגון M9 או מדיה A. רוב המדיה הלא מוגדרת מכילה כמויות משתנים של פו...

השליח (p) ppgpp השני הוא מווסת גלובלי המודוללי את הביטוי של מספר רב של גנים, כולל גנים עבור סינתזה הריבוזומים וחומצות אמינו1,2. למרות שהתגלו בתחילה בשנת החיידק הקולי3, (p) ppgpp ניתן למצוא הן בקטריה גראם חיוביים גראם שליליים, כמו גם במפעל כלורפור4,5. עבור E. coli וחיידקים גראם שליליים אחרים, (p) ppgpp אינטראקציה ישירה עם RNA פולימראז בשני אתרים שונים6,7,8. ב גראם חיוביים, (p) ppgpp מעכב gtp שפע, אשר חש על ידי קודי, מחייב gtp חלבון עם מוטיבים לזיהוי דנ א ספציפי גנטי שמוביל תקנה9,10. (p) ppgpp מצטבר בתגובה לרעב עבור חומרים מזינים שונים ותנאי סטרס, וכתוצאה מכך צמיחה איטית והתאמות של ביטוי גנים כדי לאפשר הסתגלות לחץ11,12.
כמות הנטו של ppGpp שנצבר משקפת איזון בין חומרים הידרוקלז לבין פעילויות. ב -E. coli לה היא הבורסה החזקה, והנקודה היא ביותפקודית, עם הידרולז חזק ומגוון של הבורסה החלשה, שכל אחד מהם עשוי להיות מוסדר בצורה שונה באופן תלוי בלחץ. הבורסה החזקה ביותר מופעלת כאשר הזמינות של codon מחויב trna הטעונה לאתר הריבוזומבית כאשר הוא לא מצליח לעמוד בדרישות של סינתזה חלבון13,14,15. כתם חלש (p) ppGpp חומרים הבורסה מופעלת בעוד חזקה (p) ppGpp הידרולז הוא מעוכב בתגובה לתנאי לחץ אחרים דרך מנגנונים אחרים. בתנאים מסוימים, חלבונים כגון ACP או rsd יכול לאגד לספוט, אשר גם לשנות את האיזון בין הידרוליזה וסינתזה16,17. ב גראם תוצאות חיוביות, סינתזה והידרוליזה משקפים איזון מורכב יותר בין החלבון ההומובית היחיד של לה ספוט (RSH) עם סינתזה חזקה ופעילויות הידרוליזה, כמו גם הידרוליסים קטנים ו/או חומרים מטעים12.
The (p) ונוקלאוטידים התגלו לראשונה כמו יוצא דופן 32p המסומנים כתמים הופיעו על אדיגרמות אוטומטית של כרומטוגרמות דק שכבה (חום) במהלך התגובה המחמירים הנגרמת על ידי חומצה אמינית הרעבה3. פרוטוקולים תיוג מפורט יותר נבדקו 18. הפרוטוקול המתואר כאן (איור 1) הוא שינוי של הפרוטוקולים הללו המאפשר בניטור הצמיחה של דגימות מרובות על צלחות microtiter. זה מקל על הערכות ביולוגיות וטכניות מרובות של (p) שינויי שפע ppGpp ופותחה בתחילה למחקרים של משמרות diauxic19. התוויות של (p) ppGpp עם 32p וזיהוי על ידי ומאפשר גם מדידות של (p) שיעורי השפלה ppGpp. שיטות חלופיות פותחו כדי לקבוע (p) רמות ppGpp כגון ספקטרומטר המוני, מיטובי20, כימוטוחיישנים פלורסנט21,22, ו-gfp גן Fusions ליזמים המושפעים על ידי ppgpp23, 24. כימוחיישנים פלורסנט כרגע יש שימוש מוגבל בשל משמרות ספקטרליות קטנות לאחר הכריכה ppgpp, כמו גם בעיות ההבחנה בין ppgpp ו pppGpp21. שיטה זו יעילה כדי לזהות (p) ppGpp ב מבחנה, אבל לא בתמציות הסלולר. שיטות הקשורות לשיטות שופרו ב-20 אך דורשות ציוד יקר ואינן מותאם היטב לרמה גבוהה. לבסוף, GFP fusions יכול לתת הערכה של הפעלה תלויה ppGpp או עיכוב, אבל לא למדוד ppGpp עצמו. בעוד כל אחת השיטות החלופיות הללו הם יקרי ערך, הם דורשים ציוד יקר או הידיים בזמן משמעותי, או שהם בדרך כלל לא קלה לדגימה קינטית מרובים עיבוד הבאים. עם השיטה המתוארת כאן, ניתן להחיל דגימות של 96 על שש צלחות ה-לחות ב-20 דקות (18 דגימות לצלחת), שנפתרה על-ידי התפתחות הפיתוח בפחות מכמה שעות, עם נתונים כמותיים שהתקבלו לאחר מספר שעות או לילה, בהתאם לתיוג עוצמה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(NH4)6(MO7)24</td>
			<td>Fisher Scientifics</td>
			<td>A-674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoradiography film</td>
			<td>Denville scientific inc.</td>
			<td>E3218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>1-1309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>RPI</td>
			<td>C61000-25.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2</td>
			<td>Fisher Scientifics</td>
			<td>C-371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>1843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4</td>
			<td>Fisher Scientifics</td>
			<td>I-146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Fisher Biotech</td>
			<td>BP1215-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Macron</td>
			<td>4912-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO4</td>
			<td>Macron</td>
			<td>2549-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3PO4</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>0260-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2SO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9458-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Biotech</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Valine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V-6504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher Scientifics</td>
			<td>FL-06-0303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader Synergy HT</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-9522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1254-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>7892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>3624-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>7917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0171-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-32 radionuclide, orthophosphoric acid in 1 mL water (5 mCi)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEX053005MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage phosphor screen</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>So230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-4625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC PEI Cellulose F</td>
			<td>Merk-Millipore</td>
			<td>1.05579.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine</td>
			<td>RPI</td>
			<td>T2400-500.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon 9400 imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4</td>
			<td>Fisher Scientifics</td>
			<td>Z-68</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using microtiter dish radiolabeling for multiple in vivo measurements of escherichia coli (p)ppgpp followed by thin layer chromatography

(P) הנוקלאוטיד ppGpp מתפקד כווסת גלובלי בחיידקים בתגובה למגוון רחב של מתח פיזי ותזונתי. יש לו התחלה מהירה, בשניות, אשר מוביל להצטברות של רמות הגישה או לחרוג אלה של בריכות GTP. היפוך מתח מקרים היעלמות מהירה של (p) ppGpp, לעתים קרובות עם מחצית חיים של פחות מדקה. הנוכחות של (p) ppGpp תוצאות שינויים של ביטוי גנים סלולריים ומטבוליזם המונה את ההשפעות המזיקות של מתח. גראם שליליים וחיידקים גראם חיוביים יש מנגנוני תגובה שונים, אבל שניהם תלויים (p) הריכוז ppGpp. בכל מקרה, יש צורך לנטר בו הרבה תרבויות בקטריאלי רדיויניום במרווחי זמן שעשויים להשתנות מ 10 שניות לשעות במהלך תקופות מעבר הלחץ הקריטי. פרוטוקול זה מטפל באתגר הטכני הזה. השיטה מנצלת חממות מבוקרת טמפרטורה ושייקר מבוקרים המאפשרים ניטור מקבילי של הצמיחה (ספיגה) ודגימה מהירה של תרבויות הפוספט האחיד והחד כדי לפתור ולכמת בריכות נוקלאוטיד כרומטוגרפיה בעלת שכבה דקה. בפיי-תאית כמויות קטנות של דגימה נחוצות עבור שכפול טכני וביולוגי מרובים של ניתוחים. מעברים צמיחה מורכבים, כגון הצמיחה diauxic ו מהירה (p) שיעורי המחזור ppGpp ניתן לכמת המוערך על ידי שיטה זו.

ב -E. coli K-12 זנים, תוספת ולין מעוררת הרעב אנדוגניים של isoleucine, אשר התוצאות עלייה של רמות ppgpp לאחר 5 דקות3. תאים שגדלו בתוך מגבים המכילים את כל חומצות אמינו למעט ILV היו תוויות עם 32P כפי שצוין באיור 1. פעם אחת, 6 μl של 10 מ"ג/מ"ל l-valine (100 μg/ml ריכוז סופי) נוספה כדי ?...

Watch this Scientific Journal Video about Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli pppGpp Followed by Thin Layer Chromatography at JoVE.com

Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli pppGpp Followed by Thin Layer Chromatography

התפתחותם של התרבויות החיידקי רדיויניום בצלחות microtiter מאפשר דגימת תפוקה גבוהה המאפשרת שכפול טכני וביולוגי מרובים מספר השפע של הבריכה נוקלאוטיד, כולל זה של (p) ppGpp. ההשפעות של מעברים צמיחה שעוררה מקורות של לחץ פיזיולוגי, כמו גם התאוששות מהלחץ ניתן לפקח.

באמצעות Microtiter צלחת Radiolabeling עבור מספר מדידות Vivo של es, coli (p) ppGpp ואחריו כרומטוגרפיה שכבה דקה

The (p)ppGpp nucleotide functions as a global regulator in bacteria in response to a variety of physical and nutritional stress. It has a rapid onset, in ...

שיטה זו מודדת את רמות הרגולטור העולמי ppGpp בתוך תנאי צמיחה שונים ומצבי לחץ. PpGpp ניתן למצוא גרם חיידקים חיוביים ושליליים, כמו גם כלורופלסט. PpGpp יש התפרצות מהירה בשניות, אשר להוביל קשר שני מהיר פעם הלחץ מיוצר.בו זמנית, יש לו זמן מחצית חיים קצר, עד 30 שניות. לכן, יש צורך לפקח על תרבות רבה במרווחי זמן שעשויים להשתנות מ 10 שניות לשעות, כולל מעברים לחוצים. אנחנו גם radiolabel תרבות חיידקים במנות microtiter מקל דגימות תפוקה גבוהה המאפשרים שכפולים טכניים וביולוגיים מרובים.הקפד לפעול בהתאם לאמצעי הבטיחות המתאימים בעת עבודה עם חומרים רדיואקטיביים. כדי להתחיל בהליך זה, הכן את כל המדיה כמפורט בפרוטוקול הטקסט. לגדול תרבויות לילה בתקשורת MOPS עם שלושה מילימולר נתרן פוספט.הוסף 550 מיקרוליטרים של מדיה MOPS, רצף 0.2 נשא נתרן פוספט micromolar ו 30 microliters של כל inoculum חיידקים ל בארות של צלחת 24 גם. פעולה זו תגרום inoculum ראשוני עם OD600 של 0.1. הוסף מדיה טרייה למדיה אחת וכן בקרת סטריליות.מניחים את הצלחת באינקובטור רועד ב 37 מעלות צלזיוס, רועד ב 900 סל"ד במשך 30 דקות. ניתן לפקח על הצמיחה באמצעות קורא לוחות עם לוחית משכפלת במקביל במדיה חסר p32 באמצעות קורא לוחות תוך דגירה באותם תנאים. לאחר מכן, להוסיף 100 microcuries של p32 אורתופוספט לכל באר של הצלחת.לגדל את התרבויות באינקובטור רועד עבור אחד עד שניים הכפלות כדי לאפשר תווית חיצונית במידה רבה לצייד עם בריכות נוקלאוטידים בין תאיים. להדמיה נכונה, אף אחד מהחומר הפעיל לא היה בשימוש בסרטון זה. בניסוי אמיתי, נדרש מיגון נכון, כמו גם ניטור מתמיד לזיהום עם מד סקר.ראשית, לגרום ללחץ באמצעות שיטה המתאימה לסוג של מתח למד. לאחר מכן, להוסיף 20 microliters של כל מדגם תא שכותרתו צינור PCR נפרד 0.2 מיליליטר, המכיל 20 microliters של קרח קר שש חומצה פורמית טוחן. מיד מניחים את הדגימות על קרח יבש.שפר את יעילות החילוץ התאי בשלושה מחזורים של הקפאה והפשרה. רגע לפני התצפית PEI תאית כרומטוגרמות שכבה דקה, צנטריפוגה הדגימות במשך דקה אחת במהירות המרבית כדי גלולה פסולת התא. ראשית, להגדיר 20 על ידי 20 ס"מ PEI תאית צלחת TLC.השתמש במספריים כדי להסיר את חמשת סנטימטרים העליונים. ולהשתמש בעיפרון רך כדי לסמן קו מקור סנטימטר אחד מהקצה. החל טיפה חמישה מיקרוליטר של כל מדגם על פני השטח PEI.לפני שהנקודה יכולה להתייבש, מעבירים את הצלחת למיכל המכיל שכבה של 1.5 מונופוטזיום פוספט טוחן שהוא רדוד מספיק כדי לא לגעת במקום דגימת המקור. מכסים את המיכל עם אטום אטום, ומאפשרים עלייה נוזלית לראש הסדין הקצוץ באורך 15 ס"מ. לאחר מכן, הסר את הכרומטוגרמה המפותחת במלואה וייבש אותה בטמפרטורת החדר.חותכים ומשליכים את החלק העליון של הכרומטוגרמה המכילה את P32 בחינם לפסולת רדיואקטיבית. השתמש במסך זרחן כדי לחשוף את הסרטים האודיורדיוגרפיים בן לילה. למחרת, לפתח את הסרט ולהשתמש זרחן כדי ללכוד ולכימת את האות הירוק של הזרחן.לאחר מכן, השתמש בתוכנת ImageJ כדי לכמת את הנקודות הרדיואקטיביות. לאחר לעורר מתח או רעב לזמן מספיק כדי לאפשר הצטברות ppGpp, להשתמש בשיטה המתאימה כדי להפוך את הלחץ. קח דגימות כל 20 עד 30 שניות עד שתי דקות ועבד את הדגימות כפי שתואר קודם לכן.לאחר פיתוח TLC, ואת רמות ppGpp מתקבלים במהלך קורס הזמן, לתכנן את התוכן ppGpp שיורית על עלילה חצי לוגריתמית לעומת הזמן. במחקר זה, תאים הגדלים ב- MOPS המכילים את כל חומצות האמינו למעט ILV מסומנים עם P32. לאחר שכותרתו, L ואלין מתווסף לייצר רעב isoleucine.לאחר חמש דקות, עלייה ישנה של שתיים וחצי ברמות הטטרה והפנטפוספט של גואנוזין התרחשה. פקד שלילי של מדגם ללא תווית תא משמש כדי לזהות תרכובות אפשריות כי הם לא אורתופוספט במקור P32. היפוך של רעב איזולאוצין יכול להיות מושגת על ידי כלוראמפניקול, מעכב של סינתזת חלבון, אשר מפחית את הצריכה של tRNA איזולאוצין טעון, בתורו, משחזר יחס גבוה של טעון tRNA טעון.הפעלה של סינתזת ppGpp חזקה בתתיווך rela בוטלה, המאפשר מידה של השפלה ppGpp ללא הפרעה על ידי סינתזה שיורית. במקרה זה, ppGpp נרקב עם זמן מחצית חיים של כ 64 שניות. חשוב לתת לתאים לגדול במשך כמה דורות כדי להשיג תיוג אחיד לפני גרימת כל מתח או רעב.מכיוון ש- ppGpp מתפשט באופן נרחב בקרב חיידקים, ניתן ליישם שיטה זו על אורגניזמים אחרים. שינוי שיטת הפיתוח של TLC יכול לאפשר הפרדה נאותה של כל הנוקלאוטידים הרגולטוריים, כגון ppApp. P52 הוא איזוטופ פולט טוב יותר, ולכן חשוב להשתמש מיגון תקין כראוי להשליך כראוי כל שאריות.

Research

JoVE Journal

Biology

Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli (p)ppGpp Followed by Thin Layer Chromatography

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI הכנה לדוגמא: שיטת אולטרה שכבה דקה

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Assay למדידת פעילות Escherichia coli ועין מתנהלת ליזין Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC)

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography TLC Coupled with Gas-Liquid Chromatography GLC

Thaliana ארבידופסיס פולאר Glycerolipid פרופיל ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) יחד עם כרומטוגרפיה גז נוזלי (GLC)

Biological membranes separate cells from the environment. From a single cell to multicellular plants and animals, glycerolipids, such as ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

הקרנת תפוקה גבוהה של פעילות Endoglucanase פטרייתיים ב Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

ב אנדוציטוזה כבד vivo ואחריו טיהור בתאי הכבד על ידי זלוף כבד

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood.  The basic architecture of the liver is illustrated in ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

מיפוי רשתות פונקציונליות חיידקיים ומסלולים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות מערכים גנטיים סינטטיים

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

ראפיד פרוטוקול להכנת Electrocompetent<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; ו<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

איתור של שידור חי<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; O157: H7 תאים על ידי PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

תועלת רבה פנים של Co-ביטוי חלבון ב<em&gt; Coli Escherichia</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...