Name: using microtiter dish radiolabeling for multiple in vivo measurements of escherichia coli (p)ppgpp followed by thin layer chromatography
Uploaded: 2019-06-04T14:00:00
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この研究は、ユーニス・ケネディ・シュライバー国立小児保健人間開発研究所(NIH)の内壁研究プログラムを支援しました。

1. メディアの準備
<ol><li>
MOPS(3-モルフォリノ)プロパンスルホン酸25の場合は、10x MOPS塩の1/10体積、100倍の微量栄養素溶液の1/100体積、一晩培養用リン酸3mM、または32Pで均一な標識を行うためのリン酸0.2mMナトリウムを使用します。 0.2% ブドウ糖と 1 μg/mL チアミン (ビタミン B1).必要に応じて 40 μg/mL でアミノ酸を追加します。
	<ol>
<li>MOPS塩の場合は、400 mM...

<ol>
	<li>Cashel, M., Gentry, D., Hernandez, V., Vinella, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stringent+Response.">The stringent Response.</a> Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology. , 1458-1489 (1996).</li><li>Magnusson, L. U., Farewell, A., Nystr&#246;m, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp:+a+global+regulator+in+Escherichia+coli.">ppGpp: a global regulator in Escherichia coli.</a> Trends in Microbiology. 13 (5), 236-242 (2005).</li><li>Cashel, M., Gallant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Compounds+implicated+in+the+Function+of+the+RC+Gene+of+Escherichia+coli.">Two Compounds implicated in the Function of the RC Gene of Escherichia coli.</a> Nature. 221 (5183), 838-841 (1969).</li><li>Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+horizons+for+(p)ppGpp+in+bacterial+and+plant+physiology.">New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology.</a> Trends in Microbiology. 14 (1), 45-54 (2006).</li><li>Atkinson, G. C., Tenson, T., Hauryliuk, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RelA/SpoT+homolog+(RSH)+superfamily:+distribution+and+functional+evolution+of+ppGpp+synthetases+and+hydrolases+across+the+tree+of+life.">The RelA/SpoT homolog (RSH) superfamily: distribution and functional evolution of ppGpp synthetases and hydrolases across the tree of life.</a> PloS One. 6 (8), e23479 (2011).</li><li>Mechold, U., Potrykus, K., Murphy, H., Murakami, K. S., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+by+ppGpp+versus+pppGpp+in+Escherichia+coli.">Differential regulation by ppGpp versus pppGpp in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 41 (12), 6175-6189 (2013).</li><li>Molodtsov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+Effector+ppGpp+Potentiates+the+Inhibition+of+Transcript+Initiation+by+DksA.">Allosteric Effector ppGpp Potentiates the Inhibition of Transcript Initiation by DksA.</a> Molecular Cell. 69 (5), 828-839 (2018).</li><li>Ross, W., Sanchez-Vazquez, P., Chen, A. Y. Y., Lee, J. -. H. H., Burgos, H. L. L., Gourse, R. L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp+Binding+to+a+Site+at+the+RNAP-DksA+Interface+Accounts+for+Its+Dramatic+Effects+on+Transcription+Initiation+during+the+Stringent+Response.">ppGpp Binding to a Site at the RNAP-DksA Interface Accounts for Its Dramatic Effects on Transcription Initiation during the Stringent Response.</a> Molecular Cell. 62 (6), 811-823 (2016).</li><li>Kriel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Regulation+of+GTP+Homeostasis+by+(p)ppGpp:+A+Critical+Component+of+Viability+and+Stress+Resistance.">Direct Regulation of GTP Homeostasis by (p)ppGpp: A Critical Component of Viability and Stress Resistance.</a> Molecular Cell. 48 (2), 231-241 (2012).</li><li>Kriel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTP+dysregulation+in+Bacillus+subtilis+cells+lacking+(p)ppGpp+results+in+phenotypic+amino+acid+auxotrophy+and+failure+to+adapt+to+nutrient+downshift+and+regulate+biosynthesis+genes.">GTP dysregulation in Bacillus subtilis cells lacking (p)ppGpp results in phenotypic amino acid auxotrophy and failure to adapt to nutrient downshift and regulate biosynthesis genes.</a> Journal of Bacteriology. 196 (1), 189-201 (2014).</li><li>Potrykus, K., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p)ppGpp:+still+magical.">p)ppGpp: still magical.</a> Annual Review of Microbiology. 62, 35-51 (2008).</li><li>Hauryliuk, V., Atkinson, G. C., Murakami, K. S., Tenson, T., Gerdes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+functional+insights+into+the+role+of+(p)ppGpp+in+bacterial+physiology.">Recent functional insights into the role of (p)ppGpp in bacterial physiology.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (5), 298-309 (2015).</li><li>Arenz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stringent+factor+RelA+adopts+an+open+conformation+on+the+ribosome+to+stimulate+ppGpp+synthesis.">The stringent factor RelA adopts an open conformation on the ribosome to stimulate ppGpp synthesis.</a> Nucleic Acids Research. 44 (13), 6471-6481 (2016).</li><li>Loveland, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome&#8226;RelA+structures+reveal+the+mechanism+of+stringent+response+activation.">Ribosome&#8226;RelA structures reveal the mechanism of stringent response activation.</a> eLife. 5, e17029 (2016).</li><li>Brown, A., Fern&#225;ndez, I. S., Gordiyenko, Y., Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome-dependent+activation+of+stringent+control.">Ribosome-dependent activation of stringent control.</a> Nature. 534 (7606), 277-280 (2016).</li><li>Battesti, A., Bouveret, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acyl+carrier+protein/SpoT+interaction,+the+switch+linking+SpoT-dependent+stress+response+to+fatty+acid+metabolism.">Acyl carrier protein/SpoT interaction, the switch linking SpoT-dependent stress response to fatty acid metabolism.</a> Molecular Microbiology. 62 (4), 1048-1063 (2006).</li><li>Lee, J. -. W., Park, Y. -. H., Seok, Y. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rsd+balances+(p)ppGpp+level+by+stimulating+the+hydrolase+activity+of+SpoT+during+carbon+source+downshift+in+Escherichia+coli.">Rsd balances (p)ppGpp level by stimulating the hydrolase activity of SpoT during carbon source downshift in Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (29), E6845-E6854 (2018).</li><li>Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+(p)ppGpp+Accumulation+Patterns+in+Escherichia+coli+mutants.">Detection of (p)ppGpp Accumulation Patterns in Escherichia coli mutants.</a> Molecular Microbiology Techniques. 3, 341-356 (1994).</li><li>Fern&#225;ndez-Coll, L., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+SpoT+Hydrolase,+SpoT+Synthetase,+and+RelA+Synthetase+to+Carbon+Source+Diauxic+Growth+Transitions+in+Escherichia+coli.">Contributions of SpoT Hydrolase, SpoT Synthetase, and RelA Synthetase to Carbon Source Diauxic Growth Transitions in Escherichia coli.</a> Frontiers in Microbiology. , (2018).</li><li>Varik, V., Oliveira, S. R. A., Hauryliuk, V., Tenson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPLC-based+quantification+of+bacterial+housekeeping+nucleotides+and+alarmone+messengers+ppGpp+and+pppGpp.">HPLC-based quantification of bacterial housekeeping nucleotides and alarmone messengers ppGpp and pppGpp.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11022 (2017).</li><li>Rhee, H. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Fluorescent+Chemosensor+for+the+Bacterial+Alarmone+(p)ppGpp.">Selective Fluorescent Chemosensor for the Bacterial Alarmone (p)ppGpp.</a> J. Am. Chem. Soc. 130 (3), 784-785 (2008).</li><li>Wang, J., Chen, W., Liu, X., Wesdemiotis, C., Pang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mononuclear+Zinc+Complex+for+Selective+Detection+of+Diphosphate+via+Fluorescence+ESIPT+Turn-On.">A Mononuclear Zinc Complex for Selective Detection of Diphosphate via Fluorescence ESIPT Turn-On.</a> Journal of Materials Chemistry B. 2 (21), 3349-3354 (2014).</li><li>Pokhilko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+nutrient+limitation+in+growing+E.+coli:+a+mathematical+model+of+a+ppGpp-based+biosensor.">Monitoring of nutrient limitation in growing E. coli: a mathematical model of a ppGpp-based biosensor.</a> BMC Systems Biology. 11 (1), 106 (2017).</li><li>Funabashi, H., Mie, M., Yanagida, Y., Kobatake, E., Aizawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+monitoring+of+cellular+physiological+status+depending+on+the+accumulation+of+ppGpp.">Fluorescent monitoring of cellular physiological status depending on the accumulation of ppGpp.</a> Biotechnology Letters. 24 (4), 269-273 (2002).</li><li>Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+medium+for+enterobacteria.">Culture medium for enterobacteria.</a> Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Peselis, A., Serganov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ykkC+riboswitches+employ+an+add-on+helix+to+adjust+specificity+for+polyanionic+ligands.">ykkC riboswitches employ an add-on helix to adjust specificity for polyanionic ligands.</a> Nature Chemical Biology. 14 (9), 887-894 (2018).</li><li>Oki, T., Yoshimoto, A., Sato, S., Takamatsu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purine+nucleotide+pyrophosphotransferase+from+Streptomyces+morookaensis,+capable+of+synthesizing+pppApp+and+pppGpp.">Purine nucleotide pyrophosphotransferase from Streptomyces morookaensis, capable of synthesizing pppApp and pppGpp.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology. 410 (2), 262-272 (1975).</li><li>Travers, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppApp+alters+transcriptional+selectivity+of+Escherichia+coli+RNA+polymerase.">ppApp alters transcriptional selectivity of Escherichia coli RNA polymerase.</a> FEBS Letters. 94 (2), 345-348 (1978).</li><li>Bruhn-Olszewska, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+comparisons+of+(p)ppApp+vs+(p)ppGpp+for+Escherichia+coli+RNA+polymerase+binding+sites+and+for+rrnB+P1+promoter+regulatory+responses+in+vitro.">Structure-function comparisons of (p)ppApp vs (p)ppGpp for Escherichia coli RNA polymerase binding sites and for rrnB P1 promoter regulatory responses in vitro.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms. 1861 (8), 731-742 (2018).</li></ol>

細胞のほぼ均一な標識を達成することは、このプロトコルの重要なステップです。したがって、MOPSまたはTrisメディアなどの定義された媒体の使用は、キャリアリン酸濃度および特定の活性の変動を可能にするために重要である。M9 やメディア A などのリン酸緩衝メディアは使用できません。ほとんどの未定義の培地には、LB、トリプトン、カサミノ酸などの可変量のリン酸塩が含まれていま...

(p)ppGpp第2のメッセンジャーは、リボソームおよびアミノ酸1、2を合成するための遺伝子を含む多数の遺伝子の発現を調節するグローバルレギュレータである。最初に大腸菌3で発見されたが、(p)ppGppはグラム陽性およびグラム陰性細菌の両方だけでなく、植物の葉緑体4、5で見つけることができる。大腸菌および他のグラム陰性細菌の場合、(p)ppGppは2つの異なる部位6、7、8でRNAポリメラーゼと直接相互作用する。グラム陽性では、(p)ppGppは、CodYによって感知されるGTPの存在量を阻害し、調節9、10につながる遺伝子特異的DNA認識モチーフを有するGTP結合タンパク質である。(p)ppGppは、異なる栄養素およびストレス条件に対する飢餓に応答して蓄積し、ストレス11、12への適応を可能にする遺伝子発現の成長および調整が遅くなる。
ppGpp累積の正味量は、合成酵素とヒドロラーゼ活性のバランスを反映しています。大腸菌RelAは強い合成酵素であり、SpoTは、強いヒドロラーゼと弱い合成酵素を有する二機能性であり、それぞれがストレス依存的な方法で異なる調節される可能性がある。強力なRelA合成酵素は、タンパク質合成13、14、15の要求に追いつかない場合にリボソームA部位に結合したコドン指定荷電tRNAの利用可能性が活性化される。弱いSpoT(p)ppGpp合成酵素は、強い(p)ppGppヒドロラーゼが他のストレス条件に応答し、他のメカニズムを介して阻害される間活性化される。いくつかの条件下では、ACPまたはRsdのようなタンパク質はSpoTに結合することができ、これは加水分解と合成16、17の間のバランスも変化する。グラム陽性では、合成および加水分解は、強力な合成および加水分解活性を持つ単一のRelA SpoTホモログ(RSH)タンパク質と、より小さなヒドロラーゼおよび/または合成酵素12との間のより複雑なバランスを反映する。
(p)ppGppヌクレオチドは、アミノ酸飢餓3によって誘導される厳しい応答の間に薄層クロマトグラム(TLC)の自動ラジオグラムに現れた珍しい32 P標識スポットとして最初に発見された。 より詳細なラベリングプロトコルが18を見直されました。 ここで説明するプロトコル(図1)は、マイクロティタープレート上の複数のサンプルの増殖を監視することを可能にするこれらのプロトコルの変更である。これは、(p)ppGppの豊富な変化の複数の生物学的および技術的な推定を容易にし、当初はダイオシックシフト19の研究のために開発された。32Pによる(p)ppGppのラベリングとTLCによる検出により、(p)ppGpp分解速度の測定も可能です。質量分析、HPLC20、蛍光ケモセンサ21、22、およびppGpp23の影響を受けるプロモーターへのGFP遺伝子融合などの(p)ppGppレベルを決定するための代替方法が開発され、24.蛍光ケモセンサは、現在、ppGppを結合した後の小さなスペクトルシフトによる限られた使用だけでなく、ppGppとpppGpp21を区別する問題を有する。この方法は、(p)ppGppをインビトロで検出するのに効率的であるが、細胞抽出物では検出しない。HPLCを含む方法は20に改善されましたが、高価な機器を必要とし、高スループットに十分に適応していません。最後に、GFP融合はppGpp依存活性化または阻害の推定値を与えることができるが、ppGpp自体を測定しない。これらの代替方法はそれぞれ価値がありますが、高価な機器や実質的なハンズオン時間が必要な場合や、複数の運動サンプリングやその後の処理に対応できません。ここで説明する方法では、96個のサンプルを約20分(プレート当たり18サンプル)で6枚のTLCプレートに適用することができ、TLC開発により数時間未満で解決され、ラベリングに応じて数時間または一晩後に得られた定量データを用いて強度。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(NH4)6(MO7)24</td>
			<td>Fisher Scientifics</td>
			<td>A-674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoradiography film</td>
			<td>Denville scientific inc.</td>
			<td>E3218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>1-1309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>RPI</td>
			<td>C61000-25.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2</td>
			<td>Fisher Scientifics</td>
			<td>C-371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>1843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4</td>
			<td>Fisher Scientifics</td>
			<td>I-146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Fisher Biotech</td>
			<td>BP1215-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Macron</td>
			<td>4912-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO4</td>
			<td>Macron</td>
			<td>2549-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3PO4</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>0260-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2SO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9458-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Biotech</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Valine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V-6504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher Scientifics</td>
			<td>FL-06-0303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader Synergy HT</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-9522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1254-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>7892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>3624-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>7917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0171-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-32 radionuclide, orthophosphoric acid in 1 mL water (5 mCi)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEX053005MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage phosphor screen</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>So230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-4625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC PEI Cellulose F</td>
			<td>Merk-Millipore</td>
			<td>1.05579.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine</td>
			<td>RPI</td>
			<td>T2400-500.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon 9400 imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4</td>
			<td>Fisher Scientifics</td>
			<td>Z-68</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using microtiter dish radiolabeling for multiple in vivo measurements of escherichia coli (p)ppgpp followed by thin layer chromatography

(p)ppGppヌクレオチドは、様々な身体的および栄養的ストレスに応答して細菌のグローバルレギュレータとして機能します。これは、数秒で急速な発症を有し、GTPプールのそれらに近づくか、またはそれを超えるレベルの蓄積につながる。ストレス反転は、(p)ppGppの急速な消失を起こし、多くの場合、1分未満の半減期を伴う。(p)ppGppの存在は、ストレスの有害な影響に対抗する細胞遺伝子発現および代謝の変化をもたらす。グラム陰性およびグラム陽性細菌は異なる応答機構を有するが、両方とも(p)ppGpp濃度に依存する。いずれにせよ、重大なストレス移行期間中に10秒から数時間に変化する可能性のある時間間隔で多くの放射標識細菌培養物を同時に監視する必要があります。このプロトコルは、この技術的な課題に対処します。この方法は、成長(吸光度)の並列モニタリングと均一リン酸放射標識培養物の迅速なサンプリングを可能にする温度およびシェーカー制御マイクロタイター皿インキュベーターを利用して、ヌクレオチドプールを解決し、定量化するPEIセルロース上の薄層クロマトグラフィー。分析の複数の技術的および生物学的複製には、少量のサンプルが必要です。ダイオークティック成長や急速な(p)ppGpp回転率などの複雑な成長遷移は、この方法によって定量的に評価することができる。

大腸菌K-12株では、バリンの添加はイソロイシンの内因性飢餓を引き起こし、5分3分後にppGppレベルの増加をもたらす。ILVを除くすべてのアミノ酸を含むMOPSで増殖した細胞を、図1に示すように32Pで標識した。標識後、10mg/mL L-バリンの6 μL(100 μg/mL最終濃度)を添加し、イソロイシン飢餓を生成した。試料を0分及び5分後に採取した。5分...

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Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli pppGpp Followed by Thin Layer Chromatography

マイクロチター皿における放射標識細菌培養物の成長は、(p)ppGppを含むヌクレオチドプールの豊富さの複数の技術的および生物学的複製アッセイを可能にする高スループットサンプリングを促進する。生理的ストレスの原因によって引き起こされる成長遷移の影響だけでなく、ストレスからの回復を監視することができます。.

大腸菌(p)ppGppの複数の生体内測定に対するマイクロチター皿放射ラベリングの使用、その後に薄層クロマトグラフィー

The (p)ppGpp nucleotide functions as a global regulator in bacteria in response to a variety of physical and nutritional stress. It has a rapid onset, in ...

この方法は、異なる成長条件およびストレス状況の中で、グローバルレギュレータppGppのレベルを測定する。PpGppは、グラム陽性および陰性細菌、ならびに葉芽細胞で見つけることができます。PpGppは数秒で急速な発症を有し、ストレスが発生すると速い第2の関係につながる。同時に、それは30秒まで短い半減期を持っています。したがって、ストレス遷移を含め、10秒から時間まで変化する可能性のある時間間隔で多くの培養を監視する必要があります。マイクロタイターディッシュの細菌培養物の放射ラベルも、複数の技術的および生物学的複製を可能にする高スループットサンプリングを容易にします。放射性物質を扱う際には、適切な安全対策に従ってください。この手順を開始するには、テキスト プロトコルで説明されているとおりに、すべてのメディアを準備します。3ミリモルリン酸ナトリウムとMOPS培地で一晩培養を成長させます.MOPS培地550マイクロリットルを加え、0.2マイクロモルリン酸ナトリウム担体と各細菌接種物の30マイクロリットルを24ウェルプレートの井戸に加えます。これにより、OD600が0.1の初期接種が発生します。1つだけでなく、滅菌制御に新鮮なメディアを追加します。プレートを摂氏37度の振度インキュベーターに入れ、900 RPMで30分間振ります。同じ条件でインキュベートしながらプレートリーダーを使用して、p32を欠いている媒体で平行に複製プレートを有するプレートリーダーを用いて成長を監視することができる。次に、プレートの各ウェルにp32またはリン酸の100マイクロキュリーを加えます。振度インキュベーターで培養物を1~2倍に成長させ、外部ラベルが細胞間ヌクレオチドプールと大部分が平衡化できるようにします。適切な視覚化のために、このビデオではアクティブな材料は使用されなかった。実際の実験では、適切なシールドが必要であり、測量メーターによる汚染を常に監視する必要があります。まず、研究した一種のストレスに適した方法を用いてストレスを誘発する。次に、各標識された細胞サンプルの20マイクロリットルを別々の0.2ミリリットルPCRチューブに加え、20マイクロリットルの氷冷6モルギ酸を含む。すぐにサンプルをドライアイスの上に置きます。凍結と解凍の3サイクルで細胞抽出効率を高めます。PEIセルロース薄層クロマトグラムを見つける直前に、ペレット細胞の破片に最大速度で1分間サンプルを遠心分離します。まず、20%20センチメートルのPEIセルロースTLCプレートをセットする。はさみを使って上の5センチを取り除きます。そして、柔らかい鉛筆を使用して、端から1センチメートルの原点線をマークします。各サンプルの5マイクロリットルの液滴をPEI表面に塗布します。スポットが乾燥する前に、元のサンプルスポットに触れないほど浅い1.5モルのリン酸モノカリウムの層を含むタンクにプレートを移します。気密シールでタンクを覆い、15センチメートルのトリミングシートの上部に液体の上昇を可能にします。その後、完全に開発したクロマトグラムを取り出し、室温で空気乾燥させます。遊離P32を含むクロマトグラムの上部を放射性廃棄物に切り捨てて捨てます。蛍光体スクリーンを使用して、一晩の放射線フィルムを露出させます。翌日、フィルムを開発し、リンイメージャーを使用して蛍光体の緑色信号をキャプチャして定量します。次に、ImageJ ソフトウェアを使用して放射性スポットを定量化します。ppGppの蓄積を可能にするのに十分な時間のストレスまたは飢餓を引き起こした後、適切な方法を使用して応力を逆にします。20 ~ 30 秒ごとに最大 2 分間サンプルを採取し、前述の手順でサンプルを処理します。TLCが開発され、時間経過中にppGppのレベルが得られたら、残りのppGpp含有量を半対数プロット対時間でプロットします。本研究では、ILVを除くすべてのアミノ酸を含むMOPSで増殖した細胞をP32で標識した。ラベルが付くと、Lバリンが追加され、イソロイシン飢餓が生じる。5分後、グアノシンのテトラおよび五リン酸のレベルの2と2.5の古い増加が起こった。細胞の自由標識サンプルの陰性制御は、P32ソースでオルソリン酸塩でない可能性のある化合物を検出するために使用されます。イソロイシン飢餓の逆転は、タンパク質合成の阻害剤であるクロラムフェニコールによって達成され、荷電イソロイシンtRNAの消費を減少させ、次に、荷電していないtRNAに対する高い比率を回復させる。強力な再ラ媒介ppGpp合成酵素の活性化は廃止され、残留合成によって妨げられないppGpp分解の尺度を可能にする。この場合、ppGpp は約 64 秒の半減期で減衰します。ストレスや飢餓を誘発する前に、細胞が均一なラベリングを達成するために、何世代にもわたって細胞を成長させることが重要です。ppGppは細菌間に広く普及しているため、この方法は他の生物にも応用できる。TLC開発方法の改変は、ppAppのようなすべての調節ヌクレオチドの適切な分離を可能にする可能性がある。P52は、より良いエミッタ同位体であるため、適切なシールドを使用し、任意の残留物を適切に廃棄することが重要です。

Research

JoVE Journal

Biology

Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli (p)ppGpp Followed by Thin Layer Chromatography

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDIサンプル調製：超薄層法

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

の活性を測定するアッセイ大腸菌誘導性リジンDecarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC)

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography TLC Coupled with Gas-Liquid Chromatography GLC

気-液クロマトグラフィー（GLC）とあいまって薄層クロマトグラフィー（TLC）によりシロイヌナズナポーラーグリセロ脂質プロファイリング

Biological membranes separate cells from the environment. From a single cell to multicellular plants and animals, glycerolipids, such as ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

における真菌エンドグルカナーゼ活性のハイスループットスクリーニング大腸菌</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

肝灌流による肝細胞の精製した生体肝エンドサイトーシスに

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood.  The basic architecture of the liver is illustrated in ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

細菌機能ネットワークとPathwaysでのマッピング<em&gt;大腸菌</em&gt;合成遺伝子配列を用いて

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

エレクトロ作成のための迅速なプロトコル<em&gt;エシェリヒア·コリ</em&gt;と<em&gt;コレラ菌</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

ライブの検出<em&gt;エシェリヒア·コリ</em&gt; O157：PMA-qPCRによりH7細胞

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

成体マウス頭蓋冠骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞のin vivo 4次元トラッキングで

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

タンパク質の共発現の多面的メリットで<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...