Name: using microtiter dish radiolabeling for multiple in vivo measurements of escherichia coli (p)ppgpp followed by thin layer chromatography
Uploaded: 2019-06-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli pppGpp Followed by Thin Layer Chromatography at JoVE.com

이 연구는 교내 연구 프로그램, 유니스 케네디 슈리버 국립 아동 건강 및 인간 개발 연구소, NIH를 지원했다.

1. 미디어 준비
<ol><li>
MOPS (3-(N-morpholino) 프로판설포닉산) 배지25,10x MOPS 염의 1/10 부피, 100x 미량 영양소 용액의 1/100 부피, 하룻밤 배양용 3 mM 나트륨 인산나트륨 또는 32P로 균일한 라벨링을 위한 0.2 mM 인산나트륨을 사용하십시오. 0.2% 포도당과 1 μg/mL 티아민 (비타민 B1). 필요한 경우 아미노산을 40 μg/mL로 첨가하십시오.
	<ol>
<li>MOPS 소금의 경우 400 mM MOPS, 40 mM ?...

<ol>
	<li>Cashel, M., Gentry, D., Hernandez, V., Vinella, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stringent+Response.">The stringent Response.</a> Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology. , 1458-1489 (1996).</li><li>Magnusson, L. U., Farewell, A., Nystr&#246;m, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp:+a+global+regulator+in+Escherichia+coli.">ppGpp: a global regulator in Escherichia coli.</a> Trends in Microbiology. 13 (5), 236-242 (2005).</li><li>Cashel, M., Gallant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Compounds+implicated+in+the+Function+of+the+RC+Gene+of+Escherichia+coli.">Two Compounds implicated in the Function of the RC Gene of Escherichia coli.</a> Nature. 221 (5183), 838-841 (1969).</li><li>Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+horizons+for+(p)ppGpp+in+bacterial+and+plant+physiology.">New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology.</a> Trends in Microbiology. 14 (1), 45-54 (2006).</li><li>Atkinson, G. C., Tenson, T., Hauryliuk, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RelA/SpoT+homolog+(RSH)+superfamily:+distribution+and+functional+evolution+of+ppGpp+synthetases+and+hydrolases+across+the+tree+of+life.">The RelA/SpoT homolog (RSH) superfamily: distribution and functional evolution of ppGpp synthetases and hydrolases across the tree of life.</a> PloS One. 6 (8), e23479 (2011).</li><li>Mechold, U., Potrykus, K., Murphy, H., Murakami, K. S., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+by+ppGpp+versus+pppGpp+in+Escherichia+coli.">Differential regulation by ppGpp versus pppGpp in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 41 (12), 6175-6189 (2013).</li><li>Molodtsov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+Effector+ppGpp+Potentiates+the+Inhibition+of+Transcript+Initiation+by+DksA.">Allosteric Effector ppGpp Potentiates the Inhibition of Transcript Initiation by DksA.</a> Molecular Cell. 69 (5), 828-839 (2018).</li><li>Ross, W., Sanchez-Vazquez, P., Chen, A. Y. Y., Lee, J. -. H. H., Burgos, H. L. L., Gourse, R. L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp+Binding+to+a+Site+at+the+RNAP-DksA+Interface+Accounts+for+Its+Dramatic+Effects+on+Transcription+Initiation+during+the+Stringent+Response.">ppGpp Binding to a Site at the RNAP-DksA Interface Accounts for Its Dramatic Effects on Transcription Initiation during the Stringent Response.</a> Molecular Cell. 62 (6), 811-823 (2016).</li><li>Kriel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Regulation+of+GTP+Homeostasis+by+(p)ppGpp:+A+Critical+Component+of+Viability+and+Stress+Resistance.">Direct Regulation of GTP Homeostasis by (p)ppGpp: A Critical Component of Viability and Stress Resistance.</a> Molecular Cell. 48 (2), 231-241 (2012).</li><li>Kriel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTP+dysregulation+in+Bacillus+subtilis+cells+lacking+(p)ppGpp+results+in+phenotypic+amino+acid+auxotrophy+and+failure+to+adapt+to+nutrient+downshift+and+regulate+biosynthesis+genes.">GTP dysregulation in Bacillus subtilis cells lacking (p)ppGpp results in phenotypic amino acid auxotrophy and failure to adapt to nutrient downshift and regulate biosynthesis genes.</a> Journal of Bacteriology. 196 (1), 189-201 (2014).</li><li>Potrykus, K., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p)ppGpp:+still+magical.">p)ppGpp: still magical.</a> Annual Review of Microbiology. 62, 35-51 (2008).</li><li>Hauryliuk, V., Atkinson, G. C., Murakami, K. S., Tenson, T., Gerdes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+functional+insights+into+the+role+of+(p)ppGpp+in+bacterial+physiology.">Recent functional insights into the role of (p)ppGpp in bacterial physiology.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (5), 298-309 (2015).</li><li>Arenz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stringent+factor+RelA+adopts+an+open+conformation+on+the+ribosome+to+stimulate+ppGpp+synthesis.">The stringent factor RelA adopts an open conformation on the ribosome to stimulate ppGpp synthesis.</a> Nucleic Acids Research. 44 (13), 6471-6481 (2016).</li><li>Loveland, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome&#8226;RelA+structures+reveal+the+mechanism+of+stringent+response+activation.">Ribosome&#8226;RelA structures reveal the mechanism of stringent response activation.</a> eLife. 5, e17029 (2016).</li><li>Brown, A., Fern&#225;ndez, I. S., Gordiyenko, Y., Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome-dependent+activation+of+stringent+control.">Ribosome-dependent activation of stringent control.</a> Nature. 534 (7606), 277-280 (2016).</li><li>Battesti, A., Bouveret, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acyl+carrier+protein/SpoT+interaction,+the+switch+linking+SpoT-dependent+stress+response+to+fatty+acid+metabolism.">Acyl carrier protein/SpoT interaction, the switch linking SpoT-dependent stress response to fatty acid metabolism.</a> Molecular Microbiology. 62 (4), 1048-1063 (2006).</li><li>Lee, J. -. W., Park, Y. -. H., Seok, Y. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rsd+balances+(p)ppGpp+level+by+stimulating+the+hydrolase+activity+of+SpoT+during+carbon+source+downshift+in+Escherichia+coli.">Rsd balances (p)ppGpp level by stimulating the hydrolase activity of SpoT during carbon source downshift in Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (29), E6845-E6854 (2018).</li><li>Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+(p)ppGpp+Accumulation+Patterns+in+Escherichia+coli+mutants.">Detection of (p)ppGpp Accumulation Patterns in Escherichia coli mutants.</a> Molecular Microbiology Techniques. 3, 341-356 (1994).</li><li>Fern&#225;ndez-Coll, L., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+SpoT+Hydrolase,+SpoT+Synthetase,+and+RelA+Synthetase+to+Carbon+Source+Diauxic+Growth+Transitions+in+Escherichia+coli.">Contributions of SpoT Hydrolase, SpoT Synthetase, and RelA Synthetase to Carbon Source Diauxic Growth Transitions in Escherichia coli.</a> Frontiers in Microbiology. , (2018).</li><li>Varik, V., Oliveira, S. R. A., Hauryliuk, V., Tenson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPLC-based+quantification+of+bacterial+housekeeping+nucleotides+and+alarmone+messengers+ppGpp+and+pppGpp.">HPLC-based quantification of bacterial housekeeping nucleotides and alarmone messengers ppGpp and pppGpp.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11022 (2017).</li><li>Rhee, H. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Fluorescent+Chemosensor+for+the+Bacterial+Alarmone+(p)ppGpp.">Selective Fluorescent Chemosensor for the Bacterial Alarmone (p)ppGpp.</a> J. Am. Chem. Soc. 130 (3), 784-785 (2008).</li><li>Wang, J., Chen, W., Liu, X., Wesdemiotis, C., Pang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mononuclear+Zinc+Complex+for+Selective+Detection+of+Diphosphate+via+Fluorescence+ESIPT+Turn-On.">A Mononuclear Zinc Complex for Selective Detection of Diphosphate via Fluorescence ESIPT Turn-On.</a> Journal of Materials Chemistry B. 2 (21), 3349-3354 (2014).</li><li>Pokhilko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+nutrient+limitation+in+growing+E.+coli:+a+mathematical+model+of+a+ppGpp-based+biosensor.">Monitoring of nutrient limitation in growing E. coli: a mathematical model of a ppGpp-based biosensor.</a> BMC Systems Biology. 11 (1), 106 (2017).</li><li>Funabashi, H., Mie, M., Yanagida, Y., Kobatake, E., Aizawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+monitoring+of+cellular+physiological+status+depending+on+the+accumulation+of+ppGpp.">Fluorescent monitoring of cellular physiological status depending on the accumulation of ppGpp.</a> Biotechnology Letters. 24 (4), 269-273 (2002).</li><li>Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+medium+for+enterobacteria.">Culture medium for enterobacteria.</a> Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Peselis, A., Serganov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ykkC+riboswitches+employ+an+add-on+helix+to+adjust+specificity+for+polyanionic+ligands.">ykkC riboswitches employ an add-on helix to adjust specificity for polyanionic ligands.</a> Nature Chemical Biology. 14 (9), 887-894 (2018).</li><li>Oki, T., Yoshimoto, A., Sato, S., Takamatsu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purine+nucleotide+pyrophosphotransferase+from+Streptomyces+morookaensis,+capable+of+synthesizing+pppApp+and+pppGpp.">Purine nucleotide pyrophosphotransferase from Streptomyces morookaensis, capable of synthesizing pppApp and pppGpp.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology. 410 (2), 262-272 (1975).</li><li>Travers, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppApp+alters+transcriptional+selectivity+of+Escherichia+coli+RNA+polymerase.">ppApp alters transcriptional selectivity of Escherichia coli RNA polymerase.</a> FEBS Letters. 94 (2), 345-348 (1978).</li><li>Bruhn-Olszewska, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+comparisons+of+(p)ppApp+vs+(p)ppGpp+for+Escherichia+coli+RNA+polymerase+binding+sites+and+for+rrnB+P1+promoter+regulatory+responses+in+vitro.">Structure-function comparisons of (p)ppApp vs (p)ppGpp for Escherichia coli RNA polymerase binding sites and for rrnB P1 promoter regulatory responses in vitro.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms. 1861 (8), 731-742 (2018).</li></ol>

세포의 거의 균일 한 라벨링을 달성하는 것은이 프로토콜에 대한 중요한 단계입니다. 따라서 MOPS 또는 Tris 매체와 같은 정의된 매체의 사용은 담체 인산염 농도 및 특정 활성의 변이를 허용하는 데 매우 중요합니다. M9 또는 미디어 A와 같은 인산염 버퍼링 된 미디어는 사용할 수 없습니다. 대부분의 정의되지 않은 매체는 LB, 트립톤 및 카자미노산과 같은 가변적인 양의 인산염을 함유하고 있습니다...

(p)ppGpp 제2 메신저는 리보솜 및 아미노산을 합성하기 위한 유전자를 포함하는 다수의 유전자의 발현을 조절하는 글로벌 레귤레이터1,2. 처음에 대장균3에서 발견되었지만 , (p)ppGpp는 식물 엽록체4,5뿐만아니라 그람 양성 및 그램 음성 박테리아 모두에서 발견 될 수 있습니다. 대장균 및 기타 그람 음성 박테리아의 경우,(p)ppGpp는 두 개의 서로다른 부위6,7,8에서RNA 폴리머라제와 직접 상호 작용합니다. 그람 양성에서, (p)ppGpp는 조절9,10으로이어지는 유전자 특이적 DNA 인식 모티프를 가진 GTP 결합 단백질인 CodY에 의해 감지되는 GTP 풍부를 억제한다. (p)ppGpp는 다른 영양소 및 스트레스 조건에 대한 기아에 대한 응답으로 축적되어, 스트레스11,12에적응할 수 있도록 유전자 발현의 느린 성장 및 조정을 초래한다.
축적된 ppGpp의 순량은 합성체와 하이드라아제 활동 사이의 균형을 반영한다. 대장균RelA는 강한 합성이고 SpoT는 강한 하이드로 라제와 약한 합성으로, 각각스트레스 의존적 방식으로 다르게 조절될 수 있는 이중기능성이다. 강한 RelA 합성은 단백질 합성의 요구를 따라가지 못할 때 리보소말 A 부위에 결합된 코돈 지정 충전 tRNA의 가용성이 활성화되는 경우13,14,15. 약한 SpoT (p)ppGpp 합성효소는 강한 (p)ppGpp 하이드로라제는 다른 스트레스 조건 및 다른 메커니즘에 반응하여 억제되는 동안 활성화된다. 몇몇 조건하에서, ACP 또는 Rsd와 같은 단백질은 또한 가수분해와 합성16,17사이 균형을 바꾸는 SpoT에 묶일 수 있습니다. 그람 양성에서, 합성 및 가수 분해는 강한 합성 및 가수 분해 활동뿐만 아니라 작은 하이드로 라제 및 / 또는 합성 12와 단일 RelASpoT 상동체 (RSH) 단백질 사이의 더 복잡한 균형을 반영한다.
(p)ppGpp 뉴클레오티드는 아미노산 기아에 의해 유도된 엄격한 반응 동안 얇은 층 크로마토그램(TLC)의 자가 방사성도에 나타난특이한 32P표지 반점으로 처음 발견되었다 3. 더 자세한 라벨링 프로토콜은 18. 여기서 설명된프로토콜(도 1)은 마이크로티터 플레이트상에서 다중 샘플의 성장을 모니터링할 수 있는 이러한 프로토콜의 수정이다. 이는 (p)ppGpp 풍부도 변화의 여러 생물학적 및 기술적 추정치를 용이하게 하고처음에 19의 디오틱 시프트연구를 위해 개발되었다. (p)ppGpp의 라벨링(p)ppGpp와 32P및 TLC에 의한 검출은 또한 (p)ppGpp 저하율의 측정을 허용한다. (p)ppGpp 수준을 결정하기 위한 대체 방법이 개발되었으며, 이러한 질량 분석법, HPLC20,형광 화학센서21,22,및 GFP 유전자 융합ppPp23에의해 영향을 받는 프로모터에대한, 24. 형광 화학 센서는 현재 ppGpp 를 바인딩 한 후 작은 스펙트럼 이동뿐만 아니라 ppGpp와 pppGpp21을구별하는 문제로 인해 제한된 사용이 있습니다. 이 방법은 시험관 내에서 (p)ppGpp를 검출하는 데 효율적이지만 세포 추출물에서는 검출하지 않는다. HPLC와 관련된 방법은20개 개선되었지만 고가의 장비가 필요하며 높은 스루풋에 잘 적응되지 않았습니다. 마지막으로, GFP 융합은 ppGpp 의존적 활성화 또는 억제의 추정치를 제공할 수 있지만, ppGpp 자체를 측정하지는 않는다. 이러한 대체 방법 각각은 가치가 있지만 값비싼 장비 나 실질적인 실습 시간이 필요하거나 여러 역학 샘플링 및 후속 처리를 수행할 수 없습니다. 여기에 설명된 방법을 통해 96개의 샘플을 약 20분(플레이트당 18개 샘플)에 6개의 TLC 플레이트에 적용할 수 있으며, TLC 개발에 의해 2시간 이내에 해결되며, 라벨링에 따라 몇 시간 또는 하룻밤 후에 얻은 정량적 데이터로 해결됩니다. 강도.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(NH4)6(MO7)24</td>
			<td>Fisher Scientifics</td>
			<td>A-674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoradiography film</td>
			<td>Denville scientific inc.</td>
			<td>E3218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>1-1309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>RPI</td>
			<td>C61000-25.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2</td>
			<td>Fisher Scientifics</td>
			<td>C-371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>1843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4</td>
			<td>Fisher Scientifics</td>
			<td>I-146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Fisher Biotech</td>
			<td>BP1215-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Macron</td>
			<td>4912-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO4</td>
			<td>Macron</td>
			<td>2549-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3PO4</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>0260-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2SO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9458-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Biotech</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Valine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V-6504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher Scientifics</td>
			<td>FL-06-0303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader Synergy HT</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-9522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1254-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>7892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>3624-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>7917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0171-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-32 radionuclide, orthophosphoric acid in 1 mL water (5 mCi)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEX053005MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage phosphor screen</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>So230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-4625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC PEI Cellulose F</td>
			<td>Merk-Millipore</td>
			<td>1.05579.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine</td>
			<td>RPI</td>
			<td>T2400-500.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon 9400 imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4</td>
			<td>Fisher Scientifics</td>
			<td>Z-68</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using microtiter dish radiolabeling for multiple in vivo measurements of escherichia coli (p)ppgpp followed by thin layer chromatography

(p)pppp 뉴클레오티드는 다양한 신체적 및 영양적 스트레스에 반응하여 박테리아에서 글로벌 조절제로서 기능한다. 그것은 GTP 풀의 접근 또는 초과 수준의 축적에 이르게 초, 빠른 발병이있다. 스트레스 반전은 (p)ppGpp의 급속한 실종을 발생, 종종 1 분 미만의 반감기와. (p)ppGpp의 존재는 스트레스의 해로운 영향에 대응하는 세포 유전자 발현 및 신진 대사의 변경으로 이됩니다. 그람 음성 및 그람 양성 박테리아는 서로 다른 반응 메커니즘을 가지고 있지만 둘 다 (p)ppGpp 농도에 의존한다. 어쨌든, 중요한 스트레스 전환 기간 동안 10 초에서 시간까지 다를 수있는 시간 간격으로 많은 방사성 표지 된 박테리아 배양을 동시에 모니터링 할 필요가 있습니다. 이 프로토콜은 이러한 기술적 문제를 해결합니다. 이 방법은 온도 및 셰이커 제어 마이크로 티터 접시 인큐베이터를 활용하여 성장 (흡광도)의 병렬 모니터링및 균일한 인산염 방사성 표지 배양물의 신속한 샘플링을 통해 뉴클레오티드 풀을 해결하고 정량화합니다. PEI 셀룰로오스에 얇은 층 크로마토그래피. 분석의 여러 기술적 및 생물학적 복제에 소량의 샘플이 필요합니다. 이러한 복잡한 성장 전환, 예컨대 급속한 성장 및 급속한 (p)ppGpp 이직률은 이 방법에 의해 정량적으로 평가될 수 있다.

대장균 K-12 균주에서 발린을 첨가하면 isoleucine의 내인성 기아가 유발되어 5 분3후 ppGpp 수치가 증가합니다. ILV를 제외한 모든 아미노산을 함유하는 MOPS에서 성장한 세포는 도1에 도시된 바와 같이 32P로표지되었다. 일단 라벨이 붙으면, 10 mg/mL L-발린(100 μg/mL 최종 농도)의 6 μL이 첨가되어 이솔루신 기아를 일으킵니다. 샘플을 발린을 첨가?...

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Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli pppGpp Followed by Thin Layer Chromatography

마이크로티터 접시에 방사성 표지된 세균 배양물의 성장은 (p)ppGpp를 포함하여 뉴클레오티드 풀 풍부의 다중 기술적 및 생물학적 복제 측정을 허용하는 높은 처리량 샘플링을 용이하게 합니다. 생리 적 스트레스의 소스에 의해 자극 성장 전환의 효과 뿐만 아니라 스트레스에서 복구 모니터링할 수 있습니다.

대장균 (p)ppGpp의 여러 생체 내 측정을위한 마이크로 티터 접시 방사성 라벨링 사용 및 얇은 층 크로마토그래피

The (p)ppGpp nucleotide functions as a global regulator in bacteria in response to a variety of physical and nutritional stress. It has a rapid onset, in ...

이 방법은 다른 성장 조건 과 스트레스 상황에서 글로벌 레귤레이터 ppGpp의 수준을 측정합니다. PpGpp는 엽록소에서뿐만 아니라 그램 양성 및 부정적인 박테리아에서 찾을 수 있습니다. PpGpp는 몇 초 만에 빠른 발병을 가지고 있으며, 스트레스가 생성되면 빠른 두 번째 관계로 이어집니다.동시에, 그것은 짧은 반감기, 최대 30 초있다. 따라서 응력 전환을 포함하여 10초에서 시간까지 다를 수 있는 시간 간격으로 많은 배양을 모니터링할 필요가 있습니다. 우리는 또한 마이크로 티터 접시에 있는 방사선 라벨 세균 성 배양은 다중 기술및 생물학 복제를 허용하는 높은 처리량 샘플링을 용이하게 합니다.방사성 물질로 작업할 때 적절한 안전 조치를 따라야 합니다. 이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 모든 미디어를 준비합니다. 3 밀리머 나트륨 인산염으로 MOPS 미디어에서 하룻밤 문화를 성장.MOPS 매체의 550 마이크로리터를 추가하여 0.2 마이크로몰라 나트륨 인산염 캐리어와 24웰 플레이트의 우물에 각 세균 성 무접종30 마이크로리터를 연속합니다. 이렇게 하면 OD600이 0.1의 초기 접종을 받게 됩니다. 멸균 제어뿐만 아니라 신선한 미디어를 하나에 추가합니다.흔들리는 인큐베이터에 접시를 섭씨 37도에 놓고 900 RPM에서 30 분 동안 흔들어 놓습니다. 동일한 조건에서 배양하는 동안 플레이트 리더기를 사용하여 p32가 부족한 미디어에서 복제 플레이트를 병렬로 복제한 플레이트 판독기를 사용하여 성장을 모니터링할 수 있습니다. 다음으로, 접시의 각 웰에 p32 orthphosphate의 100 마이크로 큐리를 추가합니다.외부 라벨이 세포 간 뉴클레오티드 풀과 크게 평형화할 수 있도록 1~2배의 이중배로 흔들리는 인큐베이터에서 배양을 성장시키게 한다. 적절한 시각화를 위해 이 비디오에서 활성 재질이 사용되지 않았습니다. 실제 실험에서는 적절한 차폐뿐만 아니라 측량 계측기의 오염에 대한 지속적인 모니터링이 필요합니다.먼저, 연구된 스트레스의 종류에 적합한 방법을 사용하여 스트레스를 유도한다. 다음으로, 각 표지된 세포 샘플의 마이크로리터 20개를 별도의 0.2 밀리리터 PCR 튜브에 추가하여 20마이크로리터의 얼음 냉간 6개의 어금산이 함유되어 있습니다. 즉시 드라이 아이스에 샘플을 배치합니다.동결 및 해동의 세 주기에 의해 세포 추출 효율을 향상시킵니다. PEI 셀룰로오스 얇은 층 크로마토그램을 발견하기 직전에, 원심 분리는 펠릿 세포 파편에 최대 속도로 1 분 동안 샘플을 원심 분리합니다. 먼저, 20% 20센티미터 PEI 셀룰로오스 TLC 플레이트를 설정합니다.가위를 사용하여 상위 5센티미터를 제거합니다. 그리고 부드러운 연필을 사용하여 가장자리에서 1 센티미터 떨어진 원점 선을 표시합니다. 각 샘플의 5개의 마이크로리터 액자를 PEI 표면에 적용합니다.반점이 건조되기 전에, 원산지 시점을 만지지 않을 정도로 얕은 1.5 개의 어금반 모노칼타슘 인산염층을 포함하는 탱크로 플레이트를 옮기. 밀폐 씰로 탱크를 덮고 15센티미터 트리밍 시트의 상단으로 액체 상승을 허용합니다. 그 후, 완전히 발달 된 크로마토그램을 제거하고 실온에서 공기 건조.무료 P32를 함유한 크로마토그램의 상부 부분을 방사성 폐기물로 잘라버리고 버립니다. 인광 화면을 사용하여 밤새 오디오 라디오 필름을 노출하십시오. 다음 날, 필름을 개발하고 인광의 녹색 신호를 캡처하고 양을 양화하기 위해 인광기 이미지를 사용합니다.그런 다음 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 방사성 반점을 양량화합니다. ppGpp 축적을 허용하기에 충분한 시간 동안 스트레스 나 기아를 자극 한 후 적절한 방법을 사용하여 스트레스를 반전시면 됩니다. 20~30초마다 샘플을 최대 2분 동안 채취하고 이전에 설명한 대로 샘플을 처리합니다.TLC가 개발되고 시간 과정에서 ppGpp의 수준을 얻으면 잔여 ppGpp 콘텐츠를 반로개반성 플롯에 플롯합니다. 이 연구에서는, ILV를 제외한 모든 아미노산을 함유하는 MOPS에서 자란 세포는 P32로 표시된다. 일단 라벨이 붙으면 L valine이 첨가되어 이솔루신 기아를 생성합니다.5 분 후, 구아노신의 테트라 와 펜타 포스 페이트의 수준에 있는 2 그리고 2 반 오래된 증가가 일어났습니다. 세포 무표지 샘플의 부정적인 제어는 P32 소스에서 직교하지 않는 가능한 화합물을 검출하는 데 사용됩니다. 이솔루신 기아의 반전은 단백질 합성 억제제인 클로람페니콜(chloramphenicol)에 의해 달성될 수 있으며, 이는 충전된 이솔루신 tRNA의 소비를 감소시키고, 차례로 충전되지 않은 tRNA에 대한 높은 비율을 회복시킨다.강력한 레라 매개 ppGpp synthetase의 활성화는 폐지되며, 이는 잔류 합성에 의해 흔들리지 않는 ppGpp 분해의 측정을 허용한다. 이 경우 ppGpp는 약 64 초의 반감기로 부패합니다. 어떤 긴장 또는 기아를 유도 하기 전에 균일 한 라벨을 달성 하기 위해 세포의 몇 세대에 대 한 성장 하는 것이 중요 하다.ppGpp는 박테리아 중 널리 퍼져 있기 때문에,이 방법은 다른 유기체에 적용 될 수있다. TLC 개발 방법의 수정은 ppApp와 같은 모든 규제 뉴클레오티드의 적절한 분리를 허용할 수 있었다. P52는 더 나은 방사제 동위 원소이므로 적절한 차폐를 사용하고 잔류물을 올바르게 폐기하는 것이 중요합니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli (p)ppGpp Followed by Thin Layer Chromatography

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

든 샘플 준비 : 울트라 씬 레이어 방법

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

연구

생물학

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

의 활동을 측정하는 어세이 대장균은 라이신 Decarboxyase을 Inducible

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC)

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography TLC Coupled with Gas-Liquid Chromatography GLC

씬 크로마 토그래피 (TLC)에 의해 Arabidopsis thaliana 폴라 Glycerolipid의 프로파일은 기체 - 액체 크로마 토그래피 (GLC)와 결합

Biological membranes separate cells from the environment. From a single cell to multicellular plants and animals, glycerolipids, such as ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

에서 곰팡이 Endoglucanase 활동의 높은 처리량 검사 대장균</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

간 재관류에 의한 간 세포의 정화를 얹는 생체내 간 Endocytosis에서

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood.  The basic architecture of the liver is illustrated in ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

에 박테리아 기능 네트워크 및 경로를 매핑<em&gt; 대장균</em&gt; 합성 유전자 배열을 사용하여

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electrocompetent의 준비를위한 신속한 프로토콜<em&gt; 대장균</em&gt;와<em&gt; 콜레라 균</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

라이브의 검출<em&gt; 대장균</em&gt; O157 : PMA-qPCR에 의한 H7 셀

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

단백질 공동 식의 다각적 인 장점에<em&gt; 대장균</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...