Name: using microtiter dish radiolabeling for multiple in vivo measurements of escherichia coli (p)ppgpp followed by thin layer chromatography
Uploaded: 2019-06-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli pppGpp Followed by Thin Layer Chromatography at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet intramural Research program, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child helse og Human Development, NIH.

1. klargjøring av medier
<ol><li>
For MOPPER (3-(N-morpholino) propanesulfonic acid) Media25, bruk 1/10 volum på 10x mopper alter, 1/100 volum på 100 x mikronæringsstoffer løsning, 3 mm natrium fosfat for overnatting kulturer eller 0,2 mm natrium fosfat for ensartet merking med 32P, 0,2% glukose og 1 μg/mL Thiamin (vitamin B1). Tilsett aminosyrer ved 40 μg/mL ved behov.
	<ol>
<li>For MOPPER alter, bruk 400 mM MOPPER, 40 mM Tricine, 0,1 mM FeSO4, 95 m...

<ol>
	<li>Cashel, M., Gentry, D., Hernandez, V., Vinella, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stringent+Response.">The stringent Response.</a> Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology. , 1458-1489 (1996).</li><li>Magnusson, L. U., Farewell, A., Nystr&#246;m, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp:+a+global+regulator+in+Escherichia+coli.">ppGpp: a global regulator in Escherichia coli.</a> Trends in Microbiology. 13 (5), 236-242 (2005).</li><li>Cashel, M., Gallant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Compounds+implicated+in+the+Function+of+the+RC+Gene+of+Escherichia+coli.">Two Compounds implicated in the Function of the RC Gene of Escherichia coli.</a> Nature. 221 (5183), 838-841 (1969).</li><li>Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+horizons+for+(p)ppGpp+in+bacterial+and+plant+physiology.">New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology.</a> Trends in Microbiology. 14 (1), 45-54 (2006).</li><li>Atkinson, G. C., Tenson, T., Hauryliuk, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RelA/SpoT+homolog+(RSH)+superfamily:+distribution+and+functional+evolution+of+ppGpp+synthetases+and+hydrolases+across+the+tree+of+life.">The RelA/SpoT homolog (RSH) superfamily: distribution and functional evolution of ppGpp synthetases and hydrolases across the tree of life.</a> PloS One. 6 (8), e23479 (2011).</li><li>Mechold, U., Potrykus, K., Murphy, H., Murakami, K. S., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+by+ppGpp+versus+pppGpp+in+Escherichia+coli.">Differential regulation by ppGpp versus pppGpp in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 41 (12), 6175-6189 (2013).</li><li>Molodtsov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+Effector+ppGpp+Potentiates+the+Inhibition+of+Transcript+Initiation+by+DksA.">Allosteric Effector ppGpp Potentiates the Inhibition of Transcript Initiation by DksA.</a> Molecular Cell. 69 (5), 828-839 (2018).</li><li>Ross, W., Sanchez-Vazquez, P., Chen, A. Y. Y., Lee, J. -. H. H., Burgos, H. L. L., Gourse, R. L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp+Binding+to+a+Site+at+the+RNAP-DksA+Interface+Accounts+for+Its+Dramatic+Effects+on+Transcription+Initiation+during+the+Stringent+Response.">ppGpp Binding to a Site at the RNAP-DksA Interface Accounts for Its Dramatic Effects on Transcription Initiation during the Stringent Response.</a> Molecular Cell. 62 (6), 811-823 (2016).</li><li>Kriel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Regulation+of+GTP+Homeostasis+by+(p)ppGpp:+A+Critical+Component+of+Viability+and+Stress+Resistance.">Direct Regulation of GTP Homeostasis by (p)ppGpp: A Critical Component of Viability and Stress Resistance.</a> Molecular Cell. 48 (2), 231-241 (2012).</li><li>Kriel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTP+dysregulation+in+Bacillus+subtilis+cells+lacking+(p)ppGpp+results+in+phenotypic+amino+acid+auxotrophy+and+failure+to+adapt+to+nutrient+downshift+and+regulate+biosynthesis+genes.">GTP dysregulation in Bacillus subtilis cells lacking (p)ppGpp results in phenotypic amino acid auxotrophy and failure to adapt to nutrient downshift and regulate biosynthesis genes.</a> Journal of Bacteriology. 196 (1), 189-201 (2014).</li><li>Potrykus, K., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p)ppGpp:+still+magical.">p)ppGpp: still magical.</a> Annual Review of Microbiology. 62, 35-51 (2008).</li><li>Hauryliuk, V., Atkinson, G. C., Murakami, K. S., Tenson, T., Gerdes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+functional+insights+into+the+role+of+(p)ppGpp+in+bacterial+physiology.">Recent functional insights into the role of (p)ppGpp in bacterial physiology.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (5), 298-309 (2015).</li><li>Arenz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stringent+factor+RelA+adopts+an+open+conformation+on+the+ribosome+to+stimulate+ppGpp+synthesis.">The stringent factor RelA adopts an open conformation on the ribosome to stimulate ppGpp synthesis.</a> Nucleic Acids Research. 44 (13), 6471-6481 (2016).</li><li>Loveland, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome&#8226;RelA+structures+reveal+the+mechanism+of+stringent+response+activation.">Ribosome&#8226;RelA structures reveal the mechanism of stringent response activation.</a> eLife. 5, e17029 (2016).</li><li>Brown, A., Fern&#225;ndez, I. S., Gordiyenko, Y., Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome-dependent+activation+of+stringent+control.">Ribosome-dependent activation of stringent control.</a> Nature. 534 (7606), 277-280 (2016).</li><li>Battesti, A., Bouveret, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acyl+carrier+protein/SpoT+interaction,+the+switch+linking+SpoT-dependent+stress+response+to+fatty+acid+metabolism.">Acyl carrier protein/SpoT interaction, the switch linking SpoT-dependent stress response to fatty acid metabolism.</a> Molecular Microbiology. 62 (4), 1048-1063 (2006).</li><li>Lee, J. -. W., Park, Y. -. H., Seok, Y. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rsd+balances+(p)ppGpp+level+by+stimulating+the+hydrolase+activity+of+SpoT+during+carbon+source+downshift+in+Escherichia+coli.">Rsd balances (p)ppGpp level by stimulating the hydrolase activity of SpoT during carbon source downshift in Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (29), E6845-E6854 (2018).</li><li>Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+(p)ppGpp+Accumulation+Patterns+in+Escherichia+coli+mutants.">Detection of (p)ppGpp Accumulation Patterns in Escherichia coli mutants.</a> Molecular Microbiology Techniques. 3, 341-356 (1994).</li><li>Fern&#225;ndez-Coll, L., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+SpoT+Hydrolase,+SpoT+Synthetase,+and+RelA+Synthetase+to+Carbon+Source+Diauxic+Growth+Transitions+in+Escherichia+coli.">Contributions of SpoT Hydrolase, SpoT Synthetase, and RelA Synthetase to Carbon Source Diauxic Growth Transitions in Escherichia coli.</a> Frontiers in Microbiology. , (2018).</li><li>Varik, V., Oliveira, S. R. A., Hauryliuk, V., Tenson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPLC-based+quantification+of+bacterial+housekeeping+nucleotides+and+alarmone+messengers+ppGpp+and+pppGpp.">HPLC-based quantification of bacterial housekeeping nucleotides and alarmone messengers ppGpp and pppGpp.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11022 (2017).</li><li>Rhee, H. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Fluorescent+Chemosensor+for+the+Bacterial+Alarmone+(p)ppGpp.">Selective Fluorescent Chemosensor for the Bacterial Alarmone (p)ppGpp.</a> J. Am. Chem. Soc. 130 (3), 784-785 (2008).</li><li>Wang, J., Chen, W., Liu, X., Wesdemiotis, C., Pang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mononuclear+Zinc+Complex+for+Selective+Detection+of+Diphosphate+via+Fluorescence+ESIPT+Turn-On.">A Mononuclear Zinc Complex for Selective Detection of Diphosphate via Fluorescence ESIPT Turn-On.</a> Journal of Materials Chemistry B. 2 (21), 3349-3354 (2014).</li><li>Pokhilko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+nutrient+limitation+in+growing+E.+coli:+a+mathematical+model+of+a+ppGpp-based+biosensor.">Monitoring of nutrient limitation in growing E. coli: a mathematical model of a ppGpp-based biosensor.</a> BMC Systems Biology. 11 (1), 106 (2017).</li><li>Funabashi, H., Mie, M., Yanagida, Y., Kobatake, E., Aizawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+monitoring+of+cellular+physiological+status+depending+on+the+accumulation+of+ppGpp.">Fluorescent monitoring of cellular physiological status depending on the accumulation of ppGpp.</a> Biotechnology Letters. 24 (4), 269-273 (2002).</li><li>Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+medium+for+enterobacteria.">Culture medium for enterobacteria.</a> Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Peselis, A., Serganov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ykkC+riboswitches+employ+an+add-on+helix+to+adjust+specificity+for+polyanionic+ligands.">ykkC riboswitches employ an add-on helix to adjust specificity for polyanionic ligands.</a> Nature Chemical Biology. 14 (9), 887-894 (2018).</li><li>Oki, T., Yoshimoto, A., Sato, S., Takamatsu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purine+nucleotide+pyrophosphotransferase+from+Streptomyces+morookaensis,+capable+of+synthesizing+pppApp+and+pppGpp.">Purine nucleotide pyrophosphotransferase from Streptomyces morookaensis, capable of synthesizing pppApp and pppGpp.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology. 410 (2), 262-272 (1975).</li><li>Travers, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppApp+alters+transcriptional+selectivity+of+Escherichia+coli+RNA+polymerase.">ppApp alters transcriptional selectivity of Escherichia coli RNA polymerase.</a> FEBS Letters. 94 (2), 345-348 (1978).</li><li>Bruhn-Olszewska, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+comparisons+of+(p)ppApp+vs+(p)ppGpp+for+Escherichia+coli+RNA+polymerase+binding+sites+and+for+rrnB+P1+promoter+regulatory+responses+in+vitro.">Structure-function comparisons of (p)ppApp vs (p)ppGpp for Escherichia coli RNA polymerase binding sites and for rrnB P1 promoter regulatory responses in vitro.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms. 1861 (8), 731-742 (2018).</li></ol>

Å oppnå nær uniform merking av cellene er et kritisk trinn for denne protokollen. Derfor er bruken av definerte medier, for eksempel MOPPER eller Tris Media, avgjørende for å muliggjøre variasjon av fosfat konsentrasjoner av bærebølge og spesifikk aktivitet. Fosfat-bufrede medier, for eksempel M9 eller Media A, kan ikke brukes. De fleste udefinert medier inneholder variable mengder fosfat, slik som LB, tryptone og casamino syrer. Den fosfat isotop 33p er en svakere emitter som kan erstatte 32</sup...

The (p) ppGpp andre Messenger er en global regulator som modulerer uttrykk for et stort antall gener, inkludert gener for syntetisere ribosomer og aminosyrer1,2. Selv om utgangspunktet oppdaget i Escherichia coli3, (p) ppGpp kan finnes i både gram positive og gram negative bakterier så vel som i anlegget Chloroplasts4,5. For E. coli og andre gram-negative bakterier, (p) ppGpp samhandler direkte med RNA polymerase på to forskjellige steder6,7,8. I gram positiver, (p) ppGpp hemmer GTP overflod, som er følt av CodY, en GTP-bindende protein med Gen-spesifikke DNA-anerkjennelse motiver som fører til regulering9,10. (p) ppGpp akkumuleres som svar på sult for ulike næringsstoffer og stress forhold, noe som resulterer i langsom vekst og justeringer av genet uttrykk for å tillate tilpasning til stress11,12.
Nettobeløpet for ppGpp akkumulert reflekterer en balanse mellom syntetase og Hydrolase aktiviteter. I E. coli forholdet er en sterk Syntetase og SpoT er bifunctional, med en sterk Hydrolase og en svak syntetase, som hver kan være regulert forskjellig i en stress avhengig måte. Den sterke forholdet syntetase aktiveres når tilgjengeligheten av Codon-spesifiserte ladet tRNA bundet til ribosomal et område når den ikke klarer å holde tritt med kravene til proteinsyntese13,14,15. Det svake punktet (p) ppGpp-syntetase aktiveres mens den sterke (p) ppGpp-Hydrolase blir hemmet som følge av andre stress forhold og gjennom andre mekanismer. Under noen forhold kan proteiner som ACP eller RSD bindes til SpoT, som også endrer balansen mellom hydrolyse og syntese16,17. I gram positiver reflekterer syntese og hydrolyse en mer kompleks balanse mellom et enkelt forholdet SpoT homologe (RSH) protein med sterk syntese og hydrolyse aktiviteter så vel som mindre hydrolases og/eller synthetases12.
The (p) ppGpp nukleotider ble først oppdaget som uvanlige 32p merket flekker som dukket opp på autoradiograms av tynne-lags KROMATOGRAMMENE (TLC) under en streng respons indusert av aminosyre sult3. Mer detaljerte merking protokoller har gjennomgått 18. Protokollen som beskrives her (figur 1) er en modifikasjon av disse protokollene som gjør det mulig å overvåke vekst av flere prøver på mikrotiterbrønnene plater. Dette forenkler flere biologiske og tekniske anslag over (p) ppGpp overflod endringer og ble opprinnelig utviklet for studier av diauxic Skift19. Merking av (p) ppGpp med 32p og deteksjon av TLC tillater også målinger av (p) ppGpp ned brytnings rater. Alternative metoder er utviklet for å bestemme (p) ppGpp nivåer som masse massespektrometri, HPLC20, fluorescerende chemosensors21,22, og GFP gen fusjoner til arrangører berørt av ppGpp23, 24. fluorescerende chemosensors for tiden har en begrenset bruk på grunn av små Spectral Skift etter binding ppGpp samt problemer skille mellom PpGpp og pppGpp21. Denne metoden er effektiv for å oppdage (p) ppGpp in vitro, men ikke i cellulære ekstrakter. Metoder som involverer HPLC har blitt forbedret20 , men krever dyrt utstyr og er ikke godt tilpasset til høy gjennom-PUT. Til slutt kan GFP fusjoner gi et anslag på ppGpp avhengig aktivering eller hemming, men ikke måle ppGpp selv. Mens hver av disse alternative metoder er verdifulle, de krever dyrt utstyr eller betydelig hands-on tid, eller de er ellers ikke mottagelig for flere kinetisk prøvetaking og påfølgende prosessering. Med metoden beskrevet her, 96 prøver kan brukes på seks TLC plater i ca 20 min (18 prøver per plate), løst av TLC utvikling på mindre enn et par timer, med kvantitative data innhentet etter flere timer eller over natten, avhengig av merking Intensitet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(NH4)6(MO7)24</td>
			<td>Fisher Scientifics</td>
			<td>A-674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoradiography film</td>
			<td>Denville scientific inc.</td>
			<td>E3218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>1-1309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>RPI</td>
			<td>C61000-25.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2</td>
			<td>Fisher Scientifics</td>
			<td>C-371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>1843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4</td>
			<td>Fisher Scientifics</td>
			<td>I-146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Fisher Biotech</td>
			<td>BP1215-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Macron</td>
			<td>4912-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO4</td>
			<td>Macron</td>
			<td>2549-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3PO4</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>0260-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2SO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9458-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Biotech</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Valine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V-6504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher Scientifics</td>
			<td>FL-06-0303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader Synergy HT</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-9522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1254-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>7892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>3624-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>7917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0171-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-32 radionuclide, orthophosphoric acid in 1 mL water (5 mCi)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEX053005MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage phosphor screen</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>So230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-4625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC PEI Cellulose F</td>
			<td>Merk-Millipore</td>
			<td>1.05579.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine</td>
			<td>RPI</td>
			<td>T2400-500.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon 9400 imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4</td>
			<td>Fisher Scientifics</td>
			<td>Z-68</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using microtiter dish radiolabeling for multiple in vivo measurements of escherichia coli (p)ppgpp followed by thin layer chromatography

The (p) ppGpp nukleotid fungerer som en global regulator i bakterier som svar på en rekke fysiske og ernæringsmessige stress. Den har en rask debut, i sekunder, noe som fører til opphopning av nivåer som nærmer eller overskrider de av GTP bassenger. Stress reversering anledninger en rask forsvinningen av (p) ppGpp, ofte med en halveringstid på mindre enn et minutt. Tilstedeværelsen av (p) ppGpp resulterer i endringer av cellulære genuttrykk og metabolisme som motvirke de skadelige virkningene av stress. Gram-negative og gram-positive bakterier har forskjellige reaksjons mekanismer, men begge avhenger av (p) ppGpp konsentrasjon. I alle tilfelle, det er en nød å samtidig dataskjerm mange radiolabeled bakteriell kulturen for tid intervaller det kanskje variere fra 10 sekunder å timene i løpet av betenkelig trykk overgang perioder. Denne protokollen løser denne tekniske utfordringen. Metoden utnytter temperatur-og shaker-kontrollerte mikrotiterbrønnene parabolen inkubatorer som tillater parallell overvåking av vekst (absorbansen) og rask prøvetaking av jevnt fosfat-radiolabeled kulturer å løse og quantitate nukleotid bassenger ved tynt lag kromatografi på PEI-cellulose. Små mengder utvalg er nødvendig for flere tekniske og biologiske replikerer av analyser. Komplekse vekst overganger, slik som diauxic vekst og rask (p) ppGpp omløpshastighet kan kvantitativt vurderes av denne metoden.

I E. coli K-12 stammer, tillegg av Valin provoserer en endogene sult isoleucin, noe som resulterer en økning på ppGpp nivåer etter 5 min3. Celler dyrket i MOPPER inneholder alle aminosyrer unntatt ILV ble merket med 32P som indikert i figur 1. Når merket, ble 6 μL av 10 mg/mL L-Valin (100 μg/mL endelig konsentrasjon) tilsatt for å produsere isoleucin sult. Prøvene ble tatt 0 og 5 min etter tilsetning av Valin. Etter 5 min (fi...

Watch this Scientific Journal Video about Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli pppGpp Followed by Thin Layer Chromatography at JoVE.com

Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli pppGpp Followed by Thin Layer Chromatography

Veksten av radiolabeled bakteriell kulturen inne mikrotiterbrønnene fat Letter høy produksjon prøving det innrømmer mangfoldig teknisk og Biological duplisere analyser av nukleotid basseng overflod, inkluderer det av (pencen) ppGpp. Effektene av vekst overganger provosert av kilder til fysiologisk stress, samt utvinning fra stress kan overvåkes.

Bruke mikrotiterbrønnene Dish Radiolabeling for flere in vivo målinger av Escherichia coli (p) ppGpp etterfulgt av tynne lag kromatografi

The (p)ppGpp nucleotide functions as a global regulator in bacteria in response to a variety of physical and nutritional stress. It has a rapid onset, in ...

Denne metoden måler nivåene av den globale regulator ppGpp innenfor ulike vekstforhold og stresssituasjoner. PpGpp finnes i gram positive og negative bakterier, så vel som i kloroplast. PpGpp har en rask start i løpet av sekunder, noe som fører til en rask andre forhold når stress er produsert.Samtidig har den en kort halveringstid, opptil 30 sekunder. Derfor er det behov for å overvåke mange kulturer med tidsintervaller som kan variere fra 10 sekunder til timer, inkludert stressede overganger. Vi også radiolabel bakterielle kulturer i mikrotiter retter forenkler høy gjennomstrømning prøvetakinger som tillater flere tekniske og biologiske repliker.Sørg for å følge de riktige sikkerhetstiltakene når du arbeider med radioaktive materialer. For å starte denne prosedyren, klargjør alle medier som beskrevet i tekstprotokollen. Vokse over natten kulturer i MOPS media med tre millimolar natriumfosfat.Tilsett 550 mikroliter mops-medier, og kontiner 0,2 mikromosfatbærer og 30 mikroliter av hver bakteriell inokuleum til brønnene på en 24-brønnplate. Dette vil resultere i en innledende inoculum med en OD600 på 0,1. Legg til friske medier i en samt en sterilitetskontroll.Legg platen i en ristende inkubator ved 37 grader celsius, rist ved 900 RPM i 30 minutter. Vekst kan overvåkes ved hjelp av en plateleser med en replikereplate parallelt i media som mangler p32 ved hjelp av en plateleser mens du inkuberer under de samme forholdene. Deretter legger du til 100 mikrocuries av p32 ortfosfat til hver brønn av platen.Vokse kulturene i en risting inkubator for en til to doblinger for å tillate ekstern etikett å i stor grad likevekt med intercellulære nukleotid bassenger. For riktig visualisering ble ingen av det aktive materialet brukt i denne videoen. I et reelt eksperiment er riktig skjerming nødvendig, samt konstant overvåking for forurensning med en undersøkelsesmåler.Først indusere stress ved hjelp av en metode som passer for den typen stress studert. Deretter legger du til 20 mikroliter av hver merkede celleprøve til et separat 0,2 milliliter PCR-rør, som inneholder 20 mikroliter iskald seks molarformisyre. Plasser prøvene umiddelbart på tørris.Forbedre cellulær ekstraksjon effektivitet med tre sykluser med frysing og tining. Like før du ser PEI cellulose tynne lagkromatogrammer, sentrifuger prøvene i ett minutt med maksimal hastighet til pelletcelleavfall. Først sette ut en 20 med 20 centimeter PEI cellulose TLC plate.Bruk saks for å fjerne de øverste fem centimeterne. Og bruk en myk blyant for å markere en opprinnelseslinje en centimeter fra kanten. Påfør en fem mikroliterdråpe av hver prøve på PEI-overflaten.Før flekken kan tørke, overfør platen til en tank som inneholder et lag med 1,5 molar monopotassiumfosfat som er grunne nok til ikke å berøre opprinnelsesprøvepunktet. Dekk tanken med en lufttett forsegling, og la flytende oppstigning til toppen av det 15 centimeter trimmede arket. Etter dette fjerner du det fullt utviklede kromatrammet og lufttørker det ved romtemperatur.Klipp og kast den øverste delen av kromatrammet som inneholder den frie P32 i radioaktivt avfall. Bruk en fosforskjerm til å eksponere de audioradigrafiske filmene over natten. Neste dag, utvikle filmen og bruke en fosforeer for å fange og kvantate fosforets grønne signal.Deretter bruker du ImageJ-programvaren til å kvantisere de radioaktive flekkene. Etter å ha provosert stress eller sult for tid tilstrekkelig til å tillate ppGpp akkumulering, bruk en passende metode for å reversere stresset. Ta prøver hvert 20 til 30 sekund i opptil to minutter og behandle prøvene som tidligere beskrevet.Når TLC er utviklet, og nivåene av ppGpp er oppnådd i løpet av tidskurset, plotte gjenværende ppGpp innhold på en semilogaritmisk plott versus tid. I denne studien er celler dyrket i MOPS som inneholder alle aminosyrer unntatt ILV merket med P32. Når merket, L valine er lagt til å produsere isoleucine sult.Etter fem minutter skjedde en to og to og en halv gammel økning i nivåene av tetra og pentafosfat av guanosin. En negativ kontroll av en cellefri merket prøve brukes til å oppdage mulige forbindelser som ikke er orofosfat i P32-kilden. Reversering av isoleucin sult kan oppnås ved kloramfenikol, en hemmer av proteinsyntese, noe som reduserer forbruket av ladet isoleucin tRNA, og gjenoppretter i sin tur høye forholdstall av ladet til uladet tRNA.Aktivering av den sterke rela-medierte ppGpp synthetase er avskaffet, noe som gjør det mulig å måle ppGpp nedbrytning ugjennomtrengelig av gjenværende syntese. I dette tilfellet forfaller ppGpp med en halveringstid på ca. 64 sekunder. Det er viktig å la cellene vokse i et par generasjoner for å oppnå en jevn merking før du induserer stress eller sult.Fordi ppGpp er utbredt blant bakterier, kan denne metoden brukes på andre organismer. Endring av TLC utviklingsmetoden kan tillate riktig separasjon av alle regulatoriske nukleotider, for eksempel ppApp. P52 er en bedre emitter isotop, så det er viktig å bruke riktig skjerming og å kaste eventuelle rester på riktig måte.

Research

JoVE Journal

Biology

Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli (p)ppGpp Followed by Thin Layer Chromatography

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC)

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography TLC Coupled with Gas-Liquid Chromatography GLC

Biological membranes separate cells from the environment. From a single cell to multicellular plants and animals, glycerolipids, such as ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

In vivo Lever endocytose Etterfulgt av Rensing av leverceller av leveren Perfusjons

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood.  The basic architecture of the liver is illustrated in ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Kartlegging Bakteriell Funksjonelle nettverk og veier i<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Ved hjelp av syntetisk Genetiske Arrays

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Rapid Protokoll for Utarbeidelse av Electrocompetent<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Og<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Påvisning av Levende<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 celler ved PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Sporing av Hematopoietiske Stem og stamceller i Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Det mangefasetterte Fordeler med Protein Co-uttrykk i<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...