Name: using microtiter dish radiolabeling for multiple in vivo measurements of escherichia coli (p)ppgpp followed by thin layer chromatography
Uploaded: 2019-06-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli pppGpp Followed by Thin Layer Chromatography at JoVE.com

Denna forskning stöddes av intramural forsknings program, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health och Human Development, NIH.

1. förberedelse av media
<ol><li>
För moppar (3-(N-morpholino) propanesulfonic acid) Media25, Använd 1/10 volym av 10X mops salter, 1/100 volym 100x mikronäringsämnen lösning, 3 mm natriumfosfat för natten kulturer eller 0,2 mm natriumfosfat för enhetlig märkning med 32P, 0,2% glukos och 1 μg/mL tiamin (vitamin B1). Tillsätt aminosyror på 40 μg/mL vid behov.
	<ol>
<li>För moppar salter, Använd 400 mM moppar, 40 mM Tricine, 0,1 mM FeSO4, 95 mm...

<ol>
	<li>Cashel, M., Gentry, D., Hernandez, V., Vinella, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stringent+Response.">The stringent Response.</a> Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology. , 1458-1489 (1996).</li><li>Magnusson, L. U., Farewell, A., Nystr&#246;m, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp:+a+global+regulator+in+Escherichia+coli.">ppGpp: a global regulator in Escherichia coli.</a> Trends in Microbiology. 13 (5), 236-242 (2005).</li><li>Cashel, M., Gallant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Compounds+implicated+in+the+Function+of+the+RC+Gene+of+Escherichia+coli.">Two Compounds implicated in the Function of the RC Gene of Escherichia coli.</a> Nature. 221 (5183), 838-841 (1969).</li><li>Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+horizons+for+(p)ppGpp+in+bacterial+and+plant+physiology.">New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology.</a> Trends in Microbiology. 14 (1), 45-54 (2006).</li><li>Atkinson, G. C., Tenson, T., Hauryliuk, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RelA/SpoT+homolog+(RSH)+superfamily:+distribution+and+functional+evolution+of+ppGpp+synthetases+and+hydrolases+across+the+tree+of+life.">The RelA/SpoT homolog (RSH) superfamily: distribution and functional evolution of ppGpp synthetases and hydrolases across the tree of life.</a> PloS One. 6 (8), e23479 (2011).</li><li>Mechold, U., Potrykus, K., Murphy, H., Murakami, K. S., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+by+ppGpp+versus+pppGpp+in+Escherichia+coli.">Differential regulation by ppGpp versus pppGpp in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 41 (12), 6175-6189 (2013).</li><li>Molodtsov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+Effector+ppGpp+Potentiates+the+Inhibition+of+Transcript+Initiation+by+DksA.">Allosteric Effector ppGpp Potentiates the Inhibition of Transcript Initiation by DksA.</a> Molecular Cell. 69 (5), 828-839 (2018).</li><li>Ross, W., Sanchez-Vazquez, P., Chen, A. Y. Y., Lee, J. -. H. H., Burgos, H. L. L., Gourse, R. L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp+Binding+to+a+Site+at+the+RNAP-DksA+Interface+Accounts+for+Its+Dramatic+Effects+on+Transcription+Initiation+during+the+Stringent+Response.">ppGpp Binding to a Site at the RNAP-DksA Interface Accounts for Its Dramatic Effects on Transcription Initiation during the Stringent Response.</a> Molecular Cell. 62 (6), 811-823 (2016).</li><li>Kriel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Regulation+of+GTP+Homeostasis+by+(p)ppGpp:+A+Critical+Component+of+Viability+and+Stress+Resistance.">Direct Regulation of GTP Homeostasis by (p)ppGpp: A Critical Component of Viability and Stress Resistance.</a> Molecular Cell. 48 (2), 231-241 (2012).</li><li>Kriel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTP+dysregulation+in+Bacillus+subtilis+cells+lacking+(p)ppGpp+results+in+phenotypic+amino+acid+auxotrophy+and+failure+to+adapt+to+nutrient+downshift+and+regulate+biosynthesis+genes.">GTP dysregulation in Bacillus subtilis cells lacking (p)ppGpp results in phenotypic amino acid auxotrophy and failure to adapt to nutrient downshift and regulate biosynthesis genes.</a> Journal of Bacteriology. 196 (1), 189-201 (2014).</li><li>Potrykus, K., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p)ppGpp:+still+magical.">p)ppGpp: still magical.</a> Annual Review of Microbiology. 62, 35-51 (2008).</li><li>Hauryliuk, V., Atkinson, G. C., Murakami, K. S., Tenson, T., Gerdes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+functional+insights+into+the+role+of+(p)ppGpp+in+bacterial+physiology.">Recent functional insights into the role of (p)ppGpp in bacterial physiology.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (5), 298-309 (2015).</li><li>Arenz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stringent+factor+RelA+adopts+an+open+conformation+on+the+ribosome+to+stimulate+ppGpp+synthesis.">The stringent factor RelA adopts an open conformation on the ribosome to stimulate ppGpp synthesis.</a> Nucleic Acids Research. 44 (13), 6471-6481 (2016).</li><li>Loveland, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome&#8226;RelA+structures+reveal+the+mechanism+of+stringent+response+activation.">Ribosome&#8226;RelA structures reveal the mechanism of stringent response activation.</a> eLife. 5, e17029 (2016).</li><li>Brown, A., Fern&#225;ndez, I. S., Gordiyenko, Y., Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome-dependent+activation+of+stringent+control.">Ribosome-dependent activation of stringent control.</a> Nature. 534 (7606), 277-280 (2016).</li><li>Battesti, A., Bouveret, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acyl+carrier+protein/SpoT+interaction,+the+switch+linking+SpoT-dependent+stress+response+to+fatty+acid+metabolism.">Acyl carrier protein/SpoT interaction, the switch linking SpoT-dependent stress response to fatty acid metabolism.</a> Molecular Microbiology. 62 (4), 1048-1063 (2006).</li><li>Lee, J. -. W., Park, Y. -. H., Seok, Y. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rsd+balances+(p)ppGpp+level+by+stimulating+the+hydrolase+activity+of+SpoT+during+carbon+source+downshift+in+Escherichia+coli.">Rsd balances (p)ppGpp level by stimulating the hydrolase activity of SpoT during carbon source downshift in Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (29), E6845-E6854 (2018).</li><li>Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+(p)ppGpp+Accumulation+Patterns+in+Escherichia+coli+mutants.">Detection of (p)ppGpp Accumulation Patterns in Escherichia coli mutants.</a> Molecular Microbiology Techniques. 3, 341-356 (1994).</li><li>Fern&#225;ndez-Coll, L., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+SpoT+Hydrolase,+SpoT+Synthetase,+and+RelA+Synthetase+to+Carbon+Source+Diauxic+Growth+Transitions+in+Escherichia+coli.">Contributions of SpoT Hydrolase, SpoT Synthetase, and RelA Synthetase to Carbon Source Diauxic Growth Transitions in Escherichia coli.</a> Frontiers in Microbiology. , (2018).</li><li>Varik, V., Oliveira, S. R. A., Hauryliuk, V., Tenson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPLC-based+quantification+of+bacterial+housekeeping+nucleotides+and+alarmone+messengers+ppGpp+and+pppGpp.">HPLC-based quantification of bacterial housekeeping nucleotides and alarmone messengers ppGpp and pppGpp.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11022 (2017).</li><li>Rhee, H. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Fluorescent+Chemosensor+for+the+Bacterial+Alarmone+(p)ppGpp.">Selective Fluorescent Chemosensor for the Bacterial Alarmone (p)ppGpp.</a> J. Am. Chem. Soc. 130 (3), 784-785 (2008).</li><li>Wang, J., Chen, W., Liu, X., Wesdemiotis, C., Pang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mononuclear+Zinc+Complex+for+Selective+Detection+of+Diphosphate+via+Fluorescence+ESIPT+Turn-On.">A Mononuclear Zinc Complex for Selective Detection of Diphosphate via Fluorescence ESIPT Turn-On.</a> Journal of Materials Chemistry B. 2 (21), 3349-3354 (2014).</li><li>Pokhilko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+nutrient+limitation+in+growing+E.+coli:+a+mathematical+model+of+a+ppGpp-based+biosensor.">Monitoring of nutrient limitation in growing E. coli: a mathematical model of a ppGpp-based biosensor.</a> BMC Systems Biology. 11 (1), 106 (2017).</li><li>Funabashi, H., Mie, M., Yanagida, Y., Kobatake, E., Aizawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+monitoring+of+cellular+physiological+status+depending+on+the+accumulation+of+ppGpp.">Fluorescent monitoring of cellular physiological status depending on the accumulation of ppGpp.</a> Biotechnology Letters. 24 (4), 269-273 (2002).</li><li>Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+medium+for+enterobacteria.">Culture medium for enterobacteria.</a> Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Peselis, A., Serganov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ykkC+riboswitches+employ+an+add-on+helix+to+adjust+specificity+for+polyanionic+ligands.">ykkC riboswitches employ an add-on helix to adjust specificity for polyanionic ligands.</a> Nature Chemical Biology. 14 (9), 887-894 (2018).</li><li>Oki, T., Yoshimoto, A., Sato, S., Takamatsu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purine+nucleotide+pyrophosphotransferase+from+Streptomyces+morookaensis,+capable+of+synthesizing+pppApp+and+pppGpp.">Purine nucleotide pyrophosphotransferase from Streptomyces morookaensis, capable of synthesizing pppApp and pppGpp.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology. 410 (2), 262-272 (1975).</li><li>Travers, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppApp+alters+transcriptional+selectivity+of+Escherichia+coli+RNA+polymerase.">ppApp alters transcriptional selectivity of Escherichia coli RNA polymerase.</a> FEBS Letters. 94 (2), 345-348 (1978).</li><li>Bruhn-Olszewska, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+comparisons+of+(p)ppApp+vs+(p)ppGpp+for+Escherichia+coli+RNA+polymerase+binding+sites+and+for+rrnB+P1+promoter+regulatory+responses+in+vitro.">Structure-function comparisons of (p)ppApp vs (p)ppGpp for Escherichia coli RNA polymerase binding sites and for rrnB P1 promoter regulatory responses in vitro.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms. 1861 (8), 731-742 (2018).</li></ol>

Att uppnå nära enhetlig märkning av cellerna är ett kritiskt steg för detta protokoll. Därför är användningen av definierade medier, såsom moppar eller Tris media, avgörande för att möjliggöra variation av bärare av fosfat koncentrationer och specifik aktivitet. Fosfatbuffrat media, till exempel M9 eller media A, kan inte användas. De flesta odefinierade medierna innehåller varierande mängder fosfat, såsom LB, trypton och casamino syror. Fosfat isotopen 33p är en svagare EMITTER som kan ers...

Den (p) ppgpp andra budbärare är en global regulator som modulerar uttrycket av ett stort antal gener, inklusive gener för syntetisera ribosomer och aminosyror1,2. Även initialt upptäcktes i Escherichia coli3, (p) ppgpp kan hittas i både grampositiva och gramnegativa bakterier samt i växternas kloroplaster4,5. För E. coli och andra gramnegativa bakterier, (p) ppgpp interagerar direkt med RNA-polymeras på två olika platser6,7,8. I grampositiva, (p) ppgpp hämmar GTP överflöd, som är kände av CodY, ett GTP-bindande protein med genspecifika DNA-igenkännings motiv som leder till regel9,10. (p) ppgpp ackumuleras som svar på svält för olika näringsämnen och stressförhållanden, vilket resulterar i långsam tillväxt och justeringar av genuttryck för att möjliggöra anpassning till stress11,12.
Nettobeloppet för ackumulerade ppgpp återspeglar en balans mellan--syntetas och hydrolas verksamhet. I E. coli RelA är en stark--syntetas och SpoT är bifunktionell, med en stark hydrolas och en svag syntetas, som var och en kan regleras på olika sätt i en stress beroende sättet. Den starka RelA-Synthetasen aktiveras när tillgängligheten av Codon-specificerade laddade tRNA som är destinerade till ribosomalen en plats, när den underlåter för att hänga upp med kraven av proteinsyntes13,14,15. Den svaga punkten (p) ppGpp-syntetas aktiveras medan den starka (p) ppGpp-hydrolasen hämmas som svar på andra stressförhållanden och genom andra mekanismer. Under vissa förhållanden, proteiner som ACP eller RSD kan binda till SpoT, som också ändra balansen mellan hydrolys och syntes16,17. I grampositiva speglar syntes och hydrolys en mer komplex balans mellan ett enda RelA-protein med stark syntes och hydrolysverksamhet samt mindre Hydrolaser och/eller synthetaser12.
Den (p) ppGpp nukleotider upptäcktes först som ovanliga 32p märkta fläckar som dök upp på autoradiograms av tunnskiktskromatogram (TLC) under ett strikt svar induceras av aminosyra svält3. Mer detaljerade märkningsprotokoll har granskats 18. Det protokoll som beskrivs här (figur 1) är en modifiering av dessa protokoll som gör det möjligt att övervaka tillväxten av flera prover på mikrotiterplattor. Detta underlättar flera biologiska och tekniska uppskattningar av (p) ppGpp överflöd förändringar och utvecklades ursprungligen för studier av diauxic Skift19. Märkning av (p) ppGpp med 32p och detektion genom TLC medger också mätning av (p) ppgpp nedbrytningshastigheter. Alternativa metoder har utvecklats för att fastställa (p) ppGpp-nivåer såsom masspektrometri, HPLC20, fluorescerande kemosensorer21,22och GFP-genfusioner till projektansvariga som drabbats av ppgpp23, 24. fluorescerande chemosensors har för närvarande en begränsad användning på grund av små spektralskift efter bindande ppgpp samt problem att skilja mellan ppgpp och pppgpp21. Denna metod är effektiv för att upptäcka (p) ppGpp in vitro, men inte i cellulära extrakt. Metoder med HPLC har förbättrats20 men kräver dyr utrustning och är inte väl anpassade till hög genom-put. Slutligen, GFP fusioner kan ge en uppskattning av ppGpp beroende aktivering eller hämning, men inte mäta ppGpp själv. Medan var och en av dessa alternativa metoder är värdefulla, de kräver dyr utrustning eller betydande hands-on tid, eller de är annars inte mottagliga för flera kinetiska provtagning och efterföljande bearbetning. Med den metod som beskrivs här, 96 prover kan appliceras på sex TLC plattor i ca 20 min (18 prover per tallrik), lösas av TLC utveckling på mindre än ett par timmar, med kvantitativa data som erhållits efter flera timmar eller över natten, beroende på märkning Intensitet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(NH4)6(MO7)24</td>
			<td>Fisher Scientifics</td>
			<td>A-674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoradiography film</td>
			<td>Denville scientific inc.</td>
			<td>E3218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>1-1309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>RPI</td>
			<td>C61000-25.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2</td>
			<td>Fisher Scientifics</td>
			<td>C-371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>1843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4</td>
			<td>Fisher Scientifics</td>
			<td>I-146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Fisher Biotech</td>
			<td>BP1215-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Macron</td>
			<td>4912-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO4</td>
			<td>Macron</td>
			<td>2549-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3PO4</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>0260-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2SO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9458-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Biotech</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Valine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V-6504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher Scientifics</td>
			<td>FL-06-0303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader Synergy HT</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-9522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1254-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>7892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>3624-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>7917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0171-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-32 radionuclide, orthophosphoric acid in 1 mL water (5 mCi)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEX053005MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage phosphor screen</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>So230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-4625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC PEI Cellulose F</td>
			<td>Merk-Millipore</td>
			<td>1.05579.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine</td>
			<td>RPI</td>
			<td>T2400-500.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon 9400 imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4</td>
			<td>Fisher Scientifics</td>
			<td>Z-68</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using microtiter dish radiolabeling for multiple in vivo measurements of escherichia coli (p)ppgpp followed by thin layer chromatography

Den (p) ppGpp nukleotid fungerar som en global regulator i bakterier som svar på en mängd olika fysiska och näringsmässiga stress. Den har en snabb debut, i sekunder, vilket leder till ackumulering av nivåer som närmar sig eller överskrider de av GTP pooler. Stress återföring tillfällen en snabb försvinnande av (p) ppGpp, ofta med en halveringstid på mindre än en minut. Närvaron av (p) ppGpp resulterar i förändringar av cellulära genuttryck och metabolism som motverkar de skadliga effekterna av stress. Gramnegativa och grampositiva bakterier har olika responsmekanismer, men båda är beroende av (p) ppGpp-koncentration. Under alla omständigheter finns det ett behov av att samtidigt övervaka många radiomärkade bakteriekulturer vid tidsintervall som kan variera från 10 sekunder till timmar under kritiska stress övergångsperioder. Detta protokoll tar upp denna tekniska utmaning. Metoden utnyttjar temperatur-och shaker-kontrollerade mikrotiter skålen inkubatorer som möjliggör parallell övervakning av tillväxt (absorbans) och snabb provtagning av enhetligt fosfat-radiomärkade kulturer att lösa och kvantitera nukleotid pooler genom tunn skikts kromatografi på PEI-cellulosa. Små mängder prov behövs för flera tekniska och biologiska replikat av analyser. Komplexa tillväxt övergångar, såsom diauxic tillväxt och Rapid (p) ppGpp omsättningshastighet kan kvantitativt bedömas med denna metod.

I E. coli K-12 stammar, tillsats av valin provocerar en endogent svält av isoleucin, vilket resulterar en ökning av ppgpp nivåer efter 5 min3. Celler som odlas i moppar som innehåller alla aminosyror utom ILV har märkts med 32P enligt figur 1. När det har märkts har 6 μL 10 mg/mL L-valin (100 μg/mL slutlig koncentration) tillsatts för att framställa isoleucin-svält. Prover togs 0 och 5 min efter tillsats av valien. Efter 5 minute...

Watch this Scientific Journal Video about Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli pppGpp Followed by Thin Layer Chromatography at JoVE.com

Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli pppGpp Followed by Thin Layer Chromatography

Tillväxten av radiomärkade bakteriekulturer i mikrotiterrätter underlättar hög genomströmning provtagning som tillåter flera tekniska och biologiska replikat analyser av nukleotid pool överflöd, inklusive den av (p) ppGpp. Effekterna av tillväxt övergångar provoceras av källor till fysiologisk stress samt återhämtning från stress kan övervakas.

Använda Microtiter Dish Radiolabeling för flera in vivo mätningar av Escherichia coli (p) Ppgpp följt av tunn skikts kromatografi

The (p)ppGpp nucleotide functions as a global regulator in bacteria in response to a variety of physical and nutritional stress. It has a rapid onset, in ...

Denna metod mäter nivåerna för den globala tillsynsmyndigheten ppGpp inom olika tillväxtförhållanden och stresssituationer. PpGpp kan hittas i grampositiva och negativa bakterier, samt i kloroplast. PpGpp har en snabb debut på några sekunder, vilket leder till en snabb andra relation när stress produceras.Samtidigt har den en kort halveringstid, upp till 30 sekunder. Därför finns det ett behov av att övervaka många kultur med tidsintervall som kan variera från 10 sekunder till timmar, inklusive stressade övergångar. Vi radiolabel bakteriekulturer i microtiter rätter underlättar hög genomströmning provtagningar som tillåter flera tekniska och biologiska replikat.Se till att följa de riktiga säkerhetsåtgärderna när du arbetar med radioaktiva material. Om du vill börja med den här proceduren förbereder du alla media enligt textprotokollet. Odla över natten kulturer i MOPS media med tre millimolarnatriumfosfat.Tillsätt 550 mikroliter av MOPS-media, som förhindrar 0,2 mikromolarnatriumfosfatbärare och 30 mikroliter av varje bakteriell inokulat till brunnarna i en 24 brunnsplatta. Detta kommer att resultera i en inledande inokulat med en OD600 på 0,1. Lägg till färska medier till en väl som en sterilitet kontroll.Placera plattan i en skakande inkubator på 37 grader celsius, skakningar vid 900 RPM i 30 minuter. Tillväxt kan övervakas med hjälp av en tallriksläsare med en replikatplatta parallellt i media som saknar p32 med hjälp av en tallriksläsare medan du inkuberar under samma förhållanden. Därefter lägger du till 100 mikrokurer av p32 orthphosphate till varje brunn av plattan.Odla kulturerna i en skakande inkubator för en till två fördubblingar så att extern etikett till stor del jämvikt med intercellulära nukleotidpooler. För korrekt visualisering användes inget av det aktiva materialet i den här videon. I ett riktigt experiment krävs korrekt avskärmning samt ständig övervakning för kontaminering med en undersökningsmätare.Först inducera stress med hjälp av en metod som är lämplig för den typ av stress som studeras. Därefter lägger du till 20 mikroliter av varje märkt cellprov till en separat 0,2 milliliter PCR-röret, som innehåller 20 mikroliter iskall sex molar myrsyra. Placera omedelbart proverna på torris.Förbättra cellulär extraktion effektivitet genom tre cykler av frysning och upptining. Strax innan spotting PEI cellulosa tunt lager kromatogram, centrifugerna proverna i en minut vid maximal hastighet till pellet cell skräp. Först anges en 20 med 20 centimeter PEI cellulosa TLC plattan.Använd sax för att ta bort de fem översta centimeter. Och använd en mjuk penna för att markera en ursprungslinje en centimeter från kanten. Applicera en fem mikroliterdroppe av varje prov på PEI-ytan.Innan platsen kan torka, överför plattan till en tank som innehåller ett skikt av 1,5 molar monopotassiumfosfat som är grunt nog att inte röra ursprunget prov plats. Täck tanken med en lufttät tätning, och låt flytande uppstigning till toppen av 15 centimeter trimmade arket. Efter detta, ta bort det fullt utvecklade kromatogrammet och lufttorka det i rumstemperatur.Skär och kassera den övre delen av kromatogrammet som innehåller det fria P32 till radioaktivt avfall. Använd en fosfor skärm för att exponera audioradiographic filmer över natten. Nästa dag, utveckla filmen och använda en fosforbildare för att fånga och kvantifiera fosfor gröna signal.Använd sedan ImageJ-programvara för att kvantifiera de radioaktiva fläckarna. Efter att ha provocerat fram stress eller svält för tid som är tillräcklig för att tillåta ppGpp-ackumulering, använd en lämplig metod för att vända påkänningen. Ta prover var 20 till 30:e sekund i upp till två minuter och behandla proverna enligt tidigare beskrivning.När TLC är utvecklad, och nivåerna av ppGpp erhålls under tidskursen, rita resterande ppGpp innehåll på en semilogaritmisk tomt kontra tid. I denna studie, celler som odlas i MOPS som innehåller alla aminosyror utom för ILV är märkta med P32. När märkt, L valine läggs till producera isoleucin svält.Efter fem minuter inträffade en två och en halv gammal ökning av nivåerna av tetra och pentaphosphate av guanosin. En negativ kontroll av en cell fri märkt prov används för att upptäcka möjliga föreningar som inte är ortofosfat i P32 källa. Återföring av isoleucin svält kan uppnås genom kloramfenikol, en hämmare av proteinsyntesen, vilket minskar konsumtionen av laddade isoleucin tRNA, och i sin tur, återställer höga nyckeltal av laddade till oladdade tRNA.Aktivering av den starka rela-medierad ppGpp synthetase avskaffas, vilket möjliggör ett mått på ppGpp nedbrytning oberörd av resterande syntes. I detta fall förfall ppGpp med en halveringstid på cirka 64 sekunder. Det är viktigt att låta cellerna växa för ett par generationer för att uppnå en enhetlig märkning innan förmå någon stress eller svält.Eftersom ppGpp är allmänt spridd bland bakterier, kan denna metod tillämpas på andra organismer. Ändring av TLC-utvecklingsmetoden skulle kunna möjliggöra korrekt separation av alla regulatoriska nukleotider, såsom ppApp. P52 är en bättre emitterisotop, så det är viktigt att använda korrekt avskärmning och att ordentligt kassera eventuella rester.

Research

JoVE Journal

Biology

Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli (p)ppGpp Followed by Thin Layer Chromatography

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI Provberedning: Ultra tunt lager Metod

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Test för att mäta aktiviteten hos Escherichia coli Inducible Lysin Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC)

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography TLC Coupled with Gas-Liquid Chromatography GLC

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profilering med tunnskiktskromatografi (TLC) i kombination med vätske-gaskromatografi (GLC)

Biological membranes separate cells from the environment. From a single cell to multicellular plants and animals, glycerolipids, such as ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Hög throughput screening av svamp Endoglucanase aktivitet i Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

In vivo Lever Endocytosis följt av rening av leverceller genom levern perfusion

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood.  The basic architecture of the liver is illustrated in ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Kartläggning Bakteriella funktionella nätverk och vägar i<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Använda syntetiska genetiska Arrays

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Snabb Protokoll för Beredning av elektro<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Och<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Upptäckt av Live<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 celler genom PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Spårning av Hematopoietic Stem och stamceller i vuxen mus calvarial Benmärg

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Det mångfacetterade Fördelar med Protein Samexpression i<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...