Name: using microtiter dish radiolabeling for multiple in vivo measurements of escherichia coli (p)ppgpp followed by thin layer chromatography
Uploaded: 2019-06-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli pppGpp Followed by Thin Layer Chromatography at JoVE.com

Bu araştırma Intramural araştırma programı, Eunice Kennedy Shriver Ulusal Enstitüsü Çocuk Sağlığı ve ınsan gelişimi, NıH destekleniyordu.

1. medya hazırlığı
<ol><li>
MOPS için (3-(N-morpholino) propanesulfonik asit) medya25, kullanın 1/10 hacım 10X Mops tuzları, 1/100 hacmi 100x mikroutrients çözeltisi, 3 mm sodyum fosfat gece kültürler için veya 0,2 mm sodyum fosfat için üniforma etiketleme ile 32P, 0,2% glikoz ve 1 μg/mL tiamin (B1 vitamini). Gerekirse 40 μg/mL 'de amino asitler ekleyin.
	<ol>
<li>MOPS tuzları için, 400 mM MOPS, 40 mM Tricine, 0,1 mM FeSO4, 95 mm NH4...

<ol>
	<li>Cashel, M., Gentry, D., Hernandez, V., Vinella, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stringent+Response.">The stringent Response.</a> Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology. , 1458-1489 (1996).</li><li>Magnusson, L. U., Farewell, A., Nystr&#246;m, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp:+a+global+regulator+in+Escherichia+coli.">ppGpp: a global regulator in Escherichia coli.</a> Trends in Microbiology. 13 (5), 236-242 (2005).</li><li>Cashel, M., Gallant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Compounds+implicated+in+the+Function+of+the+RC+Gene+of+Escherichia+coli.">Two Compounds implicated in the Function of the RC Gene of Escherichia coli.</a> Nature. 221 (5183), 838-841 (1969).</li><li>Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+horizons+for+(p)ppGpp+in+bacterial+and+plant+physiology.">New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology.</a> Trends in Microbiology. 14 (1), 45-54 (2006).</li><li>Atkinson, G. C., Tenson, T., Hauryliuk, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RelA/SpoT+homolog+(RSH)+superfamily:+distribution+and+functional+evolution+of+ppGpp+synthetases+and+hydrolases+across+the+tree+of+life.">The RelA/SpoT homolog (RSH) superfamily: distribution and functional evolution of ppGpp synthetases and hydrolases across the tree of life.</a> PloS One. 6 (8), e23479 (2011).</li><li>Mechold, U., Potrykus, K., Murphy, H., Murakami, K. S., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+by+ppGpp+versus+pppGpp+in+Escherichia+coli.">Differential regulation by ppGpp versus pppGpp in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 41 (12), 6175-6189 (2013).</li><li>Molodtsov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+Effector+ppGpp+Potentiates+the+Inhibition+of+Transcript+Initiation+by+DksA.">Allosteric Effector ppGpp Potentiates the Inhibition of Transcript Initiation by DksA.</a> Molecular Cell. 69 (5), 828-839 (2018).</li><li>Ross, W., Sanchez-Vazquez, P., Chen, A. Y. Y., Lee, J. -. H. H., Burgos, H. L. L., Gourse, R. L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp+Binding+to+a+Site+at+the+RNAP-DksA+Interface+Accounts+for+Its+Dramatic+Effects+on+Transcription+Initiation+during+the+Stringent+Response.">ppGpp Binding to a Site at the RNAP-DksA Interface Accounts for Its Dramatic Effects on Transcription Initiation during the Stringent Response.</a> Molecular Cell. 62 (6), 811-823 (2016).</li><li>Kriel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Regulation+of+GTP+Homeostasis+by+(p)ppGpp:+A+Critical+Component+of+Viability+and+Stress+Resistance.">Direct Regulation of GTP Homeostasis by (p)ppGpp: A Critical Component of Viability and Stress Resistance.</a> Molecular Cell. 48 (2), 231-241 (2012).</li><li>Kriel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTP+dysregulation+in+Bacillus+subtilis+cells+lacking+(p)ppGpp+results+in+phenotypic+amino+acid+auxotrophy+and+failure+to+adapt+to+nutrient+downshift+and+regulate+biosynthesis+genes.">GTP dysregulation in Bacillus subtilis cells lacking (p)ppGpp results in phenotypic amino acid auxotrophy and failure to adapt to nutrient downshift and regulate biosynthesis genes.</a> Journal of Bacteriology. 196 (1), 189-201 (2014).</li><li>Potrykus, K., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p)ppGpp:+still+magical.">p)ppGpp: still magical.</a> Annual Review of Microbiology. 62, 35-51 (2008).</li><li>Hauryliuk, V., Atkinson, G. C., Murakami, K. S., Tenson, T., Gerdes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+functional+insights+into+the+role+of+(p)ppGpp+in+bacterial+physiology.">Recent functional insights into the role of (p)ppGpp in bacterial physiology.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (5), 298-309 (2015).</li><li>Arenz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stringent+factor+RelA+adopts+an+open+conformation+on+the+ribosome+to+stimulate+ppGpp+synthesis.">The stringent factor RelA adopts an open conformation on the ribosome to stimulate ppGpp synthesis.</a> Nucleic Acids Research. 44 (13), 6471-6481 (2016).</li><li>Loveland, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome&#8226;RelA+structures+reveal+the+mechanism+of+stringent+response+activation.">Ribosome&#8226;RelA structures reveal the mechanism of stringent response activation.</a> eLife. 5, e17029 (2016).</li><li>Brown, A., Fern&#225;ndez, I. S., Gordiyenko, Y., Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome-dependent+activation+of+stringent+control.">Ribosome-dependent activation of stringent control.</a> Nature. 534 (7606), 277-280 (2016).</li><li>Battesti, A., Bouveret, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acyl+carrier+protein/SpoT+interaction,+the+switch+linking+SpoT-dependent+stress+response+to+fatty+acid+metabolism.">Acyl carrier protein/SpoT interaction, the switch linking SpoT-dependent stress response to fatty acid metabolism.</a> Molecular Microbiology. 62 (4), 1048-1063 (2006).</li><li>Lee, J. -. W., Park, Y. -. H., Seok, Y. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rsd+balances+(p)ppGpp+level+by+stimulating+the+hydrolase+activity+of+SpoT+during+carbon+source+downshift+in+Escherichia+coli.">Rsd balances (p)ppGpp level by stimulating the hydrolase activity of SpoT during carbon source downshift in Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (29), E6845-E6854 (2018).</li><li>Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+(p)ppGpp+Accumulation+Patterns+in+Escherichia+coli+mutants.">Detection of (p)ppGpp Accumulation Patterns in Escherichia coli mutants.</a> Molecular Microbiology Techniques. 3, 341-356 (1994).</li><li>Fern&#225;ndez-Coll, L., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+SpoT+Hydrolase,+SpoT+Synthetase,+and+RelA+Synthetase+to+Carbon+Source+Diauxic+Growth+Transitions+in+Escherichia+coli.">Contributions of SpoT Hydrolase, SpoT Synthetase, and RelA Synthetase to Carbon Source Diauxic Growth Transitions in Escherichia coli.</a> Frontiers in Microbiology. , (2018).</li><li>Varik, V., Oliveira, S. R. A., Hauryliuk, V., Tenson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPLC-based+quantification+of+bacterial+housekeeping+nucleotides+and+alarmone+messengers+ppGpp+and+pppGpp.">HPLC-based quantification of bacterial housekeeping nucleotides and alarmone messengers ppGpp and pppGpp.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11022 (2017).</li><li>Rhee, H. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Fluorescent+Chemosensor+for+the+Bacterial+Alarmone+(p)ppGpp.">Selective Fluorescent Chemosensor for the Bacterial Alarmone (p)ppGpp.</a> J. Am. Chem. Soc. 130 (3), 784-785 (2008).</li><li>Wang, J., Chen, W., Liu, X., Wesdemiotis, C., Pang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mononuclear+Zinc+Complex+for+Selective+Detection+of+Diphosphate+via+Fluorescence+ESIPT+Turn-On.">A Mononuclear Zinc Complex for Selective Detection of Diphosphate via Fluorescence ESIPT Turn-On.</a> Journal of Materials Chemistry B. 2 (21), 3349-3354 (2014).</li><li>Pokhilko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+nutrient+limitation+in+growing+E.+coli:+a+mathematical+model+of+a+ppGpp-based+biosensor.">Monitoring of nutrient limitation in growing E. coli: a mathematical model of a ppGpp-based biosensor.</a> BMC Systems Biology. 11 (1), 106 (2017).</li><li>Funabashi, H., Mie, M., Yanagida, Y., Kobatake, E., Aizawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+monitoring+of+cellular+physiological+status+depending+on+the+accumulation+of+ppGpp.">Fluorescent monitoring of cellular physiological status depending on the accumulation of ppGpp.</a> Biotechnology Letters. 24 (4), 269-273 (2002).</li><li>Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+medium+for+enterobacteria.">Culture medium for enterobacteria.</a> Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Peselis, A., Serganov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ykkC+riboswitches+employ+an+add-on+helix+to+adjust+specificity+for+polyanionic+ligands.">ykkC riboswitches employ an add-on helix to adjust specificity for polyanionic ligands.</a> Nature Chemical Biology. 14 (9), 887-894 (2018).</li><li>Oki, T., Yoshimoto, A., Sato, S., Takamatsu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purine+nucleotide+pyrophosphotransferase+from+Streptomyces+morookaensis,+capable+of+synthesizing+pppApp+and+pppGpp.">Purine nucleotide pyrophosphotransferase from Streptomyces morookaensis, capable of synthesizing pppApp and pppGpp.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology. 410 (2), 262-272 (1975).</li><li>Travers, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppApp+alters+transcriptional+selectivity+of+Escherichia+coli+RNA+polymerase.">ppApp alters transcriptional selectivity of Escherichia coli RNA polymerase.</a> FEBS Letters. 94 (2), 345-348 (1978).</li><li>Bruhn-Olszewska, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+comparisons+of+(p)ppApp+vs+(p)ppGpp+for+Escherichia+coli+RNA+polymerase+binding+sites+and+for+rrnB+P1+promoter+regulatory+responses+in+vitro.">Structure-function comparisons of (p)ppApp vs (p)ppGpp for Escherichia coli RNA polymerase binding sites and for rrnB P1 promoter regulatory responses in vitro.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms. 1861 (8), 731-742 (2018).</li></ol>

Hücrelerin yakın Tekdüzen etiketleme ulaşmak bu protokol için kritik bir adımdır. Bu nedenle, MOPS veya Tris medya gibi tanımlanmış medya kullanımı, taşıyıcı fosfat konsantrasyonları ve belirli aktivite varyasyonu sağlamak için çok önemlidir. M9 veya medya A gibi fosfat arabelleğe alınmış medya kullanılamaz. Çoğu tanımlanamayan medya, £, Tripton ve kasaminoz asitleri gibi değişken miktarlarda fosfat içerir. Fosfat izotopu 33p, 32p için yerine konulabilir daha zayıf...

(P) ppgpp ikinci haberci ribozomlarda ve amino asitler synthesizer sentezlemek için genler de dahil olmak üzere genler çok sayıda ifade modülasyonlu bir küresel regülatör olduğunu1,2. Başlangıçta Escherichia coli3' te keşfedilen olsa da, (p) ppgpp hem gram pozitif hem de gram negatif bakterilerin yanı sıra Plant kloroplast4,5' te bulunabilir. E. coli ve diğer gram-negatif bakteriler için, (p) ppgpp iki farklı sitede RNA polimeraz ile doğrudan etkileşime girer6,7,8. Gram pozitiplerinde, (p) ppgpp, CodY tarafından bilindiği GTP bereket inhibe, yönetmeliğine yol gen-spesifik DNA tanıma motifleri ile bir GTP-bağlayıcı protein9,10. (p) ppgpp farklı besin ve stres koşulları için açlık yanıt olarak birikir, yavaş büyüme ve gen ifadesi ayarlamaları sonuçlanan stres adaptasyon sağlamak için11,12.
Net miktar ppgpp birikmiş sentetaz ve hidrolaz etkinlikleri arasında bir denge yansıtır. E. coli rela güçlü bir sentetaz ve SpoT, güçlü bir hidrolaz ve zayıf bir sentetaz ile, her biri farklı bir stres bağımlı şekilde düzenlenmiş olabilir bifetit olduğunu. Güçlü rela sentetaz, Codon tarafından belirlenen şarj edilen tRNA 'nın, protein sentezi13,14,15taleplerini karşılamak için başarısız olduğunda ribozomal bir siteye bağlı olduğu zaman etkinleştirilir. Zayıf nokta (p) ppgpp sentetaz, güçlü (p) ppgpp hidrolaz diğer stres koşullarına ve diğer mekanizmalara yanıt olarak engellenmiş durumdayken etkinleştirilir. Bazı koşullar altında, ACP veya RSD gibi proteinler, aynı zamanda hidroliz ve sentez16,17arasındaki dengeyi değiştirmek SpoT bağlayabilirsiniz. Gram pozitişlerinde sentez ve hidroliz, güçlü sentez ve hidroliz faaliyetlerinin yanı sıra daha küçük Hidrolazlar ve/veya senthetaz12ile tek bir rela SpoT homolog (RSH) proteini arasında daha karmaşık bir denge yansıtır.
(P) ppGpp nükleotidler ilk amino asit açlık3tarafından indüklenen sıkı bir yanıt sırasında ince katmanlı kromatogram (TLC) autoradiograms ortaya çıkan olağandışı 32p etiketli noktalar olarak keşfedilen. Daha ayrıntılı etiketleme protokolleri 18değerlendirildi. Burada açıklanan protokol (Şekil 1), mikrotiter plakaları üzerinde birden fazla numunenin gelişimini izlemeyi sağlayan bu protokollerin bir değişikliğini oluşturmaktadır. Bu (p) ppGpp bolluk değişiklikleri birden fazla biyolojik ve teknik tahminler kolaylaştırır ve başlangıçta diauxic vardiya çalışmaları için geliştirilmiştir19. 32p ve TLC tarafından tespit edilen (p) ppgpp etiketlemesi de (p) ppgpp azalma oranlarının ölçülmesine olanak tanır. PpGpp23' ün etkilendiği organizatörler için kütle spektrometresi, HPLC20, floresan chemosensors21,22ve Gfp gen Fusions gibi ppgpp düzeylerini belirlemek üzere alternatif yöntemler geliştirilmiştir. 24. floresan chemosensors Şu anda sınırlı bir kullanım nedeniyle ppgpp ve pppgpp21arasında ayırt sorunları bağlama sonra küçük spektral vardiya vardır. Bu yöntem algılamak için etkilidir (p) ppGpp in vitro, ancak hücresel özler. HPLC içeren yöntemler20 geliştirilmiş ama pahalı ekipman gerektirir ve iyi yüksek aracılığıyla-put adapte değildir. Son olarak, GFP Fusions ppGpp bağımlı aktivasyon veya inhibisyonu bir tahmin verebilir, ancak ppGpp kendisini ölçmek değil. Bu alternatif yöntemlerin her biri değerli iken, onlar pahalı ekipman veya önemli Hands-on zaman gerektirir, ya da aksi takdirde birden fazla kinetik örnekleme ve sonraki işleme için uygun değildir. Burada açıklanan yöntemle, 96 numuneler yaklaşık 20 dakika içinde (plaka başına 18 numune) altı TLC plakasına uygulanabilir, TLC gelişimi tarafından birkaç saatten daha az bir süre içinde çözülebilir, etiketlemeye bağlı olarak birkaç saat veya gece sonra elde edilen nicel verilerle Yoğun -luğu.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(NH4)6(MO7)24</td>
			<td>Fisher Scientifics</td>
			<td>A-674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoradiography film</td>
			<td>Denville scientific inc.</td>
			<td>E3218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>1-1309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>RPI</td>
			<td>C61000-25.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2</td>
			<td>Fisher Scientifics</td>
			<td>C-371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>1843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4</td>
			<td>Fisher Scientifics</td>
			<td>I-146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Fisher Biotech</td>
			<td>BP1215-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Macron</td>
			<td>4912-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO4</td>
			<td>Macron</td>
			<td>2549-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3PO4</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>0260-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2SO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9458-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Biotech</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Valine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V-6504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher Scientifics</td>
			<td>FL-06-0303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader Synergy HT</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-9522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1254-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>7892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>3624-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>7917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0171-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-32 radionuclide, orthophosphoric acid in 1 mL water (5 mCi)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEX053005MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage phosphor screen</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>So230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-4625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC PEI Cellulose F</td>
			<td>Merk-Millipore</td>
			<td>1.05579.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine</td>
			<td>RPI</td>
			<td>T2400-500.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon 9400 imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4</td>
			<td>Fisher Scientifics</td>
			<td>Z-68</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using microtiter dish radiolabeling for multiple in vivo measurements of escherichia coli (p)ppgpp followed by thin layer chromatography

Çeşitli fiziksel ve beslenme stresine yanıt olarak bakterilerde küresel bir regülatör olarak (p) ppGpp nükreotid fonksiyonları. Bu, GTP havuzlarının yaklaşması veya aşan düzeylerin birikmesine yol açan, saniyeler içinde hızlı bir başlangıça sahiptir. Stres ters durumlar (p) ppgpp, genellikle bir dakikadan az bir yarı ömrü ile hızlı bir ortadan kalkması. (P) ppGpp varlığı, stres zararlı etkileri karşı hücresel gen ifade ve metabolizma değişiklikler sonuçlanır. Gram-negatif ve gram-pozitif bakterilerin farklı reaksiyon mekanizmaları vardır, ancak her ikisi de (p) ppGpp konsantrasyonuna bağlıdır. Herhangi bir durumda, kritik stres geçiş dönemlerinde 10 saniyeden saate kadar değişebilir zaman aralıklarında birçok radyoaktif bakteriyel kültürler aynı anda izlemek için bir ihtiyaç vardır. Bu protokol bu teknik sorunu giderir. Yöntem, büyüme (emici) ve homojen fosfat-radiolabeled kültürlerin hızlı örnekleme paralel izlenmesi izin sıcaklık ve Shaker kontrollü mikrotiter çanak inküküperlerin yararlanmak ve nükleyici havuzlar tarafından quantitate PEI-selüloz üzerinde ince katmanlı Kromatografi. Analizlerin birden fazla teknik ve biyolojik çoğaltır için küçük miktarlarda örnek gereklidir. Diauxic büyüme ve hızlı (p) ppGpp ciro oranları gibi kompleks büyüme geçişleri bu yöntem ile niceci olarak değerlendirilebilir.

E. coli K-12 suşları, valin ilavesi ısoleucine bir endojen açlık provoke, 5 dakika sonra ppgpp seviyeleri bir artış sonuçları3. ILV hariç tüm amino asitleri içeren MOPS 'de yetiştirilen hücreler, Şekil 1' de belirtildiği gibi 32P ile etiketlenmiştir. Bir kez etiketlenmiş, ısoleucine açlık üretmek için 6 μL 10 mg/mL L-valine (100 μg/mL final konsantrasyonu) eklendi. Numuneler valine eklendikten sonra 0 ve 5 dk alınm?...

Watch this Scientific Journal Video about Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli pppGpp Followed by Thin Layer Chromatography at JoVE.com

Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli pppGpp Followed by Thin Layer Chromatography

Radyoaktif bakteriyel kültürlerin mikrotiter yemeklerde büyümesi, (p) ppgpp dahil olmak üzere birden çok teknik ve biyolojik çoğalan nükstrütit havuzu zenginliğini sağlayan yüksek verimlilik örneklemesini kolaylaştırır. Fizyolojik stres kaynakları tarafından provoke edilen büyüme geçişleri ve stres kurtarma etkileri izlenebilmektedir.

Ince katman Kromatografi takip Escherichia coli (p) ppGpp çoklu In vivo ölçümleri Için mikrotiter bulaşık Radiolabeling kullanma

The (p)ppGpp nucleotide functions as a global regulator in bacteria in response to a variety of physical and nutritional stress. It has a rapid onset, in ...

Bu yöntem, farklı büyüme koşulları ve stres durumları içinde küresel regülatör ppGpp düzeylerini ölçer. PpGpp gram pozitif ve negatif bakterilerde yanı sıra kloroplast bulunabilir. PpGpp saniyeler içinde hızlı bir başlangıç vardır, stres üretildikten sonra hızlı bir ikinci ilişkiye yol açan.Aynı anda, 30 saniyeye kadar kısa bir yarı ömrü vardır. Bu nedenle, stresli geçişler de dahil olmak üzere 10 saniyeile saat arasında değişebilen zaman aralıklarında birçok kültürü izlemek gerekir. Ayrıca mikrotiter yemeklerde bakteri kültürlerini radyolabel olarak birden fazla teknik ve biyolojik kopyaya izin veren yüksek üretim örneklemelerini kolaylaştırır.Radyoaktif malzemelerle çalışırken uygun güvenlik önlemlerine uyun. Bu yordamı başlatmak için, metin protokolünde özetlenen tüm ortamları hazırlayın. Üç milimolar sodyum fosfat ile MOPS medyada bir gecede kültürleri büyümek.MOPS medya 550 mikrolitre ekleyin, 24 kuyu plaka kuyularına 0,2 mikromolar sodyum fosfat taşıyıcı ve her bakteriyel inoculum 30 mikrolitre contining. Bu 0.1 bir OD600 ile bir başlangıç inoculum neden olacaktır. Bir sterilite kontrolü gibi bir taze medya ekleyin.37 santigrat derece bir sallayarak kuvöz de plaka yerleştirin, 30 dakika boyunca 900 RPM sallayarak. Büyüme aynı koşullar altında kuluçka sırasında p32 eksik medya paralel bir çoğaltma plaka ile bir plaka okuyucu kullanılarak izlenebilir. Daha sonra, plaka her kuyuya p32 orthphosfat 100 mikrocuries ekleyin.Dış etiketbüyük ölçüde hücreler arası nükleotit havuzları ile dengelemek için izin vermek için bir ila iki iki katına sallayarak bir kuluçka kültürleri büyütün. Uygun görselleştirme için, aktif malzeme hiçbiri bu videoda kullanılmadı. Gerçek bir deneyde, uygun korumanın yanı sıra bir etüt ölçerle kontaminasyon için sürekli izleme gereklidir.İlk olarak, stres tür için uygun bir yöntem kullanarak stres neden okudu. Daha sonra, her etiketli hücre örneğinden 20 mikrolitreyi ayrı bir 0,2 mililitrelik PCR tüpüne ekleyin, 20 mikrolitre buz gibi soğuk altı azılı formik asit içeren. Örnekleri hemen kuru buzüzerine yerleştirin.Dondurma ve eritme üç döngü leri ile hücresel ekstraksiyon verimliliğini artırın. PEI selüloz ince tabaka kromatogramları tespit hemen önce, pelet hücre enkaz maksimum hızda bir dakika için örnekleri santrifüj. İlk olarak, 20 tarafından 20 santimetre PEI selüloz TLC plaka yola.Üst beş santimetre kaldırmak için makas kullanın. Ve kenardan bir santimetre uzaklıktaki bir başlangıç çizgisini işaretlemek için yumuşak bir kalem kullanın. PEI yüzeyine her numuneden beş mikrolitrelik damlatın uygulayın.Nokta kurumadan önce, plakayı 1,5 molar monopotasyum fosfat tabakası içeren ve başlangıç numunesi noktasına değmeyecek kadar sığ bir tanka aktarın. Tankı hava geçirmez bir contayla kapatın ve 15 santimetre kesilmiş levhanın üstüne sıvı tırmanışı bekleyin. Bundan sonra, tam gelişmiş kromatogram çıkarın ve oda sıcaklığında kuru.Serbest P32 içeren kromatogramın üst kısmını radyoaktif atıklara kesin ve atın. Bir gecede audioradiographic filmleri ortaya çıkarmak için bir fosfor ekran kullanın. Ertesi gün, filmi geliştirin ve fosforun yeşil sinyalini yakalamak ve quantitate etmek için bir fosforimager kullanın.Ardından, radyoaktif noktaları quantitate için ImageJ yazılımı kullanın. PpGpp birikimine izin vermek için yeterli zaman için stres veya açlık provoke sonra, stresi tersine çevirmek için uygun bir yöntem kullanın. İki dakikaya kadar her 20 ila 30 saniyede bir numune alın ve örnekleri daha önce açıklandığı gibi işleyin.TLC geliştirildikten ve ppGpp düzeyleri zaman dilimi sırasında elde edildikten sonra, semilogathmic arsa ve zaman kalıntı ppGpp içeriği arsa. Bu çalışmada, ILV hariç tüm amino asitleri içeren MOPS'larda yetişen hücreler P32 ile etiketlenmiştir. Bir kez etiketli, L valine izolösin açlık üretmek için eklenir.Beş dakika sonra, guanozin tetra ve pentaphosfat düzeylerinde iki buçuk eski bir artış meydana geldi. P32 kaynağında ortopedik olmayan olası bileşikleri tespit etmek için hücre içermeyen etiketli numunenin negatif kontrolü kullanılır. Izolösin açlığı tersine çevirmek kloramfenikol ile elde edilebilir, protein sentezinin bir inhibitörü, hangi yüklü izolösin tRNA tüketimini azaltır, ve sırayla, şarj edilmemiş tRNA yüklü yüksek oranlarda geri.Güçlü rela aracılı ppGpp synthetase aktivasyonu kaldırılır, hangi ppGpp bozulma bir ölçü kalıntı sentezi ile tedirgin sağlar. Bu durumda ppGpp yaklaşık 64 saniyelik yarı ömrü ile çürür. Bu hücrelerin herhangi bir stres veya açlık indüklemeden önce tek tip etiketleme elde etmek için nesiller bir çift için büyümeye izin önemlidir.PPGpp bakteriler arasında yaygın olarak yayıldığı için bu yöntem diğer organizmalara uygulanabilir. TLC geliştirme yönteminin değiştirilmesi ppApp gibi tüm düzenleyici nükleotitlerin doğru şekilde ayrılmasına olanak sağlayabilir. P52 daha iyi bir yayıcı izotop, bu yüzden uygun koruma kullanmak ve düzgün herhangi bir kalıntı atmak için önemlidir.

Research

JoVE Journal

Biology

Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli (p)ppGpp Followed by Thin Layer Chromatography

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI Numune Hazırlama: Ultra İnce Tabaka Yöntemi

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Etkinlik Ölçüm Bir Testi Escherichia coli Lizin Decarboxyase Đndüklenebilir

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC)

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography TLC Coupled with Gas-Liquid Chromatography GLC

İnce Tabaka Kromatografisi (TLC) tarafından Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profil Gaz-Sıvı Kromatografi (GLC) ile birleştiğinde

Biological membranes separate cells from the environment. From a single cell to multicellular plants and animals, glycerolipids, such as ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Mantar Endoglucanase Faaliyet Yüksek Verimli Tarama Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

Karaciğer Hücreleri Karaciğer Perfüzyon Arıtma Takip in vivo Karaciğer endositoz

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood.  The basic architecture of the liver is illustrated in ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Bakteriyel Fonksiyonel Ağlar ve tanımında Haritalama<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Sentetik Genetik Diziler kullanarak

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Elektrokompetan Hazırlanması için hızlı Protokolü<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Ve<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Live Algılama<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: PMA-qPCR H7 Hücreler

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein birlikte-ifade edilme yönlü Faydalar<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...