Name: fabrication of amyloid-&#946;-secreting alginate microbeads for use in modelling alzheimer's disease
Uploaded: 2019-07-06T12:30:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Amyloid-ÃŽÂ²-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease at JoVE.com

作者要感谢卡延·苏雷斯帕兰先生、乔纳森·乌贝图博士、多米尼克·格鲁津斯基先生、陈昭小姐和蒂埃里博士试点,感谢他们在优化藻酸盐微珠制造、细胞培养和A+检测方面所做的帮助,以及有用的科学讨论。

1. 准备工作
<ol><li>准备 100 mL 的 ±4%(w/v)藻酸盐库存溶液。<ol>
<li>称量4.4克藻酸钠盐,将干粉加入100 mL的HEPES缓冲盐水(HBS,20 mM HEPES (0.477 g),在去离子水中加入 150 mM NaCl (0.877 g)。</li>
		<li>使用磁搅拌器,每分钟约 500 转 (rpm),加热至 50°C,以便完全化藻水化。 注:藻酸盐可能需要一两个小时才能完全水合。为了节省时间,藻酸盐溶液可以在封装协议之前一天进行,并储存在4°C直到第二天。当藻酸盐冷藏后,使用水浴或热板轻轻加热至37°C,并在使用前立即用磁搅拌器搅拌。</li>
		<li>使用前使用0.22 μm孔孢子素(PES)过滤器对藻酸盐溶液进行无菌过滤。建议在37°C下进行过滤,以便容易地流动藻酸盐。如果允许温度下降,粘度就会增加。</li>
	</ol>
</li>
	<li>准备 1,000 mL 的 0.5 M CaCl2.<ol>
<li>重量为55.49克无水CaCl2,溶解在1000 mL的HBS(20 mM HEPES和150 mM NaCl在1000 mL的去离子水中)。</li>
		<li>使用 0.22 μm 孔 PES 过滤器的无菌过滤器。</li>
	</ol>
</li>
	<li>准备100 mL的溶解混合物。<ol>
<li>在磷酸盐缓冲盐水中制备100 mM HEPES(23.83克)和500 mM柠酸二水酸三钠(147.05克)溶液。</li>
		<li>使用 NaOH 或 HCl 调节到 pH 7.4。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 设置封装系统
<ol><li>清洁层流罩。<ol>
<li>使用紫外线照射对包含封装器的层状流罩进行消毒,然后使用 70% v/v 乙醇溶液进行喷涂。</li>
		<li>用 10 mL 的 70% v/v 乙醇溶液冲洗封装系统,然后冲洗 10 mL 的无菌去离子水。</li>
		<li>连接 300 μm 喷嘴并重复步骤 2.1.2。</li>
		<li>喷洒含有过滤的藻酸盐溶液的瓶子、含有过滤氯化钙溶液的瓶子以及任何工具、设备和空培养板,这些工具、设备和空培养板将与 70% v/v 乙醇溶液一起使用,并将其放入层流罩中。使用前,再次打开紫外线 30 分钟以彻底消毒。</li>
		<li>准备一个装满生物级消毒液的废烧杯,并将烧杯放入机罩。</li>
		<li>在烧杯中填充 100 mL 无菌 CaCl2(水)溶液,并加入磁搅拌器。将搅拌速度设置为 100 rpm。将烧杯放在离喷嘴尖端 18 厘米的高度的磁性平台上。此烧杯将用于收集藻酸盐珠,并允许其凝胶化。</li>
	</ol>
</li>
	<li>准备用于封装的细胞。<ol>
<li>使用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液从培养箱中取出细胞,从近汇瓶中取出,并在37°C孵育5-10分钟。</li>
		<li>分离样本以估计细胞密度,然后以1,000rpm将剩余的细胞离心5分钟,以获得细胞颗粒。</li>
		<li>在 HBS 中重新悬浮颗粒(20 mM HEPES 和 150 mM NaCl),使最终所需细胞浓度加倍(例如,对于最终浓度为 1.5 x 106细胞/mL,重新悬浮 HBS 中的细胞以达到 3 x 106细胞/mL 的浓度)。</li>
		<li>在50 mL离心管中,将细胞悬浮液与±4%(w/v)藻酸溶液以1:1的比例混合,以获得含有所需细胞浓度的最终悬浮液(例如,1.5 x 106细胞/mL),在±2%(w/v)藻酸溶液中。</li>
	</ol>
</li>
	<li>设置封装参数。<ol>
<li>将封装机的速度设置为最大挤出速度(8.9 mL/min),电压设置为 1.0 kV,频率设置为 5,500 Hz。 注:这些参数先前经过优化,以获得直径为550μm的微珠。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 制造
<ol><li>制造微珠。<ol>
<li>在 20 mL 注射器中,加载 5 mL 的细胞藻酸盐悬浮液,并将注射器连接到封装器。</li>
		<li>通过激活流启动封装器,该流量将细胞藻酸盐悬浮液推入进纸器。水滴流将通过喷嘴挤出。</li>
		<li>在废杯中收集前 1 mL,使初始非均匀流失效。</li>
		<li>继续运行剩余的 4 mL,使液滴落入 CaCl2凝胶浴。如果需要,每毫升可以单独运行(但连续运行),并收集在四个不同的凝胶浴中。 注:与凝胶浴接触时,液滴中的藻酸盐会立即与凝胶浴中的钙离子交联,形成球形微珠。</li>
		<li>一分钟后,从磁性平台中取出凝胶烧杯,让微珠再坐4分钟,没有搅拌(在室温下允许微珠完全凝胶化所需时间)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>检索微珠。<ol>
<li>使用一对无菌钳子清除任何大型藻酸盐碎片或人工制品,然后使用无菌塑料移液器转移到 74 μm 网状过滤器中,从凝胶浴中取回微珠。</li>
		<li>使用适当的培养基将微珠转移到离心管中,并在细胞培养基中平衡5分钟。</li>
		<li>转移到烧瓶、盘子或培养皿中进行孵化和进一步实验。 注:不应重复使用凝胶浴。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 微珠的测试和使用
<ol><li>测试微珠质量。<ol>
<li>要评估封装和培养后的细胞活力(或其他生物读出),轻轻破坏微珠,使用溶解混合物释放封装的细胞。 注:溶解混合物所需的体积取决于每次测试使用的微珠数量。建议的配给是4 mL的溶解混合到每1 mL的封装细胞。此步骤只需在每个微珠群中执行一个样本即可。</li>
		<li>在细胞培养箱中孵育细胞,在37°C下辅以5%CO2,10分钟。</li>
		<li>通过用锥体蓝色染色细胞并使用血细胞计室,评估目前溶液中细胞的细胞生存能力。 注:如果使用自动细胞计数器估计细胞的生存能力,应注意避免藻酸盐人工制品干扰计数。在这些情况下,建议对纳塔尔细胞计数进行计数。</li>
		<li>要评估微珠的稳定性,请使用显微镜和成像软件测量每个微珠群样本的平均直径。直径的显著后续变化可能指示藻酸盐降解。</li>
	</ol>
</li>
	<li>使用微珠检测分泌的A+。<ol>
<li>从7PA2细胞培养基样本中,以24小时为间隔在标准条件(2D)中培养,并储存在-20°C下,以便进一步分析。</li>
		<li>从封装的7PA2细胞中取样细胞培养基,以24小时为间隔在标准条件下(3D)培养,并储存在-20°C下,以便进一步分析。</li>
		<li>通过酶连结免疫吸附剂测定(ELISA)检测从7PA2细胞中分离成收集的条件介质的A+(图4)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>使用微珠在相关应用中进行进一步研究。 注:封装的7PA2细胞可用于评估在任何或模型中持续A+分泌的影响。<ol>
<li>对于大鼠海马在大脑中的微珠移植物,产生1毫米厚的大鼠大脑冠状部分,并使用手术工具将微珠插入所需区域(图5)。</li>
		<li>按照所述协议将不同的细胞类型封装在藻酸盐微珠中,以评估感兴趣的生物分子的持续释放。相关的体外和体内系统可以进一步建模。</li>
		<li>使用流式细胞测定和/或免疫荧光检测封装细胞的膜结合标记物的表达。 注:Rios 20描述了使用类似方法制造微珠模拟肿瘤质量生长和生物标志物表达的早期阶段的例子。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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作者没有什么可透露的。

本文概述的方法对于封装实现小尺寸的藻酸盐微珠分布的细胞非常有用。它还提供了在免疫隔离环境中生长细胞的优势,保护细胞免受外部压力。此外,在藻酸盐中封装细胞更密切地模拟生理条件,特别是细胞与细胞的相互作用和基质刚度20。这些因素对于后续在相关应用中的使用都特别重要,例如体内移植,排除了周围组织的潜在免疫反应17。此外,该协议的一个主要优点是根据感兴趣的应用易于调谐:可以修改协议并优化制造更大或更小、更软或更硬的珠子的参数。所述方法用于制造足够小的珠子,以便注射微创方法,足够大,足以承载大量细胞,并提供足够的 A+ 释放,从而产生可观察到的行为和病理效应在动物模型中注射。
该协议的成功取决于许多关键步骤。小心的细胞处理和最佳的细胞培养技术对于维持细胞活力和功能很重要20,28。使用标准培养条件确保保持7PA2细胞的正常功能,如观察。与 2D 培养相比,这允许封装的单元为 A+1-42提供类似的释放配置文件。此外,与高粘度藻酸盐溶液相比,低粘度藻酸盐溶液可确保更好的结果。这确保了均匀的层状射流通过喷嘴挤压,并在制造珠27的基质内均匀分布细胞。用于封装细胞的材料必须具有非常快速的凝胶机制,允许保留形状。
该协议的另一个关键步骤是在凝胶化后处理制造微珠。在这里,我们展示了使用大孔塑料移液器转移珠子的检索。或者,将含有微珠的氯化钙溶液倒入网状过滤器中,可用于珠子检索。大型(5、10 或 25 mL)血清学移液器可用于绘制微珠,然后通过网状过滤器进行清洗,而不是浇注。与浇注相比,这样做的好处是对程序无菌性更有信心。然而,其局限性是,如果一些珠子被移液器压缩,可能会失真,此外,如果大量微珠没有被拯救,它们可能会降低产量。
这种方法已经用于封装不同的细胞系,以建模和研究不同的疾病(例如,从封装的胰腺胰岛释放胰岛素)。我们方法的新颖性是利用该协议产生的微珠的移植,作为模拟体内阿尔茨海默氏病重要方面的有用方法。当比较A+从封装细胞的释放配置文件(图4)与由bolus注射产生的A+水平(如在其他研究3,26中报告),A+的更慢性和持续释放可以预期。图 6说明了可能实现的预测趋势。使用这个系统进行体内建模更与疾病的进展方式相关,在药物发现和开发中可能更有用。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig6.jpg"> 图 6:与博鲁斯注射相比,从封装的7PA2细胞中预测A+1-42的释放配置文件。含有7PA2的微珠的A+释放的轮廓允许测试与AD相关的动物模型中慢性和持续A+的影响。相反,Bolus注射会在短时间内产生A+水平的峰值,然后迅速清除A+的大脑。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>

由于大脑的复杂性和复杂性,神经退行性疾病建模具有挑战性。在阿尔茨海默氏病 (AD) 中,突触功能的逐渐丧失和神经元的死亡被认为是淀粉样蛋白β (A+) 肽在淀粉样蛋白前体异常处理后持续过度生产和积累的下游效应蛋白质(APP)根据淀粉样级联假说1。
为了了解这种淀粉样蛋白引起的病理机制,并有助于确定新的治疗靶点,科学家开发了各种体内临床前模型。一类模型利用博鲁斯将合成A+肽注射到大鼠大脑中2,3,4。这种模型的主要局限性是,它们依赖于单点或重复处理,在高浓度的A+肽沉积在一次。这与疾病5中A+释放的慢性、持续性质不一致。另一类体内模型是转基因动物模型,表达一个或多个基因突变与疾病6、7、8、9的家族变异有关。 10.然而,由于家族性AD只占所有阿尔茨海默氏症病例的不到5%,这些模型在人类中转化为零星的AD的相关性是值得怀疑的12。转基因方法的另一个缺点是从出生开始加速A+形成,这转化为认知功能缺陷和病理变化过快和积极,类似于患者零星AD的疾病进展12.例如,5x FAD 模型在 1.5 个月内产生斑块13。
有趣的是,这两个类别导致与AD研究2,3,4,5,6相关的认知功能的变化,有时它们伴随着疾病的病理特征的出现,如淀粉样斑块6,8,tau磷酸化6,7和/或突触和神经元损失7,9, 14.但是,虽然这些类型的模型可能让我们深入了解大脑中高浓度淀粉样蛋白的影响,这些淀粉样蛋白通常与 AD 的后期阶段相关,但它们未能反映早期的变化,以响应长期和持续接触 A_ 肽12,如突触标记15和细胞外基质16中分量的改变表达。因此,仍然需要创建一个慢性模型,更准确地说明持续A+分泌对体内认知的影响,并说明病理学的变化。
为此,我们开发了一个系统,通过固定水凝胶微珠中的淀粉样分泌细胞,从而以受控的方式持续分泌A+,随后可以植入成年大鼠大脑中,以模拟方面零星的AD。
藻酸盐是选定的生物材料,因为它是生物相容性,不会诱导任何不良反应时植入体内17。藻酸盐水凝胶中的细胞封装在过去四十年中已经建立得很好。其翻译到诊所的第一个例子被报告用于治疗1型糖尿病17。最早成功封装兰格汉岛的报告可追溯到1980年。移植含有胰岛素分泌细胞的微珠,彻底改变了糖尿病患者恢复胰腺功能的治疗方案,无需胰岛素注射治疗18。这些工作报告细胞封装如何保护它们免受外部应力,无论是机械或化学。事实上,藻酸珠作为屏障,将细胞从周围环境中分离,保持其表型,同时允许充分访问周围的介质以获得营养和清除细胞副产品19。此外,使用藻酸盐允许匹配软组织的机械特性20。藻酸盐水凝胶可以调整到1-30 kPa的刚度,通过简单地改变藻酸盐浓度和交联密度20,21。这是一个重要方面,不仅保持体外封装细胞的体型表达,而且避免在体内移植后产生任何炎症效应。
在此协议中,使用7PA2细胞——一种用人类APP V717F突变基因23稳稳转染的中国仓鼠卵巢细胞系。这些细胞不断产生APP的催化产物,包括A+1-4224,25,并已用于生成A+作为合成生产的替代品,在临床前,急性体内研究26。我们描述了一种在"软"藻酸盐微珠中固定7PA2细胞的制造方法,旨在允许生物分子持续分泌。作为概念的证明,我们报告A+1-42肽随时间的释放。使用的藻酸盐是一种低粘度藻酸盐,分子量为120,000-190,000克/摩尔,锰与古音比为1.56(M/G)。
在进一步的研究中,这些微珠可以安全地移植到与AD相关的大鼠大脑区域(例如海马区),以研究慢性A+分泌对体内行为和病理前体的影响。此外,该系统还可用于研究体外和体外慢性A+释放的影响。例如,含有7PA2的藻酸盐微珠可以在体外与神经元或天体化培养物共同培养,以评估慢性A+暴露对与AD相关的细胞机制的影响。此外,该方法还可用于检查慢性A+生产与外体电生理学长期强效之间的关系。
该协议的亮点是制造方法的模块化和灵活性,通过微调制造参数,使具有目标尺寸的藻酸盐珠成为可能。根据不同的应用,可以调整协议,以获得关于微珠大小、封装细胞密度和微珠刚度的定制目标。该协议可用于各种细胞类型的封装,开发更相关的三维(3D)体外模型,研究不同的病理。我们最近报道了如何使用藻酸盐封装细胞来模拟癌症进展20的早期阶段。
封装过程的概念基于通过喷嘴悬浮在藻酸盐溶液中的细胞层状喷射。振动头以受控的频率干扰喷射,从而产生大小相等的藻酸盐液滴。外部电场允许分离形成的藻酸盐基液滴,当与富在二价离子(如钙离子)中的溶液接触时,可以快速交叉链接,保持其球形。凝胶溶液中的孵育允许形成球形微珠,其中含有细胞的均质物理水凝胶27。微珠和藻酸水凝胶的目标大小允许长期(数周)与<s></s>细胞培养基交换营养和氧气。图 1A显示了所用封装装置的示意图(图 1B)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig1.jpg"> 图 1:封装系统。(A) 封装系统的原理表示。藻酸细胞悬浮液被加载到注射器 (2) 中,然后以注射器泵 (1) 处设定的挤出速度通过储液罐进料。在储液罐中,振动帽 (3) 以波形发生器 (4) 设置的频率振动,以相等的时间间隔中断流,形成大小相等的液滴。当溶液通过喷嘴 (5) 馈入并形成液滴时,在电压发生器 (6) 设置的电极 (7) 上施加静电电位,该电极对液滴表面稍有电荷,使流因排斥而扩散静电。当液滴与凝胶浴(8)啮合时,Ca2+驱动的藻酸盐交联会导致球形微珠的形成。(B) 在制造藻酸盐微珠之前封装器的照片。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
根据预期用途,可以更改微珠大小。为了控制微珠的大小,对图1A和协议中概述的各种参数进行了相应的调整。使用的喷嘴的内径对液滴的大小有重大影响;进一步调整封装参数,即挤出速度、振动频率和电压,是实现一致尺寸分布的关键。表1概述了不同的参数如何改变通过该系统实现的微珠的大小。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2">参数</td>
			<td>喷嘴尺寸</td>
			<td>振动频率</td>
			<td>流量</td>
			<td>电极电压</td>
		</tr>
<tr>
<td><img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg"></td>
			<td><img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg"></td>
			<td><img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg"></td>
			<td><img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg"></td>
		</tr>
<tr>
<td>珠子尺寸</td>
			<td>
<img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg"><img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg">
</td>
			<td><img alt="Image 2" src="/files/ftp_upload/59597/59597img02.jpg"></td>
			<td><img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg"></td>
			<td>–</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1:制造参数及其对微珠尺寸的影响。该表说明了每个参数如何影响所制造微珠的产生尺寸,而不管喷嘴和所用溶液的粘度如何。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:848px;" width="847">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">&#181;Manager software</td>
			<td style="width:261px;">Vale Lab, UCSF, USA</td>
			<td style="width:100px;">v.1.46</td>
			<td style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">0.22 um PES filter</td>
			<td style="width:261px;">Merck, UK</td>
			<td style="width:100px;">SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">15mm Netwell insert 74 um mesh filter</td>
			<td style="width:261px;">Constar, usa</td>
			<td style="width:100px;">#3477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Alginic acid sodium salt from brown algae</td>
			<td style="width:261px;">Sigma-Aldrich,uk</td>
			<td style="width:100px;">A0682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:261px;">Sigma-Aldrich,uk</td>
			<td style="width:100px;">C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:341px;">CellTiter96&#160; AQueous One Solution cell proliferation assay</td>
			<td style="width:261px;">Promega, USA</td>
			<td style="width:100px;">G3580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Encapsulator</td>
			<td style="width:261px;">Inotech</td>
			<td style="width:100px;">IE-50</td>
			<td>serial no. 05.002.01-2005</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">HEPES</td>
			<td style="width:261px;">Sigma-Aldrich,uk</td>
			<td style="width:100px;">H4024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Hu A&#946; 1-42 ELISA</td>
			<td style="width:261px;">ThermoFisher, UK</td>
			<td style="width:100px;">KHB3441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:261px;">ImageJ</td>
			<td style="width:100px;">v1.49p</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Inverted light microscope</td>
			<td style="width:261px;">Olympus</td>
			<td style="width:100px;">CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Leica microscope</td>
			<td style="width:261px;">Leica microsystems, UK</td>
			<td style="width:100px;">DMI6000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Neo sCMOS Camera</td>
			<td style="width:261px;">Ander, UK</td>
			<td align="right" style="width:100px;">5.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:261px;">Sigma-Aldrich,uk</td>
			<td style="width:100px;">D1408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:261px;">Sigma-Aldrich,uk</td>
			<td align="right" style="width:100px;">433209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Trispdium citrate dihydrate</td>
			<td style="width:261px;">Sigma-Aldrich,uk</td>
			<td style="width:100px;">W302600-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:261px;">Sigma-Aldrich,uk</td>
			<td style="width:100px;">T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of amyloid-&#946;-secreting alginate microbeads for use in modelling alzheimer's disease

根据淀粉样级联假说,阿尔茨海默氏病(AD)发展的最早诱因是有毒淀粉样蛋白-β(A+)片段的积累,最终导致该疾病的经典特征:淀粉样斑块,神经纤维纠结和突触和神经元损失。缺乏反映疾病进展的相关非转基因前模型是阻碍发现有效药物治疗的主要因素之一。为此,我们开发了一种用于制造含有淀粉样分泌细胞的藻酸盐微珠的规程,用于研究慢性A+生产的影响。
在这项研究中,使用了以前用人类APP基因转染的中国仓鼠卵巢细胞,分泌A+(即7PA2细胞)。通过封装在藻酸盐中的7PA2细胞,建立了持续释放A+的三维(3D)体外模型。该工艺经过优化,以500-600μm的珠直径为目标,用于进一步进行体内研究。对7PA2细胞封装在藻酸盐中进行了优化,改变了制造参数,如藻酸盐浓度、凝胶流速、静电电位、头部振动频率、凝胶溶液。随着时间的推移,对分泌A+的水平进行了分析,并比较了藻酸盐珠和标准细胞培养方法(高达96小时)。
发现1.5 x 106 7PA2细胞/mL的浓度和2%(w/v)的藻酸盐浓度与HEPES缓冲,随后在0.5M氯化钙中凝胶化5分钟,可制造最稳定的微珠。制造微珠是1)的均匀大小,2)平均直径为550μm,3)包含约100-150个细胞每个微珠和4)能够分泌A+。
总之,我们针对含有淀粉样蛋白7PA2细胞的稳定藻酸盐微珠的生成优化方法,可以生成AD在体外和体内的重要方面。

7PA2细胞成功封装在藻酸盐微珠中 制备后,使用该协议成功生成均匀的球形藻酸盐微珠。下图2A中的图像展示了更改其中一个参数(即电压)如何改变藻酸盐液滴流的流量和色散的示例。图 2B显示了在凝胶化过程后立即获得藻酸盐珠子的示例。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig2.jpg"> 图 2:制造方法优化。(A) 显示流色散变化的照片.(B) 明亮的场图像显示藻酸盐球形微珠在制造后立即。(C) 优化步骤示例:调整选定的制造参数,以达到目标微珠大小。选定的图形,以说明每个参数与产生的微珠的大小之间的关系(大小分布至少 n = 100 微珠)。请注意,喷嘴内部直径、喷射溶液的粘度和凝胶条件也会影响制造珠子的大小。错误栏代表 S.D.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
所述协议是灵活的,允许制造不同尺寸的基于藻酸盐的微珠,根据应用的不同成分变化。在图2C中,我们报告藻酸盐流速、电压和频率对微珠尺寸的影响,使用HEPES(pH 7.2)中挤出的2%(w/v)藻酸盐溶液,通过300μm喷嘴。
由于本研究的范围是生产可嵌入大鼠大脑中的微珠,我们调整了制造参数,以获得500-600μm范围内的平均微珠直径。出于质量控制目的,对该方法进行了优化,使人造珠子种群的变异性最小(即窄尺寸分布)。请注意,(1)生产的珠子可以使用配备20G针头的汉密尔顿注射器注射到大鼠大脑中;和(2)一个半球的老鼠大脑可以承载多达两个或三个这种大小的珠子。
优化后,将7PA2细胞封装在浓度为1.5 x 106的细胞/mL中悬浮在2%(w/v)藻酸溶液中,用HEPES缓冲并掉落在0.5M氯化钙凝胶浴中,产生所需的微珠。图 3下图显示了封装的7PA2细胞在标准细胞培养条件下一天后均匀地分布在微珠中。7PA2细胞增殖测试使用MTS测定根据制造商的协议。在7天期间,使用或不使用藻酸盐生长的7PA2细胞的行为无显著差异(图3B)。当在标准培养条件下孵育封装的细胞时,细胞有望在实验期间继续增殖,因此,如其他作品28所报道,细胞逃逸程度可能很小。这种影响可以通过封装在更小的细胞密度或降低孵化微珠的血清浓度来减轻。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig3.jpg"> 图 3:封装7PA2细胞。(A) 封装的7PA2细胞的明亮场图像,显示整个藻酸盐微珠的均匀细胞分布。制造参数设置为每个珠子获得 +150 7PA2 细胞。在7天的培养中,藻酸盐珠子没有显著变异。(B) 用藻酸盐孵育的7PA2细胞与未孵化无藻酸盐的细胞的总体增殖无差异。7PA2细胞在藻酸盐珠的体积上生长和迁移;血清浓度的降低可被认为能减缓细胞生长。错误栏代表 S.D.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
封装7PA2细胞的藻酸盐微珠随时间而稳定 为了研究获得藻酸盐微珠的大小和形状,在制造和凝胶化后进行了显微镜分析。使用所选方案获得的微珠的平均直径为550±2μm。
从理论上讲,550 μm 直径微珠中预期的细胞数量可以计算如下:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597eq1.jpg">
其中V = 体积和r = 半径。单个微珠的体积为 V = 8.8 x 10-5 mL;因此,每个微珠在封装时细胞数 = (1.5 × 106) x (8.8 x 10-5) = 130细胞。
在实验中,我们计算了制造后立即封装的细胞的数量。使用溶解混合物轻轻打乱藻珠,细胞被锥体蓝色溶液染色。使用血细胞计对细胞进行活力估计和计数;结果显示,每个微珠平均有116~17个活细胞(n = 5,数据未报告)。正如所料,在封装后立即观察到理论细胞计数和实验细胞计数的微小差异。对于某些应用,特别是要确定随时间而释放的 A+ 的数量,预测每个藻酸盐珠中封装的细胞数量非常重要。
有趣的是,封装过程对细胞的生存能力没有显著的影响。结果在先前的一项工作中报告,其中结肠直肠癌细胞(即HCT-116)使用类似的方法封装,与2D对照20相比,藻酸盐微珠的细胞存活性没有差异。
为了测量封装过程中使用的藻酸盐的稳定性,我们测量了14天周期(n = 100)的微珠直径。封装后14天的平均直径没有观察到的变化,与封装后立即变化(数据未报告)。
封装的 7PA2 细胞随着时间的推移释放 A+ 从 7PA2 细胞的 2D 和 3D 培养物分析的调节介质显示 A+1-42水平持续增加。细胞培养基每24小时采样一次,最多4天,并使用ELISA进行分析。我们的数据表明,从微珠(3D)中释放A+1-42的速率与从2D培养法中释放的相似(图4)。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig4.jpg"> 图 4:7PA2细胞的A+1-42分泌率。(A) 2D 和 3D 体外模型的 A+ 释放(4 天后归化百分比)具有类似的轮廓。两种模型均显示A+水平在四天内持续增加,并且,如预期的那样,没有达到稳定的浓度。(B) A+1-42浓度归化为初始细胞数,显示A+1-42随时间的相似分泌,无论培养方法如何。 藻酸盐的存在和封装过程(3D体外模型)都不会改变A+1-42的分泌。错误栏代表 S.D.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
封装7PA2单元的潜在应用 我们报告,封装在藻酸盐微珠中的7PA2细胞可以有效地用于A+1-42的持续释放,因此用于在任何临床前模型中测试慢性A+分泌的影响。在下面的图5中,我们展示了使用藻酸盐微珠的优点,这些微珠可以很容易地注射,并位于大鼠的大脑内。外体部分在这里用于说明目的,比较毫米藻酸盐珠与人造藻酸盐微珠。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig5.jpg"> 图 5:使用微珠进行相关的临床前应用。在大鼠大脑中植入的微珠必须足够小,才能嵌入,而不会造成太大的病变,以免对脑气肿造成损伤,并对正常大脑功能产生不利影响。图像 (A) 显示了毫米级珠和一微米级珠子并排之间的大小比较.(B) 在大脑中植入毫米级珠子,用于体内用途是行不通的。图 (C) 显示了使用该协议制造的微珠.其大小适合插入大鼠的海马体内,而不会对正常生理产生有害影响。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
上图强调了控制微珠大小的重要性。在这里,我们演示了使用直径在600μm以下的微珠的优点。这允许使用微创注射(例如,汉密尔顿注射器)更好地控制注射珠子在大脑内的位置。
总之,封装7PA2细胞可以控制微珠的大小、封装细胞的数量以及从微珠分泌的A+的预测(例如,浓度、释放特征)。控制微珠的大小至关重要,原因有二:1) 允许对释放的 A+ 的浓度进行微调控制,2) 允许在大鼠大脑的受控区域植入。这里获得的结果描述了藻酸盐微珠的方便调优,并强调了进一步研究的潜在应用。

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Fabrication of Amyloid-ÃƒÅ½Ã‚Â²-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease

制造淀粉样蛋白-β-分泌阿尔金酸微珠,用于模拟阿尔茨海默氏病

该协议说明了一种细胞封装方法,通过快速物理凝胶化藻酸盐来固定细胞。获得微珠允许随着时间的推移对淀粉样蛋白-α进行受控和持续分泌,并可用于研究在体外和体内的分泌淀粉样蛋白的影响。

According to the amyloid cascade hypothesis, the earliest trigger in the development of Alzheimer&#8217;s disease (AD) is the accumulation of toxic ...

该协议解释了微珠的制造，这将有助于控制释放率和淀粉样蛋白的含量，这是一种感兴趣的蛋白质。微珠将固定细胞在合适的生物材料，它会保护他们远离其周围环境，以及允许他们交换副产品和营养物质与周围的环境。使用这种技术封装细胞可确保严格控制微珠大小和细胞数，我们通过调整各种制造参数来做到这一点。因此，封装本协议中描述的细胞将给我们更多的淀粉样蛋白的慢性释放，用于体外和体内系统，这个想法是，这将让我们更好地了解疾病的机制，也使我们能够测试新的治疗方法。这种方法可用于制定控制系统，并研究许多细胞类型的任何生物分子的释放，无论是单独还是组合。首先，从培养箱中取出一个近汇的烧瓶。用0.25%的三辛-EDTA溶液治疗细胞，并在37C孵育5至10分钟，分离细胞。添加DMEM/F12介质后，将细胞收集到50毫升管中。以 1000 RPM 的速度将电池离心五分钟。去除上流剂，重新悬浮在 HEPES 缓冲盐水中的颗粒，使最终所需的细胞浓度翻倍。在50毫升离心管中，将该细胞悬浮液与4%的重量和体积藻酸盐溶液以一比一的比例混合，以获得含有2%重量和体积藻酸盐溶液所需细胞浓度的最终悬浮液。要设置封装参数，请将封装机的速度设置为最大挤出速度，然后设置电压和频率。为了制造微珠，在20毫升注射器中，加载5毫升的细胞-藻酸盐悬浮液，并附在封装器上。要启动封装器，请激活将细胞-藻酸盐悬浮液通过进纸器的流量，水滴流将挤出喷嘴。在废杯中收集第一毫升，以避免最初的不均匀流。然后继续运行剩余的四毫升，让液滴落入氯化钙凝胶浴。与凝胶浴接触后，液滴中的藻酸盐会立即与凝胶浴中的钙离子交叉连接，形成球形微珠。一分钟后，从磁性平台上取出凝胶烧杯，让微珠再休息四分钟，无需搅拌，即可在室温下完成凝胶。要取回微珠，首先使用一对无菌钳子清除任何大型藻酸盐碎屑或伪物。切割塑料移液器末端后，使用它将微珠从凝胶浴转移到 74 微米网状过滤器中，该过滤器被固定在废杯上。为了确保成功，我们总是切割塑料移液器的末端，以避免损坏微珠，我们这样做，每次我们转移珠子从一个容器到另一个容器后封装。在离心管上反转网状过滤器。将适当的培养基移掉，将珠子向下管中冲洗，并允许它们在该培养基中平衡五分钟。然后将它们转移到以前充满适当介质的烧瓶中，用于孵化和进一步实验。要评估封装和培养后细胞的可行性，添加溶解混合物以轻轻破坏微珠并释放封装的细胞。在细胞培养培养箱中孵育细胞，在37摄氏度下补充5%二氧化碳，10分钟，轻轻搅拌。通过用锥蓝染色和使用血细胞计室来估计这些细胞的细胞生存能力。要评估微珠稳定性，请使用显微镜和成像软件测量每个微珠群体样本的平均直径。经过制备，使用本协议成功生成均匀和球面藻酸盐微珠。在标准细胞培养条件下一天后，封装的7PA2细胞均匀分布于微珠中。当使用MTS测定测试7PA2细胞增殖时，在7天期间生长有或没有藻酸盐的7PA2细胞的行为没有显著差异。从 7PA2 细胞的 2D 和 3D 培养物分析的有条件介质显示，两种培养物中的淀粉样蛋白-1-42 水平持续增加。从微珠（或 3D 培养子）释放淀粉样蛋白-β 1-42 的速率与 2D 培养素释放的轮廓相似。封装在藻酸盐微珠中的7PA2细胞可有效用于淀粉样蛋白-β的持续释放。用于大鼠大脑的微珠必须足够小，才能嵌入而不产生大病变。将一毫米大小的珠子植入大脑供体内使用不起作用，而使用该协议制造的微珠具有合适的大小，可以插入大鼠的海马体内。为了确保我们最终产品中的细胞分布均匀，在细胞藻酸盐悬浮液中彻底混合细胞非常重要，这保证了每个微珠中淀粉样蛋白的均匀释放。

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Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Proteolytically Degraded Alginate Hydrogels and Hydrophobic Microbioreactors for Porcine Oocyte Encapsulation

蛋白酶降解藻酸盐水凝胶和疏水性微生物反应器，用于猪卵母细胞封装

In reproductive biology, the biotechnology revolution that began with artificial insemination and embryo transfer technology led to the development of ...