Name: fabrication of amyloid-&#946;-secreting alginate microbeads for use in modelling alzheimer's disease
Uploaded: 2019-07-06T12:30:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Amyloid-ÃŽÂ²-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke hr. kajen Suresparan, Dr. Jonathan Wubetu, hr. Dominik Grudzinski, Miss Chen Zhao og Dr. Thierry pilot for deres hjælp til optimering af alginat mikroperle fabrikation, cellekultur og Aβ-detektion og nyttige videnskabelige Diskussioner.

1. præparater
<ol><li>Forbered 100 mL af ~ 4% (w/v) alginat stamopløsning.<ol>
<li>Der afvejes 4,4 g alginatnatrium salt, og det tørre pulver tilsættes til 100 mL HEPES-bufferet saltvand (HBS, 20 mM HEPES (0,477 g) med 150 mM NaCl (0,877 g) i deioniseret væske, der tillader hydrering.</li>
		<li>Brug en magnetisk omrører ved ~ 500 omdrejninger pr. minut (rpm) og varme op til 50 °C for at give fuld alginat hydrering. Bemærk: alginat kan have brug for en eller to timer til at være helt hydreret. For at spare til tiden, kan alginat løsning gøres op en dag i forvejen af indkapsling protokol og opbevares ved 4 °c indtil den næste dag. Når alginat har været nedkølet, opvarmes den forsigtigt til 37 °C ved hjælp af et vandbad eller en kogeplade og omrystes med en magnet rører umiddelbart før brug.</li>
		<li>Steril Filter alginat opløsningen ved hjælp af et 0,22 μm pore polyethersulfonmembraner (PES) filter før brug. Filtrering anbefales ved 37 °C for at tillade nem strøm af alginat. Viskositeten vil stige, hvis temperaturen er tilladt at falde.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forbered 1.000 mL af 0,5 M CaCl2.<ol>
<li>Der afvejes 55,49 g vandfri CaCl2 og opløses i 1.000 ml HBS (20 mm hepes og 150 mm NaCl i 1.000 ml deioniseret vand).</li>
		<li>Steril filter ved hjælp af et 0,22 μm pore PES-filter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forbered 100 mL opløsningsblanding.<ol>
<li>Forbered en 100 mM HEPES (23,83 g) og 500 mM trinatrium citrat dihydrat (147,05 g) opløsning i fosfat-bufferet saltvand.</li>
		<li>Justér til pH 7,4 ved hjælp af NaOH eller HCl.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. opsætning af indkapsling system
<ol><li>Rengør laminar flow hætten.<ol>
<li>Steriliser laminar flow hætten, der indeholder indkapkleren, ved hjælp af UV-eksponering efterfulgt af sprøjtning med 70% v/v ethanol-opløsning.</li>
		<li>Indkapme systemet skylles med 10 mL 70% v/v ethanol-opløsning efterfulgt af 10 mL sterilt deioniseret vand.</li>
		<li>Fastgør 300 μm dysen, og Gentag trin 2.1.2.</li>
		<li>Spray flasken, der indeholder den filtrerede alginat opløsning, flasken indeholder filtreret calciumchloridopløsning og alle værktøjer, udstyr og tomme kultur plader, der vil blive brugt med 70% v/v ethanol opløsning og placere dem i laminar flow hætte. Før brug skal du tænde for et UV-lys igen i 30 minutter for at sterilisere grundigt.</li>
		<li>Forbered et affalds bæger fyldt med en desinficerings opløsning af biologisk kvalitet, og Anbring bægerglasset i hætten.</li>
		<li>Fyld et bægerglas med 100 mL steril CaCl2 (vandig) opløsning og tilsæt en magnetisk omrører. Indstil omrøringshastigheden til 100 rpm. Anbring bægerglasset på en magnetisk platform i en højde af 18 cm fra spidsen af dysen. Denne bæger vil blive brugt til at indsamle alginat perler og tillade deres gelation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forbered celler til indkapsling.<ol>
<li>Cellerne fjernes fra inkubator og løsnes fra den nær-confluent-kolbe med 0,25% trypsin-EDTA-opløsning og Inkubér ved 37 °C i 5-10 min.</li>
		<li>Isoler en prøve for at anslå celletætheden, og centrifuger derefter de resterende celler med 1.000 rpm i 5 minutter for at få en celle pellet.</li>
		<li>Resuspension af pellet i HBS (20 mM HEPES og 150 mM NaCl) at fordoble den endelige ønskede celle koncentration (f. eks, for en endelig koncentration af 1,5 x 106 celler/ml, resuspension cellerne i HBS at opnå en koncentration på 3 x 106 celler/ml).</li>
		<li>I et 50 mL centrifugeglas blandes cellesuspensionen i et 1:1-forhold med ~ 4% (w/v) alginat-opløsning for at opnå en endelig suspension med den ønskede celle koncentration (f. eks. 1,5 x 106 celler/ml) i en ~ 2% (w/v) alginat opløsning.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Angiv indkapsling parametrene.<ol>
<li>Indstil hastigheden på indkapsmaskinen til den maksimale ekstruderinghastighed (8,9 mL/min), spændingen til 1,0 kV og frekvensen til 5.500 Hz. Bemærk: disse parametre er tidligere optimeret til at opnå mikroperler på 550 μm i diameter.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. fabrikation
<ol><li>Fabrikere mikroperlerne.<ol>
<li>I en 20 mL sprøjte skal 5 mL af cellen alginat suspension belasttes, og der fastgøres en sprøjte til indkapkleren.</li>
		<li>Start indkapbleren ved at aktivere strømmen, som skubber cellen alginat suspension gennem feeder. En strøm af dråber vil blive ekstruderet gennem dysen.</li>
		<li>Saml de første 1 mL i affalds bægerglasset for at annullere den oprindelige ikke-ensartede strøm.</li>
		<li>Fortsæt med at køre de resterende 4 ml, så dråberne falder i CaCl2 gelering Bath. Hver milliliter kan køres separat (men successivt) og opsamles i fire forskellige gelering bade, hvis det kræves. Bemærk: ved kontakt med gelationsbadet vil alginatet i dråberne øjeblikkeligt krydse sammenhængen med calciumionerne i gelerings badet og danne sfæriske mikroperler.</li>
		<li>Efter et minut skal du fjerne gelations bægerglasset fra magnet platformen og lade mikroperlerne sidde i yderligere 4 minutter uden agitation (tid, der er nødvendigt for at tillade fuldstændig gelering på tværs af mikroperlerne ved stuetemperatur).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hent mikroperler.<ol>
<li>Fjern alle store alginat snavs eller artefakter ved hjælp af et par sterile pincet, og brug derefter en steril plastik pipette til at overføre til et 74 μm mesh-filter for at hente mikroperlerne fra gelationbadet.</li>
		<li>Mikroperlerne overføres til et centrifugeglas ved hjælp af det relevante dyrkningsmedium og giver mulighed for at ækvibrere i 5 minutter i cellekultur mediet.</li>
		<li>Overføres til en kolbe, plade eller Petri skål til inkubation og yderligere eksperimenter. Bemærk: Gelationbad må ikke genbruges.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. afprøvning og anvendelse af mikroperler
<ol><li>Test mikroperlens kvalitet.<ol>
<li>For at vurdere cellens levedygtighed (eller andre biologiske udlæsninger) efter indkapsling og kultur, skal du forsigtigt afbryde mikroperlerne for at frigøre de indkapslede celler ved hjælp af opløsnings blandingen. Bemærk: det påkrævede volumen af opløsnings blandingen afhænger af antallet af anvendte mikroperler pr. test. En foreslået ration er 4 mL opløsningsblanding til hver 1 mL indkapslede celler. Dette trin skal kun udføres på en enkelt prøve fro hver mikroperle population.</li>
		<li>Cellerne i en cellekultur inkubator suppleres med 5% CO2 ved 37 °c i 10 min.</li>
		<li>Estimere cellelevedygtighed for celler nu i opløsning som sædvanlig ved at farvnings celler med trypan og et blå og ved hjælp af et hemocytometer kammer. Bemærk: Hvis du bruger automatiserede celle tællere til estimater af cellernes levedygtighed, skal du være opmærksom på at undgå alginat-artefakter, der forstyrrer optællinger. I disse tilfælde tilrådes naual tælling af celler.</li>
		<li>For at vurdere mikroperlens stabilitet skal du måle den gennemsnitlige diameter for en prøve fra hver enkelt mikroperle population over et tidsforløb ved hjælp af et mikroskop og billedbehandlingssoftware. Dramatiske efterfølgende variationer i diameter kan være tegn på alginat nedbrydning.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Brug mikroperler til påvisning af udskillet Aβ.<ol>
<li>Prøve cellekultur medier fra 7PA2-celler, som dyrkes i standardbetingelser (2D) med 24 timers mellemrum og opbevares ved-20 °C for yderligere analyse.</li>
		<li>Prøve cellekultur medier fra indkapslede 7PA2-celler, som dyrkes i standardbetingelser (3D) med 24 timers intervaller og opbevares ved-20 °C for yderligere analyse.</li>
		<li>Detektér sekretionen af Aβ fra 7PA2-celler til indsamlede konditionerede medier ved enzym relateret immunosorbent assay (ELISA) (figur 4).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Brug mikroperlerne til yderligere undersøgelse i relevante applikationer. Bemærk: indkapslede 7PA2-celler kan anvendes til at vurdere virkningerne af vedvarende Aβ sekretion i nogen eller model.<ol>
<li>For mikroperle engraftment inden for rotte hippocampus i hjerner, generere 1 mm tykke koronale sektioner af rotte hjernen og bruge kirurgiske værktøjer til at indsætte mikroperler i det ønskede område (figur 5).</li>
		<li>Indkapme forskellige celletyper i alginat mikroperler efter de beskrevne protokoller til at vurdere den vedvarende frigivelse af biomolekyler af interesse. Relevante in vitro-og in vivo-systemer kan modelleret yderligere.</li>
		<li>Detektér ekspression af membranbundne markører for indkapslede celler ved hjælp af flowcytometri og/eller immunofluorescens. Bemærk: et eksempel på brugen af en lignende metode til fremstilling af mikroperler modellering tidlige stadier af tumor masse vækst og biomarkør udtryk er beskrevet af Rios 20.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hardy, J. A., Higgins, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease:+the+amyloid+cascade+hypothesis.">Alzheimer's disease: the amyloid cascade hypothesis.</a> Science. 256, 184-185 (1992).</li><li>Karthick, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-dependent+effect+of+oligomeric+amyloid-&#946;+(1-42)-induced+hippocampal+neurodegeneration+in+rat+model+of+Alzheimer's+disease.">Time-dependent effect of oligomeric amyloid-&#946; (1-42)-induced hippocampal neurodegeneration in rat model of Alzheimer's disease.</a> Neurological Research. 41 (2), 139-150 (2018).</li><li>Watremez, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilized+Low-n+Amyloid-&#946;+Oligomers+Induce+Robust+Novel+Object+Recognition+Deficits+Associated+with+Inflammatory,+Synaptic,+and+GABAergic+Dysfunction+in+the+Rat.">Stabilized Low-n Amyloid-&#946; Oligomers Induce Robust Novel Object Recognition Deficits Associated with Inflammatory, Synaptic, and GABAergic Dysfunction in the Rat.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 62 (1), 213-226 (2018).</li><li>Brouillette, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotoxicity+and+memory+deficits+induced+by+soluble+low-molecular-weight+amyloid-&#946;1-42+oligomers+are+revealed+in+vivo+by+using+a+novel+animal+model.">Neurotoxicity and memory deficits induced by soluble low-molecular-weight amyloid-&#946;1-42 oligomers are revealed in vivo by using a novel animal model.</a> Journal of Neurosciences. 32 (23), 7852-7861 (2012).</li><li>Solana, C., Tarazona, R., Solana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunosenescence+of+Natural+Killer+Cells,+Inflammation,+and+Alzheimer's+Disease.">Immunosenescence of Natural Killer Cells, Inflammation, and Alzheimer's Disease.</a> International Journal of Alzheimer's Disease. , 3128758 (2018).</li><li>Sturchler-Pierrat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+amyloid+precursor+protein+transgenic+mouse+models+with+Alzheimer+disease-like+pathology.">Two amyloid precursor protein transgenic mouse models with Alzheimer disease-like pathology.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (24), 13287-13292 (1997).</li><li>Tomiyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+amyloid+beta+oligomers:+their+contribution+to+synaptic+alteration,+abnormal+tau+phosphorylation,+glial+activation,+and+neuronal+loss+in+vivo.">A mouse model of amyloid beta oligomers: their contribution to synaptic alteration, abnormal tau phosphorylation, glial activation, and neuronal loss in vivo.</a> Journal of Neurosciences. 30 (14), 4845-4856 (2010).</li><li>Saito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+App+knock-in+mouse+models+of+Alzheimer's+disease.">Single App knock-in mouse models of Alzheimer's disease.</a> Nature Neurosciences. 17 (5), 661-663 (2014).</li><li>Oddo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple-Transgenic+Model+of+Alzheimer's+Disease+with+Plaques+and+Tangles:+Intracellular+A+and+Synaptic+Dysfunction.">Triple-Transgenic Model of Alzheimer's Disease with Plaques and Tangles: Intracellular A and Synaptic Dysfunction.</a> Neuron. 39 (3), 409-421 (2003).</li><li>Leon, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Transgenic+Rat+Model+with+a+Full+Alzheimer's-Like+Amyloid+Pathology+Displays+Pre-Plaque+Intracellular+Amyloid-&#946;-Associated+Cognitive+Impairment.">A Novel Transgenic Rat Model with a Full Alzheimer's-Like Amyloid Pathology Displays Pre-Plaque Intracellular Amyloid-&#946;-Associated Cognitive Impairment.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 20 (1), 113-126 (2010).</li><li>Prince, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dementia+UK:+Second+Edition+-+Overview.">Dementia UK: Second Edition - Overview.</a> Alzheimer's Society. , 61 (2007).</li><li>Cavanaugh, S. E., Pippin, J. J., Barnard, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+Alzheimer+disease:+historical+pitfalls+and+a+path+forward.">Animal models of Alzheimer disease: historical pitfalls and a path forward.</a> Alternatives to animal experimentation. 31 (3), 279-302 (2014).</li><li>Oakley, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraneuronal+&#946;-Amyloid+Aggregates,+Neurodegeneration,+and+Neuron+Loss+in+Transgenic+Mice+with+Five+Familial+Alzheimer's+Disease+Mutations:+Potential+Factors+in+Amyloid+Plaque+Formation.">Intraneuronal &#946;-Amyloid Aggregates, Neurodegeneration, and Neuron Loss in Transgenic Mice with Five Familial Alzheimer's Disease Mutations: Potential Factors in Amyloid Plaque Formation.</a> The Journal of Neuroscience. 26 (40), 10129-10140 (2006).</li><li>Forny-Germano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+Disease-Like+Pathology+Induced+by+Amyloid-&#946;+Oligomers+in+Nonhuman+Primates.">Alzheimer's Disease-Like Pathology Induced by Amyloid-&#946; Oligomers in Nonhuman Primates.</a> Journal of Neuroscience. 34 (41), 13629-13643 (2014).</li><li>Masliah, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+expression+of+synaptic+proteins+occurs+early+during+progression+of+Alzheimer's+disease.">Altered expression of synaptic proteins occurs early during progression of Alzheimer's disease.</a> Neurology. 56 (1), 127-129 (2001).</li><li>Lepelletier, F. X., Mann, D. M. A., Robinson, A. C., Pinteaux, E., Boutin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+changes+in+extracellular+matrix+in+Alzheimer's+disease.">Early changes in extracellular matrix in Alzheimer's disease.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (2), 167-182 (2017).</li><li>Calafiore, R., Basta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+application+of+microencapsulated+islets:+Actual+prospectives+on+progress+and+challenges.">Clinical application of microencapsulated islets: Actual prospectives on progress and challenges.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 67-68, 84-92 (2014).</li><li>Lim, F., Sun, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microencapsulated+islets+as+bioartificial+endocrine+pancreas.">Microencapsulated islets as bioartificial endocrine pancreas.</a> Science. 210 (4472), 908-910 (1980).</li><li>Tran, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+hydrogel+protects+encapsulated+hepatic+HuH-7+cells+against+hepatitis+C+virus+and+other+viral+infections.">Alginate hydrogel protects encapsulated hepatic HuH-7 cells against hepatitis C virus and other viral infections.</a> PLoS One. 9 (10), 109969 (2014).</li><li>Rios de la Rosa, J. M., Wubetu, J., Tirelli, N., Tirella, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorectal+tumor+3D+in+vitro+models:+advantages+of+biofabrication+for+the+recapitulation+of+early+stages+of+tumour+development.">Colorectal tumor 3D in vitro models: advantages of biofabrication for the recapitulation of early stages of tumour development.</a> Biomedical Physics &amp; Engineering Express. 4 (4), 045010 (2018).</li><li>Tirella, A., Orsini, A., Vozzi, G., Ahluwalia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+diagram+for+microfabrication+of+geometrically+controlled+hydrogel+scaffolds.">A phase diagram for microfabrication of geometrically controlled hydrogel scaffolds.</a> Biofabrication. 1 (4), 045002 (2009).</li><li>Smalley, K. S. M., Lioni, M., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+ins't+flat:+Taking+cancer+biology+to+the+next+dimension.">Life ins't flat: Taking cancer biology to the next dimension.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 42 (8-9), 242-247 (2006).</li><li>Podlisny, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation+of+secreted+amyloid+beta-protein+into+sodium+dodecyl+sulfate-stable+oligomers+in+cell+culture.">Aggregation of secreted amyloid beta-protein into sodium dodecyl sulfate-stable oligomers in cell culture.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (16), 9564-9570 (1995).</li><li>Portelius, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+characterization+of+amyloid-&#946;+species+in+the+7PA2+cell+model+of+Alzheimer's+disease.">Mass spectrometric characterization of amyloid-&#946; species in the 7PA2 cell model of Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 33 (1), 85-93 (2013).</li><li>Welzel, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secreted+amyloid+&#946;-proteins+in+a+cell+culture+model+include+N-terminally+extended+peptides+that+impair+synaptic+plasticity.">Secreted amyloid &#946;-proteins in a cell culture model include N-terminally extended peptides that impair synaptic plasticity.</a> Biochemistry. 53 (24), 3908-3921 (2014).</li><li>O'Hare, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orally+bioavailable+small+molecule+drug+protects+memory+in+Alzheimer's+disease+models.">Orally bioavailable small molecule drug protects memory in Alzheimer's disease models.</a> Neurobiology of Aging. 34 (4), 1116-1125 (2013).</li><li>Nedovi&#263;, V., Willaert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+Cell+Immobilisation+Biotechnology.">Fundamentals of Cell Immobilisation Biotechnology.</a> Methods and Technologies for Cell Immobilisation/Encapsulation. , 185-204 (2004).</li><li>Omer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+Normoglycemia+in+Rats+Receiving+Transplants+with+Encapsulated+Islets.">Long-term Normoglycemia in Rats Receiving Transplants with Encapsulated Islets.</a> Transplantation. 79 (1), 52-58 (2005).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Den metode, der er skitseret i denne artikel, er nyttig til indkapsningceller, der opnår en smal størrelsesfordeling af alginat-mikroperler27. Det giver også fordelen af voksende celler i et immuno-isoleret miljø17,19, beskytte dem mod ekstern stress. Desuden, indkapsling af celler i alginat nøjere efterligner fysiologiske forhold, specielt med hensyn til celle-til-celle interaktioner og matrix stivhed20. Disse faktorer er alle særligt afgørende for efterfølgende anvendelse i relevante anvendelser, såsom in vivo engraftment, der udelukker potentielle immunreaktioner i det omgivende væv17. Desuden er en stor fordel ved denne protokol den nemme mulighed for at tilpasse sig efter anvendelse af renter: det er muligt at ændre protokollen og optimere parametrene for fabrikation af større eller mindre, og blødere eller stivere perler. Den beskrevne metode bruges til at fremstille perler, der er små nok til at blive injiceret med minimalt invasive metoder, og tilstrækkeligt store nok til at være vært for en række celler og give en tilstrækkelig frigivelse af Aβ til at resultere i observerbare adfærdsmæssige og patologiske virkninger ved injektion i dyremodeller.
Succesen med denne protokol afhænger af en række kritiske trin. Omhyggelig celle håndtering og optimale celledyrkning teknikker er vigtige for at opretholde cellernes levedygtighed og funktion20,28. Ved hjælp af standard dyrkningsbetingelser sikrer bevarelsen af normal funktion af 7PA2 celler, som observeret. Dette tillader en lignende Release profil for Aβ1-42 fra indkapslede celler sammenlignet med 2D kulturer. For at protokollen skal fungere optimalt, garanterer en alginat-opløsning med lav viskositet desuden bedre resultater sammenlignet med en alginat-opløsning med høj viskositet. Dette sikrer, at en homogen laminar jet ekstruderes gennem dysen og en jævn fordeling af celler inden for matrixen af de fremstillede perler27. Materialer, der anvendes til indkapsling af celler skal have en meget hurtig gelering mekanisme, tillader fastholdelse af form.
Et andet kritisk skridt i denne protokol er håndteringen af fabrikerede mikroperler efter gelering. Her viser vi hentning af mikroperler ved hjælp af en stor blænde plastik pipette til at overføre perlerne. Alternativt kan hælde calciumchloridopløsningen, der indeholder mikroperlerne i et mesh-filter, bruges til perle udtagning. En stor (5, 10 eller 25 mL) serologisk pipette kan bruges til at tegne mikroperlerne og derefter vaskes gennem maske filteret i stedet for at hælde. Fordelen ved dette er en højere tillid til steriliteten af proceduren i forhold til hælde. Men af begrænsningerne er, at nogle perler kan blive forvrænget, hvis de komprimeres af pipetten, ud over at risikere et lavere udbytte, hvis en stor del af mikroperler ikke er reddet.
Denne fremgangsmåde er blevet brugt til at indkapslede forskellige cellelinjer til model og studere forskellige sygdomme (f. eks. frigivelse af insulin fra indkapslet Pankreatisk ø). Det nye ved vores tilgang er engraftment af mikroperlerne genereret ved hjælp af denne protokol som en nyttig metode i modellering vigtige aspekter af Alzheimers sygdom in vivo. Ved sammenligning af udgivelsesprofilen for Aβ fra indkapslede celler (figur 4) til niveauerne af Aβ genereret ved en bolt indsprøjtning (som den, der er indberettet i andre undersøgelser3,26), kan en mere kronisk og vedvarende frigivelse af Aβ Forventede. Figur 6 illustrerer den forventede tendens, der kan opnås. Ved hjælp af dette system til in vivo modellering er mere relevant for den måde, sygdommen skrider frem, og kan være mere nyttigt i narkotika opdagelse og udvikling.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig6.jpg"> Figur 6 : Forventet frigivelses profil for Aβ1-42 fra INDKAPSLEDE 7pa2-celler sammenlignet med en Profilen af Aβ frigivelse fra engrafted 7PA2-holdige mikroperler tillader afprøvning af virkningerne af kronisk og vedvarende Aβ i en dyremodel af relevans for AD. Omvendt ville en bolt indsprøjtning skabe en stigning i Aβ niveauer over en kort periode, efterfulgt af en hurtig clearance af Aβ fra hjernen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig6large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Modellering neurodegenerative sygdomme er udfordrende på grund af den komplekse og indviklede karakter af hjernen. I Alzheimers sygdom (AD), det progressive tab af synaptisk funktion og død af neuroner menes at være en downstream effekt af vedvarende overproduktion og ophobning af amyloid beta (Aβ) peptider efter unormal behandling af amyloid forløber protein (APP) i henhold til amyloid Cascade hypotese1.
For at forstå mekanismerne i denne amyloid-induceret patologi og for at hjælpe med at identificere nye behandlingsmål har forskerne udviklet forskellige in vivo prækliniske modeller. En kategori af modeller anvender en bolt injektion af et syntetisk Aβ peptid i rotte hjernen2,3,4. Den vigtigste begrænsning af sådanne modeller er, at de er afhængige af en enkelt-punkt eller gentagne behandlinger med Aβ peptider i høje koncentrationer deponeret alle på én go. Dette er uforeneligt med den kroniske, vedvarende karakter af frigivelsen af Aβ i sygdom5. En anden kategori af in vivo-modeller er transgene dyremodeller, der udtrykker en eller flere genetiske mutationer i forbindelse med sygdommens familiale variationer6,7,8,9, 10. da familial annonce dog kun tegner sig for mindre end 5% af alle Alzheimers tilfælde11, er relevansen af disse modeller i at oversætte til sporadisk annonce hos mennesker tvivlsom12. En anden ulempe ved den transgene tilgang er den accelererede Aβ dannelse fra fødslen, hvilket udmønter sig i underskud i kognitiv funktion og patologiske ændringer for hurtigt og aggressivt at ligne sygdomsprogression i sporadiske AD hos patienter12 . For eksempel, 5x FAD model producerer plaques i så lidt som 1,5 måneder13.
Interessant, begge disse kategorier resulterer i ændringer i kognitiv funktion af relevans for ad forskning2,3,4,5,6, og nogle gange er de ledsaget af fremkomsten af patologiske kendetegn af sygdommen, såsom amyloid plaques6,8, Tau fosforylering6,7 og/eller synaptisk og neuronal tab7,9, 14. Men mens disse typer af modeller kan give os et indblik i virkningerne af høje niveauer af amyloid i hjernen, som ofte er forbundet med senere stadier af AD, de undlader at afspejle de tidligere ændringer udstillet som reaktion på den kroniske og vedvarende eksponering for Aβ peptid12, såsom ændret ekspression af synaptiske markører15 og komponenter i den ekstracellulære matrix16. Derfor er der stadig et behov for at skabe en kronisk model, der mere præcist illustrerer virkningerne af vedvarende Aβ sekretion på in vivo kognition og illustrerer ændringer i patologi.
Til dette formål har vi udviklet et system, der tillader konstant, vedvarende sekretion af Aβ på en kontrolleret måde ved at immobilisere amyloid-udskilning af celler inden for hydrogel-mikroperlerne, som efterfølgende kan implanteres i den voksne rotte hjerne for at modellere aspekter af sporadisk annonce.
Alginat var det udvalgte biomateriale, da det er biokompatibelt og ikke inducerer nogen bivirkninger, når det implanteres i vivo17. Celle indkapsling i alginat silicagelrogeler er blevet veletableret i løbet af de sidste fire årtier. Det første eksempel på dets oversættelse til klinikken blev rapporteret til behandling af type 1 diabetes mellitus17. Den tidligste rapport om vellykket indkapsling af Holme af Langerhans stammer tilbage til 1980. Transplantation af mikroperler indeholdende insulin-udskilning celler revolutionerede behandlingsmuligheder for diabetiske patienter, da det restaureret pancreas funktion, eliminerer behovet for insulin injektion terapi18. Disse værker rapporterer om, hvordan celle indkapsling kan beskytte dem mod ydre belastninger, uanset om de er mekaniske eller kemiske. Faktisk, alginat perler fungere som en barriere og isolere celler fra det omgivende miljø bevare deres fænotype, samtidig give tilstrækkelig adgang til de omgivende medier for næringsstoffer og clearance af cellulære biprodukter19. Desuden, brugen af alginat tillader matching af mekaniske egenskaber af blødt væv20. Alginat silicagelrogeler kan indstilles til at have en stivhed på 1-30 kPa, ved blot varierende alginat koncentration og Cross-Linking tæthed20,21. Dette er et væsentligt aspekt, ikke kun for at opretholde det fænotypiske udtryk for indkapslede celler in vitro, men også for at undgå eventuelle inflammatoriske virkninger efter engraftment in vivo22.
I denne protokol, 7pa2 celler-en kinesisk hamster ovarie cellelinje, der er stabilt transficeret med en menneskelig app V717F muteret gen23 -anvendes. Disse celler producerer kontinuerligt katalytiske produkter af app, herunder Aβ1-4224,25, og er blevet brugt til at generere Aβ som et alternativ til syntetisk produktion i prækliniske, akutte in vivo-studier26. Vi beskriver en fabrikationsmetode til immobilisering af 7PA2-celler inden for "bløde" alginat-mikroperler, der er designet til at tillade vedvarende sekretion af biomolekyler. Som et bevis på koncept, rapporterer vi om frigivelsen af Aβ1-42 peptid over tid. Det alginat, der anvendes, er en alginat med lav viskositet med en molekylvægt på 120000-190000 g/mol og et mannuronært til guluronisk forhold på 1,56 (M/G).
I yderligere undersøgelser kan disse mikroperler sikkert transplanteres i områder af rotte hjernen af relevans for AD (f. eks hippocampus) at studere virkningerne af kronisk Aβ sekretion på adfærd in vivo og patologi ex vivo. Desuden kan dette system anvendes til at undersøge virkningerne af kronisk Aβ-frigivelse i in vitro-og ex vivo-applikationer. For eksempel, 7PA2-holdige alginat mikroperler kan være co-dyrket in vitro med neuronal eller astrocytiske kulturer til at vurdere virkningerne af kronisk Aβ eksponering på cellulære mekanismer forbundet med AD. Desuden kan denne metode anvendes til at undersøge forholdet mellem kronisk Aβ produktion og langsigtede potensering i ex vivo Elektrofysiologi.
Højdepunktet i denne protokol er fremstillings metodens modularitet og fleksibilitet, som gør det muligt at fremstilling af alginat perler med en måldimension ved finjustering af fabrikations parametrene. Afhængigt af applikationen kan protokollen justeres for at opnå skræddersyede mål med hensyn til mikrovulst størrelse, tæthed af de indkapslede celler og mikrovulst stivhed. Denne protokol kan bruges til indkapsling af en række forskellige celletyper, udvikle mere relevante tredimensionelle (3D) in vitro-modeller til at studere forskellige patologier. Vi rapporterede for nylig om, hvordan alginat-indkapslede celler kan bruges til at modellere tidlige stadier af kræft progression20.
Konceptet med indkapsling proces er baseret på ekstrudering af en laminar stråle af celler suspenderet i alginat opløsning gennem en dyse. Et vibrerende hoved forstyrrer strålen med en kontrolleret frekvens, der resulterer i lige store alginat-baserede dråber. En ekstern elektrisk felt tillader adskillelse af de dannede alginat-baserede dråber, som ved kontakt med en opløsning beriget i Divalente ioner, såsom calcium ioner, kan hurtigt kryds-link, bevare deres sfæriske form. Inkubation i gelations opløsningen giver mulighed for dannelse af sfæriske mikroperler, der indeholder celler inden for en homogen fysisk hydrogel27. Target størrelse af mikroperler og alginat silicagelrogeler tillader næringsstoffer<s>s</s> og ilt udveksling med cellekultur medier i lange perioder (uger). Figur 1 A viser en skematisk gengivelse af det anvendte indkapsling apparat (figur 1B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig1.jpg"> Figur 1 : Indkapsling system. (A) skematisk gengivelse af indkapsling systemet. En alginat-cellesuspension indlæses i en sprøjte (2) og fodres gennem et reservoir ved en ekstruderinghastighed indstillet ved sprøjtepumpe (1). I reservoiret vibrerer en vibrations hat (3) med en frekvens, der er indstillet af en bølgeform generator (4) for at forstyrre strømmen med lige store intervaller, der danner samme størrelse dråber. Da opløsningen fodres gennem en dyse (5), og der dannes dråber, påføres et elektrostatisk potentiale på tværs af en elektrode (7), som indstilles af en spændings generator (6), som let oplader overfladen af dråberne, så strømmen kan spredes som følge af frastøde elektrostatiske kræfter. Som dråber engagere sig med gelering bad (8), ca2 +-drevet Cross-Linking af alginat resultater i dannelsen af sfæriske mikroperler. B) fotografi af indkapmen før fremstilling af alginat-mikroperler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Mikroperlens størrelse kan ændres afhængigt af den tilsigtede anvendelse. For at kontrollere størrelsen af mikroperlen justeres de forskellige parametre, der er skitseret i figur 1A og i protokollen, tilsvarende. Den indvendige diameter af den anvendte dyse har en væsentlig indvirkning på størrelsen af dråberne; yderligere justering af indkapsling parametre, nemlig ekstrudering hastighed, vibration frekvens og spænding, er nøglen til at opnå en ensartet størrelsesfordeling. Tabel 1 skitserer, hvordan de forskellige parametre kan ændre størrelsen af mikroperler opnået med dette system.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2">Parameter</td>
			<td>Dyse størrelse</td>
			<td>Vibrationsfrekvens</td>
			<td>Strømningshastighed</td>
			<td>Elektrode spænding</td>
		</tr>
<tr>
<td><img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg"></td>
			<td><img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg"></td>
			<td><img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg"></td>
			<td><img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg"></td>
		</tr>
<tr>
<td>Perle størrelse</td>
			<td>
<img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg"><img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg">
</td>
			<td><img alt="Image 2" src="/files/ftp_upload/59597/59597img02.jpg"></td>
			<td><img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg"></td>
			<td>–</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Fabrikations parametre og deres indflydelse på mikroperlens størrelse. Tabellen illustrerer, hvordan hver parameter kan påvirke den resulterende størrelse af fremstillede mikroperler, uanset dysen og viskositeten af den anvendte opløsning.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:848px;" width="847">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">&#181;Manager software</td>
			<td style="width:261px;">Vale Lab, UCSF, USA</td>
			<td style="width:100px;">v.1.46</td>
			<td style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">0.22 um PES filter</td>
			<td style="width:261px;">Merck, UK</td>
			<td style="width:100px;">SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">15mm Netwell insert 74 um mesh filter</td>
			<td style="width:261px;">Constar, usa</td>
			<td style="width:100px;">#3477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Alginic acid sodium salt from brown algae</td>
			<td style="width:261px;">Sigma-Aldrich,uk</td>
			<td style="width:100px;">A0682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:261px;">Sigma-Aldrich,uk</td>
			<td style="width:100px;">C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:341px;">CellTiter96&#160; AQueous One Solution cell proliferation assay</td>
			<td style="width:261px;">Promega, USA</td>
			<td style="width:100px;">G3580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Encapsulator</td>
			<td style="width:261px;">Inotech</td>
			<td style="width:100px;">IE-50</td>
			<td>serial no. 05.002.01-2005</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">HEPES</td>
			<td style="width:261px;">Sigma-Aldrich,uk</td>
			<td style="width:100px;">H4024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Hu A&#946; 1-42 ELISA</td>
			<td style="width:261px;">ThermoFisher, UK</td>
			<td style="width:100px;">KHB3441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:261px;">ImageJ</td>
			<td style="width:100px;">v1.49p</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Inverted light microscope</td>
			<td style="width:261px;">Olympus</td>
			<td style="width:100px;">CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Leica microscope</td>
			<td style="width:261px;">Leica microsystems, UK</td>
			<td style="width:100px;">DMI6000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Neo sCMOS Camera</td>
			<td style="width:261px;">Ander, UK</td>
			<td align="right" style="width:100px;">5.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:261px;">Sigma-Aldrich,uk</td>
			<td style="width:100px;">D1408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:261px;">Sigma-Aldrich,uk</td>
			<td align="right" style="width:100px;">433209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Trispdium citrate dihydrate</td>
			<td style="width:261px;">Sigma-Aldrich,uk</td>
			<td style="width:100px;">W302600-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:261px;">Sigma-Aldrich,uk</td>
			<td style="width:100px;">T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of amyloid-&#946;-secreting alginate microbeads for use in modelling alzheimer's disease

Ifølge amyloid Cascade hypotese, den tidligste udløsende faktor i udviklingen af Alzheimers sygdom (AD) er ophobning af giftige amyloid-β (Aβ) fragmenter, i sidste ende fører til de klassiske egenskaber af sygdommen: amyloid plaques, neurofibrillære tangles og synaptisk og neuronal tab. Manglen på relevante ikke-transgene prækliniske modeller, der afspejler sygdomsprogression, er en af de vigtigste faktorer, der hindrer opdagelsen af effektive lægemiddelbehandlinger. Med henblik herpå har vi udviklet en protokol til fremstilling af alginat-mikroperler, der indeholder amyloid-udskilnings celler, som er nyttige til undersøgelse af virkningerne af kronisk Aβ-produktion.
Ovarieceller fra kinesisk hamster, der tidligere var transficeret med et humant APP-gen, som udskilning Aβ (dvs. 7PA2 celler), blev anvendt i dette studie. En tredimensionel (3D) in vitro model for vedvarende frigivelse af Aβ blev fremstillet ved indkapsling af 7PA2 celler i alginat. Processen blev optimeret til at målrette en perle diameter på 500-600 μm for yderligere in vivo undersøgelser. Optimering af 7pa2 celle indkapsling i alginat blev udført ændre fabrikations parametre, fx alginat koncentration, gel flow rate, elektrostatisk potentiale, hoved vibrationsfrekvens, gelerings løsning. Niveauer af udskilt Aβ blev analyseret over tid og sammenlignet mellem alginat perler og standard cellekultur metoder (op til 96 h).
En koncentration på 1,5 x 106 7pa2 celler/ml og en alginatkoncentration på 2% (w/v) bufferet med Hepes og efterfølgende gelering i 0,5 M calciumchlorid i 5 min blev fundet for at fremstille de mest stabile mikroperler. Fremstillede mikroperler var 1) af ensartet størrelse, 2) med en gennemsnitlig diameter på 550 μm, 3) indeholdende omkring 100-150 celler pr. mikroperle og 4) i stand til at udskilte Aβ.
Afslutningsvis, vores optimerede metode til produktion af stabile alginat mikroperler indeholdende amyloid-producerende 7PA2 celler kan gøre det muligt modellering af vigtige aspekter af AD både in vitro og in vivo.

7PA2 celler er med succes indkapslet i alginat mikroperler Efter tilberedning genereres ensartede og sfæriske alginat-mikroperler med succes ved hjælp af denne protokol. Billederne i figur 2A nedenfor viser et eksempel på, hvordan ændring af en af parametrene (dvs. spænding) ændrer strømmen og spredningen af alginat dråber strøm. Figur 2 B viser et eksempel på fremstillet alginat perler umiddelbart efter gelering processen.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig2.jpg"> Figur 2 : Fabrikation metode optimering. A) fotografier,derviser ændringer i strøm spredningen. (B) lyse felt billede, der viser alginat sfæriske mikroperler umiddelbart efter fremstilling. (C) eksempel på optimering trin: tuning udvalgte fabrikations parametre for at opnå målet mikroperle størrelse. Valgte grafer til at illustrere forholdet mellem hver parameter og størrelsen af de resulterende mikroperler (størrelsesfordeling fra mindst n = 100 mikroperler). Bemærk, at dysens indvendige diameter, viskositeten af udslyngnings opløsningen og gelerings forholdene også kan påvirke størrelsen af fabrikerede perler. Fejllinjer repræsenterer S.D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig2large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Den beskrevne protokol er fleksibel og gør det muligt at fremstilling af forskellige størrelser af alginat-baserede mikroperler, varierende i sammensætning i henhold til ansøgningen. I figur 2Crapporterer vi indflydelsen af alginat strømningshastighed, spænding og frekvens på mikroperlens størrelse ved hjælp af en 2% (w/v) alginat opløsning i Hepes (pH 7,2) ekstruderet gennem en 300 μm dyse.
Da omfanget af denne undersøgelse var at producere mikroperler, der kan indlejres i rotte hjernen, vi justeret fabrikations parametrene for at opnå en gennemsnitlig mikroperle diameter i intervallet 500-600 μm. Til kvalitetskontrol formål blev metoden optimeret til at have minimal variation på tværs af populationen af fabrikerede perler (dvs. smal størrelsesfordeling). Bemærk venligst, at (1) producerede perler kan injiceres i rotte hjernen ved hjælp af en Hamilton sprøjte udstyret med en 20G nål; og (2) en halvkugle af rotte hjernen kan rumme op til to eller tre perler af denne størrelse.
Efter optimering, indkapsling 7pa2 celler i en koncentration på 1,5 x 106 celler/ml suspenderet i en 2% (w/v) alginat opløsning Buffered med Hepes og faldt i en 0,5 M calciumchlorid gelering bad gav de ønskede mikroperler. Figur 3 A nedenfor viser indkapslede 7PA2 celler jævnt fordelt i mikroperler efter en dag i standard cellekultur betingelser. 7PA2 celle proliferation blev testet ved hjælp af en MTS-analyse som pr. producentens protokol. Der var ingen signifikant forskel mellem adfærden af 7PA2-celler dyrket med eller uden alginat over en periode på syv dage (figur 3B). Ved inkupering af indkapslede celler i standard dyrkningsbetingelser forventes cellerne at fortsætte med at formere sig i løbet af eksperimentets varighed, og små grader af celle flugt kan forventes som følge heraf, som rapporteret i andre værker28. Virkningerne af dette kan afhjælpes ved indkapslede ved en mindre celletæthed eller reducere serumkoncentrationen, hvor mikroperler inkuberet.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig3.jpg"> Figur 3 : Indkapslede 7PA2-celler. (A) lyse felt billede af indkapslede 7PA2-celler, der viser lige celle fordeling i hele alginat-mikroperlen. Fabrikations parametre blev indstillet til at opnå ~ 150 7PA2 celler pr. perle. Der blev ikke observeret nogen signifikant variation i alginatperler over 7 dages kultur. B) der var ingen observeret forskel mellem den samlede spredning af 7PA2-celler inkuberet med alginat versus celler inkuberet uden alginat. 7PA2 celler vokser og migrerer på tværs af mængden af alginat perler; reduktion af serumkoncentrationen kan anses for at bremse cellevækst. Fejllinjer repræsenterer S.D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig3large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Alginate mikroperler indkapmende 7PA2 celler er stabile over tid For at undersøge størrelsen og formen af opnåede alginat mikroperler, blev mikroskop analyse udført efter fabrikation og gelation. Den gennemsnitlige diameter for de mikroperler, der opnås ved hjælp af den valgte protokol, er 550 ± 2 μm.
Teoretisk set kan antallet af celler, der forventes i en 550 μm-diameter mikroperle, beregnes på følgende måde:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597eq1.jpg">
hvor V = lydstyrke og r = radius. Volumenet af en enkelt mikroperle er V = 8,8 x 10-5 ml; Derfor er antallet af celler pr. mikroperle på tidspunktet for indkapsling = (1,5 × 106) x (8,8 x 10-5) ≈ 130 celler.
Eksperimentelt, vi tælles antallet af indkapslede celler umiddelbart efter fabrikation. Alginate perler blev forsigtigt forstyrret ved hjælp af opløsningen mix og celler blev plettet med trypan og et blå opløsning. Levedygtighed skøn og tælling af celler blev udført ved hjælp af en hemocytometer; opnåede resultater viste et gennemsnit på 116 ± 17 levende celler pr. mikroperle (n = 5, data ikke indberettet). Som forventet blev der observeret en mindre forskel mellem teoretisk og eksperimentel celletælling umiddelbart efter indkapsling. For nogle applikationer, og især for at bestemme mængden af frigivet Aβ over tid, er det vigtigt at forudsige antallet af celler indkapslet i hver alginat perle.
Interessant, indkapsling proces har ikke en betydelig indvirkning på cellernes levedygtighed. Resultaterne er rapporteret i et tidligere arbejde, hvor kolorektal cancerceller (dvs., HCT-116) blev indkapslet ved hjælp af en lignende metode, uden forskelle i cellernes levedygtighed i alginat mikroperler sammenlignet med 2D kontrol20.
For at måle stabiliteten af den alginat, der anvendes i indkapsling processen, målte vi mikroperler diametre over en 14-dages periode (n = 100). Der var ingen observerede ændringer i den gennemsnitlige diameter 14 dage efter indkapsling sammenlignet med umiddelbart efter indkapsling (data ikke indberettet).
Indkapslede 7PA2-celler frigivelse Aβ over tid Konditionerede medier analyseret fra 2D-og 3D-kulturer af 7PA2-celler afslører en konstant stigning i Aβ1-42 niveauer. Cellekultur medier blev udtaget hver 24 h, og op til fire dage, og analyseret ved hjælp af ELISA. Vores data viser, at frigivelsen af Aβ1-42 fra Mikroperler (3D) er den samme profil som den, der frigives fra 2D-kulturen (figur 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig4.jpg"> Figur 4 : Rate af Aβ1-42 sekretion fra 7pa2-celler. (A) Aβ frigivelse (% normaliseret efter 4 dage) fra 2D og 3D in vitro-modeller har en lignende profil. Begge modeller viser en konstant stigning i Aβ-niveauerne i løbet af de fire dage, og som forventet opnås der ikke en stabil koncentration. B) koncentrationen af aβ1-42 normaliseret til det oprindelige celle nummer, der viser en tilsvarende sekretion af Aβ1-42 over tid, uanset dyrkningsmetoderne. Hverken tilstedeværelsen af alginat eller processen med indkapsling (3D in vitro-model) ændre udskillelsen af Aβ1-42. Fejllinjer repræsenterer S.D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig4large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Potentiel anvendelse af indkapslede 7PA2-celler Vi rapporterer, at 7PA2 celler indkapslet i alginat mikroperler kan anvendes effektivt til vedvarende frigivelse af Aβ1-42, og dermed bruges til at teste effekten af kronisk Aβ sekretion i enhver præklinisk model. I figur 5 nedenfor, viser vi fordelene ved at bruge alginat mikroperler, der let kan injiceres og placeret i hjernen hos en rotte. Ex vivo sektioner er her bruges til illustration formål, sammenligne en millimeter alginat perle versus fabrikerede alginat mikroperler.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig5.jpg"> Figur 5 : Brug af mikroperler til relevante prækliniske anvendelser. Mikroperler til engraftment i rotte hjernen skal være lille nok til at være indlejret uden at skabe en læsion for stor til at undgå skader på hjernen parenkym og negativt påvirker normal hjernefunktion. Billede (A) viser en Størrelsessammenligning mellem en millimeter-skaleret perle og en mikrometer-skaleret perle side om side. B) implantering af en millimeter-skaleret perle i hjernen til in vivo formål ville ikke virke. Billede (C) viser en mikroperle, der er fabrikeret ved hjælp af denne protokol. Størrelsen er egnet til indsættelse i hippocampus af rotten uden at have en skadelig virkning på normal fysiologi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Billederne ovenfor fremhæver vigtigheden af at kontrollere størrelsen af mikroperlen for sådanne undersøgelser. Her viser vi fordelen ved at bruge mikroperler af diametre under 600 μm. Dette tillader brug af minimalt invasiv injektion (f. eks. Hamilton sprøjte) for bedre at kontrollere placeringen af injicerede perler i hjernen.
Sammenfattende giver indkapslede 7PA2-celler kontrol over størrelsen af mikroperler, antal indkapslet celler og forudsigelse af Aβ udskilles fra mikroperlerne (f. eks. koncentration, frigivelses profil). Kontrol af størrelsen af mikroperlerne er afgørende af to grunde: 1) at tillade finjusteret kontrol over koncentrationen af frigivet Aβ, og 2) at tillade implantation i et kontrolleret område af rotte hjernen. De opnåede resultater her beskriver facile tuning af alginat mikroperler og fremhæve potentielle anvendelser for yderligere undersøgelser.

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Amyloid-ÃŽÂ²-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease at JoVE.com

Fabrication of Amyloid-ÃƒÅ½Ã‚Â²-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease

Fremstilling af amyloid-β-udskilning af Alginat-Mikroperler til brug ved modellering af Alzheimers sygdom

Denne protokol illustrerer en celle indkapsling metode ved hurtig fysisk gelering af alginat at immobilisere celler. Opnåede mikroperler tillader kontrolleret og vedvarende sekretion af amyloid-β over tid og kan anvendes til at studere virkningerne af udskillet amyloid-β i in vitro-og in vivo-modeller.

According to the amyloid cascade hypothesis, the earliest trigger in the development of Alzheimer&#8217;s disease (AD) is the accumulation of toxic ...

Denne protokol forklarer fremstilling af mikroperler, som vil blive brugt til at hjælpe med at kontrollere frigivelseshastigheden og mængden af amyloid, som er et protein af interesse. Mikroperler vil immobilisere celler i et passende biomateriale, og det vil beskytte dem fra deres omgivende miljø, samt give dem mulighed for at udveksle biprodukter og næringsstoffer med deres omgivende miljø. Indkapsling af celler ved hjælp af denne teknik sikrer stram kontrol af mikroperlestørrelse samt cellenummer, og vi gør dette ved at justere forskellige fabrikationsparametre.Så indkapsle de celler, der er beskrevet i denne protokol vil give os mere af en kronisk frigivelse af amyloid til brug i både in vitro og in vivo systemer, og ideen ville være dette ville give os en bedre forståelse af mekanismerne i sygdommen og også give os mulighed for at teste nye behandlinger. Denne metode kan bruges til at formulere kontrolleret system og studere frigivelsen af eventuelle biomolekyler for mange celletyper, enten alene eller i kombination. Til at begynde skal du fjerne en nær-sammenløbet kolbe fra rugemaskinen.Behandl cellerne med 0,25% trypsin-EDTA opløsning og inkuberes ved 37 C i fem til 10 minutter for at løsne cellerne. Efter tilsætning af DMEM/F12 medium, indsamles cellerne i et 50 milliliterrør. Centrifuge cellerne ved 1000 omdr./min. i fem minutter.Fjern supernatanten, og pellet i HEPES-buffersaltline skal fjernes igen for at fordoble den endelige ønskede cellekoncentration. I et centrifugerør på 50 milliliter blandes denne cellesuspension i et forhold på 1 til 1 med 4 % vægt og volumenalginatopløsning for at opnå en endelig suspension, der indeholder den ønskede cellekoncentration i en 2%vægt- og volumenalginatopløsning. For at indstille indkapslingsparametrene skal du indstille indkapslermaskinens hastighed til den maksimale ekstruderingshastighed og derefter indstille spændingen og frekvensen.For at fremstille mikroperler, i en 20 milliliter sprøjte, indlæse fem milliliter af cellen-alginat suspension og vedhæfte en sprøjte til indkapsleren. For at starte indkapslet aktiveres strømmen, som skubber cellealginataffjedringen gennem føderen, og en strøm af dråber ekstruderes gennem dysen. Den første milliliter opsamls i affaldsnæberet for at undgå den oprindelige ikke-ensartede strøm.Fortsæt derefter med at køre de resterende fire milliliter, så dråberne falder i calciumchloridgeleringsbadet. Ved kontakt med gelering bad, alginat i dråberne straks kryds-links med calciumioner i gelering bad, danner sfæriske mikroperler. Efter et minut fjernes geleringsbægeret fra den magnetiske platform, og mikroperlerne hviles i yderligere fire minutter uden omrøring for at fuldføre deres gelering ved stuetemperatur.For at hente mikroperler, først bruge et par sterile pincet til at fjerne eventuelle store alginat snavs eller artefakter. Når du har kåret enden af en plastpipette, skal du bruge den til at overføre mikroperler fra geleringsbadet til et 74 mikrometernetfilter, der holdes over et affaldsbæger. For at sikre succes skærer vi altid enden af en plastikpipette for at undgå at beskadige mikroperlerne, og det gør vi, hver gang vi overfører perler fra et fartøj til et andet efter indkapsling.Inverter netfilteret over et centrifugerør. Pipette den passende kultur medium over det at vaske perlerne ned i røret og give dem mulighed for at ligevægt i dette medium i fem minutter. De overføres derefter til en kolbe, der tidligere er fyldt med det relevante medium til inkubation og yderligere forsøg.For at vurdere cellernes levedygtighed efter indkapsling og kultur, tilsættes opløsningsblanding for forsigtigt at forstyrre mikroperler og frigive de indkapslede celler. Inkuber cellerne i en cellekulturinkubator suppleret med 5% kuldioxid ved 37 C i 10 minutter med blid omrøring. Anslå celle levedygtighed af disse celler ved at farvning dem med trypan blå og ved hjælp af en hæmocytometer kammer.For at vurdere mikroperadstabiliteten måles gennemsnitsdiameteren for en prøve fra hver mikroperlepopulation over et tidsforløb ved hjælp af et mikroskop og billedbehandlingssoftware. Efter præparat, uniform og sfærisk alginat mikroperler blev genereret med succes ved hjælp af denne protokol. Efter en dag i standard cellekultur betingelser, indkapslet 7PA2 celler blev jævnt fordelt i mikroperler.Når 7PA2 celleprolifererende blev testet ved hjælp af en MTS-analyse, var der ingen signifikant forskel mellem adfærden af 7PA2 celler dyrket med eller uden alginat over en syv dages periode. Konditionerede medier analyseret fra 2D og 3D kulturer af 7PA2 celler afslørede en konstant stigning i amyloid-beta 1-42 niveauer i begge kulturer. Frigivelseshastigheden af amyloid-beta 1-42 fra mikroperler, eller 3D-kultur, svarer i profil til den, der frigives fra 2D-kulturen.7PA2 celler indkapslet i alginat mikroperler kan effektivt anvendes til vedvarende frigivelse af amyloid-beta. Mikroperler til engraftment i rottehjernen skal være lille nok til at blive indlejret uden at skabe en stor læsion. Implantering af en millimeterskaleret perle i hjernen til in vivo formål ville ikke fungere, mens en mikroperle fremstillet ved hjælp af denne protokol har en passende størrelse til indsættelse i hippocampus af rotten.For at sikre, at vi har en jævn fordeling af celler i det endelige produkt, er det vigtigt at blande cellerne grundigt i cellealginate suspensionen, og dette garanterer ensartet frigivelse af amyloid fra hver mikroperle.

Research

JoVE Journal

Biology

Fabrication of Amyloid-&#946;-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease

Gibberella zeae Ascospore Production and Collection for Microarray Experiments.

Fusarium graminearum Schwabe (teleomorph Gibberella zeae) is a plant pathogen causing scab disease on wheat and barley that reduces crop yield and grain ...

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Drive Fabrication

Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Drive Fabrication

Chronic recording of large populations of neurons is a valuable technique for studying the function of neuronal circuits in awake behaving rats. ...

The use of Biofeedback in Clinical Virtual Reality: The INTREPID Project

Generalized anxiety disorder (GAD) is a psychiatric disorder characterized by a constant and unspecific anxiety that interferes with daily-life ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolering af ribo Bundet Gryende polypeptider<em&gt; In vitro</em&gt; Til at identificere Translationelle Pause steder langs mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Brug SecM Arrest Sequence som et redskab til at isolere ribo bundne polypeptider

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays (MEArrays)

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays MEArrays

Fremstilling og anvendelse af mikromiljø microarrays (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, ...

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish Danio rerio Laboratory: An Introduction

Regelmæssig pleje og vedligeholdelse af en zebrafisk (<em&gt; Danio rerio</em&gt;) Laboratorium: An Introduction

This protocol describes regular care and maintenance of a zebrafish laboratory. Zebrafish are now gaining popularity in genetics, pharmacological and ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Brug af kemostater i Mikrobiel Systembiologi

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Proteolytically Degraded Alginate Hydrogels and Hydrophobic Microbioreactors for Porcine Oocyte Encapsulation

Proteolytisk nedbrudt alginathydrgels og hydrofobe mikrobioreaktorer til Porcine Oocyt Indkapsling

In reproductive biology, the biotechnology revolution that began with artificial insemination and embryo transfer technology led to the development of ...